美國進(jìn)境大豆北方莖潰瘍病菌的分離與鑒定_圖文

1、 收稿日期 : 2006-09-17美 國 進(jìn) 境 大 豆 北 方 莖 潰 瘍 病 菌 的 分 離 與 鑒 定張建成 , 顧建鋒 , 徐 瑛 , 陳先鋒(浙江寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局 315012摘要 在對美國進(jìn)境大豆檢疫過程中 , 對大豆籽粒和夾帶莖稈進(jìn)行病原真菌的分離培養(yǎng) , 使用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué) 相結(jié)合的方法對可疑菌株進(jìn)行鑒定 , 確定該菌為 Diaporthe p haseolorum (Cke. &Ell. Sacc. var. caulivora Athow&Caldwell 。 該病原菌是進(jìn)境植物檢疫潛在危險(xiǎn)性病原真菌 , 在國內(nèi)屬首次截獲 。關(guān)鍵詞 大豆北方莖潰瘍病菌 ; 鑒定

2、; 分子生物學(xué) 中圖分類號 S 41-33Isolation and identif ication of soybean Gu Xu Y ing , Chen Xianfeng(it ry I ns and Quarantine B ureau , Zhej iang 315012, China Abstract isolated f rom soybean seeds and stems imported f rom USA was identified. Both morpho 2logical and molecular characteristics showed it was Di

3、aporthe phaseolorum (Cke. &Ell. Sacc. var. caulivora Athow &Caldwell. This is the first report on this f ungus in China and it is a potential dangerous f ungus of soybean. K ey w ords Diaporthe phaseolorum var. caulivora; identification ; molecular biology 大豆北方莖潰瘍病菌 (Di a port he p haseolorumvar. ca

4、uli vora , DPC 是我國進(jìn)境植物檢疫潛在危 險(xiǎn)性真菌 1, 且被列入新修訂的進(jìn)境植物檢疫性病 蟲雜草 A1類檢疫名錄 (未公布 。最先于 20世紀(jì) 40年代后期在美國 Iowa 州發(fā)現(xiàn) , 當(dāng)時(shí)病原菌被命名為 D. p haseolorum var. bat at atis 。隨后 ,At how 和 Caldwell 將 它 改 名 為 D.p haseolorum var.cauli vora 。 20世紀(jì) 50年代 , 北方莖潰瘍病在美國中北部地區(qū)流行 , 引起產(chǎn)量損失高達(dá) 50%。目前分 布于美國北部地區(qū) 、 加拿大 、 意大利 、 巴西 、 阿根廷 、 前南斯拉夫 。 并

5、且疫區(qū)還在不斷擴(kuò)大 , 是國外大豆 生產(chǎn)上的重要病害 , 經(jīng)濟(jì)影響很大 2-3。該病菌可通過種子和病殘?bào)w遠(yuǎn)距離傳播 , 并且 抗逆性很強(qiáng) , 病殘?bào)w在 -18 -15 下可存活 14個(gè)月 。 目前 , 我國尚沒有 DPC 發(fā)生危害的報(bào)道 ,但是中國大豆生產(chǎn)從北到南在不同氣候帶都有分 布 , 其中有很多和疫區(qū)相似的氣候區(qū) , 一旦該病害傳 入我國 , 在適宜的條件下定殖 , 將對我國的大豆生產(chǎn) 產(chǎn)生嚴(yán)重影響 。2004年以來 , 寧波口岸加大了對進(jìn)境大豆下腳料的檢疫力度 , 有針對性地對間座殼屬 (Di a port he , 無性態(tài)為擬莖點(diǎn)霉屬 Pomosis 病原菌進(jìn)行檢測 。 2005年

6、6月 , 在美國進(jìn)境的大豆下腳料中截獲一病菌 , 通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對其進(jìn) 行了鑒定 , 確定其為 DPC , 初步建立了一套 DPC 的 鑒定方法 , 這是國內(nèi)首次截獲并報(bào)道該病菌 , 并于 2006年初用此方法再次檢出該病菌 。1 材料與方法1. 1 材料美國進(jìn)境大豆中夾帶的豆稈及干癟的大豆籽粒。 1. 2 分離培養(yǎng) 挑取有病斑或褐變等可疑癥狀的豆稈 , 使用 1%次氯酸鈉 (NaOCl 對其進(jìn)行表面消毒 30s , 滅菌 水漂洗 3次 , 置于鋪好 3層濕潤吸水紙的培養(yǎng)皿中 , 12h 光照 ,12h 黑暗交替 ,25 恒溫保濕培養(yǎng) ,5d后每天觀察 。 將選取的干癟的大

7、豆籽粒使用同莖稈 相同的表面消毒方法 , 在 PDA 培養(yǎng)基上 25 恒溫 培養(yǎng) ,5d 后每天觀察 。 將上述方法培養(yǎng)出的真菌菌 絲或子實(shí)體在 PDA 平板上分離純化 。401 第 33卷第 2期 (2007 PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007調(diào) 查 研 究1. 3 形態(tài)鑒定在 L EICA S8APO 解剖鏡和 ZEISS Axioskop 40顯微鏡下觀察病原菌在豆稈上形成的子囊殼、 子囊和 子囊孢子 , 使用 L EICA DFC320數(shù)碼攝像頭配合 L EI 2 CA Qwin V3軟件記錄其形態(tài)并測量大小。并對 PDA 平板上的菌落形態(tài) , 產(chǎn)

8、孢情況進(jìn)行詳細(xì)記錄。 1. 4 致病性測定使用牙簽法 4, 在苗齡 14d 的大豆幼苗下胚軸 用牙簽劃一傷口 , 取菌齡 7d 的菌落邊緣菌塊 (直徑 約 4mm 覆蓋于傷口 , 用無菌凡士林封閉傷口 , 接種 4株 , 并用 PDA 培養(yǎng)基小塊作對照 。接種后的前 72h , 在氣候箱內(nèi)保持相對濕度 90%以上 。1. 5 分子生物學(xué)鑒定1. 5. 1 總 DNA 提取采用易潤華等的方法 5。 1. 5. 2 Pomo sis/Diaport he 屬特異 PCR參照 A W ZHAN G 等方法 6, 對sis/Diaporthe I I I分 離 物 總 PhomI:5 -GA GCTC

9、GCCACT A GGG -3 , PhomII: 5 -GGCGGCCAACCAAACTCTTGT -3 。 引物由 上海博亞生物技術(shù)有限公司提供合成 。以本實(shí)驗(yàn)室 分離保存的 Phomopsis lon gicoll a 做陽性對照 , 以 重蒸水做陰性對照 。 PCR 反應(yīng)總體積 50L , 反應(yīng) 體系中各試劑的終濃度為 :1buffer 、 2. 5mmol/L MgCl 2、 0. 2mmol/L dN TP 、 引物各 50p mol ,2. 5U Taq 聚合酶 (Takara , 大連 、 模板 DNA 25ng 、 用 dd H 2O 使終體積達(dá)到 50L 。使用 GeneA

10、mp PCR System 9700PCR 儀 (AB I 公司 進(jìn)行 PCR 反應(yīng) , 反 應(yīng)過程為 96 熱變性 3min ; 然后進(jìn)行 40個(gè)循環(huán) , 每個(gè)循環(huán) 95 變性 0. 5min 、 60 退火 0. 5min 、 72 延伸 1min ; 最后 72 延伸 7min 。1. 5. 3 ITS 區(qū) PCR用真菌通用引物 ITS4和 ITS5擴(kuò)增總 DNA , 由 上海博亞生物技術(shù)有限公司合成 (ITS4:5 -TC 2 CTCC GC T TA T T GA TA T GC -3 , ITS5:5 -GGAA GTAAAA GTC GTAACAA GG -3 。反應(yīng) 體系同 P

11、homopsis 屬特異 PCR 體系 。使用 Gene 2 Amp PCR System 9700PCR 儀 (AB I 公 司 進(jìn) 行 PCR 反應(yīng) , 反應(yīng)過程為 96 熱變性 3min ; 然后進(jìn) 行 35個(gè)循環(huán) , 每個(gè)循環(huán) 94 變性 1min 、 55 退火 1min 、 72 延伸 2min ; 最后 72 延伸 7min 。 1. 5. 4 DNA 測序ITS 區(qū) PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后直接用于測序 ,DNA 測 序由上海生工生物工程科技有限公司完成 , 使用 ABI 3700測序儀 , 采用雙脫氧測序法 , 測序引物為 ITS4和 ITS5, 進(jìn)行雙向測序。 校對測序結(jié)果并拼

12、接序列。 1. 5. 5 RFL P 分析ITS 區(qū) PCR 產(chǎn) 物 使 用 限 制 性 內(nèi) 切 酶 A l u I , Rsa I , H ha I , Mse I 和 S cr FI (Takara , 大連 進(jìn)行酶 切 , 按照每種酶的說明書 , 將 1. 0L 限制性內(nèi)切酶 , 1. 5L 10buffer ,6L PCR 產(chǎn)物 ,6. 5L dd H 2O 混合 , 在每種酶的適宜酶切溫度下孵育 3h 。 PCR 酶切產(chǎn)物在 2%的瓊脂糖凝膠上電泳 , 根據(jù) Marker 判斷 DNA 片段大小 。1. 5. 6 數(shù)據(jù)分析(BL AST 搜索 , 比 。 GenBank 上選取同屬的

13、代表性菌株 , 并以 Gaeu 2 m annom yces g rami nis 做為序列分析的外群 7。利 用 ClustalX 1. 8. 1進(jìn)行序列比對 , 通過 M EGA 3. 1軟件選用 K imura 22parameter 距離模型進(jìn)行 U P G 2 MA 分析生成系統(tǒng)發(fā) 育樹 , 發(fā)育 樹用 自展 (Boot 2 st rap 分析法進(jìn)行檢驗(yàn) , 循環(huán) 1000次 。2 結(jié)果與分析2. 1 形態(tài)描述保濕培養(yǎng) 14d 后 , 肉眼可見灰褐色豆稈上生出 大量黑色的突起 (圖 1a , 為病菌的子囊殼喙 。子囊 殼后期溢出一條條白色須狀的孢子角 。子囊殼黑 色 、 球形 , 單

14、生或 212個(gè)叢生 , 直徑 (165340 m (282412 m , 埋生于豆稈表皮中 。喙表面光 滑 , 喙長 180336m , 寬 75110m , 喙寬度均 勻 , 頂 部 鈍 圓 。子 囊 (5. 65. 8 m (25. 7 27. 8 m , 長棍棒狀 , 壁薄 , 易消解 , 頂部有清晰的折 光環(huán) 。 子囊孢子 (2. 32. 5 m (8. 18. 4 m , 透明 , 紡錘形 , 雙細(xì)胞 , 分隔處略縊縮 , 常含油球 。 同時(shí) PDA 平板上培養(yǎng)的帶病種子生白色絮狀 霉層 , 挑取純培養(yǎng) 。兩種方法得到的純培養(yǎng)菌株都 性狀相似 , 在 PDA 培養(yǎng)基上 2025 下生

15、長良好 , 7d 后長滿培養(yǎng)皿 , 菌落白色 , 叢生絮狀長毛 , 后期菌 落顏色 無變 化 , 只 在 培 養(yǎng) 基 背 面 有 黃 色 素 產(chǎn) 生 。 28d 后 , 子囊殼在不發(fā)達(dá)的小子座上形成 。子囊形 狀大小與大豆莖稈 、 種子分離物相似 。未見分生孢 子器及分生孢子 。 5 01調(diào) 查 研 究 第 33卷第 2期 (2007 PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007 圖 1 大豆北方莖潰瘍病菌培養(yǎng)物形態(tài)2. 2 致病性測定兩種分離物分別接種大豆幼苗 。傷口接種 7d后可見創(chuàng)口邊緣呈褐色 , 且延伸狀擴(kuò)展 , 整株枯萎 ,4株大豆幼苗都發(fā)病死亡 , 對照

16、僅在傷口處有破損 。剪取接種點(diǎn)上下部莖稈 , 經(jīng)表面消毒后用 PDA 培養(yǎng)基分離 , 獲得純培養(yǎng) , 其菌落特征 、 子囊孢子形態(tài)大小與豆稈及帶病種子原始分離物純培養(yǎng)一致 。2. 3 分子生物學(xué)鑒定使用 Phomopsis 屬 特 異 性 引 物 Phom 和Phom 擴(kuò)增陽性對照 P. lon gicoll a 和待測菌株 ,得到 1條 300bp 左右的特異性條帶 , 如圖 2, 和報(bào)道的 337bp 條帶大小基本吻合 6。使用 5種限制性內(nèi)切酶對 ITS 區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切 , 得到酶切圖譜如圖 3。 5種限制性內(nèi)切酶有不同的酶切位點(diǎn) , 根據(jù) Marker 可以判斷出酶切片段的大小范圍

17、 。 文獻(xiàn)報(bào)道 ,DPC 的 PCR 產(chǎn)物長度 600bp左右 , 酶 RsaI 沒有酶切位點(diǎn) , 其他 4種酶切產(chǎn)物的特征片段長度分別是 :A l u I ,281bp 、 176bp ; 第 3條為 145bp 或 146bp ; H ha I ,260bp 和 226bp ; 還有一類菌株是 228bp 和 134bp ; Mse I ,484bp ; S cr FI ,254bp 和 96bp 8。 對比研究菌株的酶切圖譜 , 可以初步判定與報(bào)道的 DPC 病菌酶切結(jié)果相似 。圖 2 Phomopsis 屬特異性引物擴(kuò)增結(jié)果圖 3 大豆北方莖潰瘍病菌 PCR 2RF LP 酶切圖譜兩種

18、來源的分離物的 ITS 區(qū) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 測序比對 , 發(fā)現(xiàn)堿基序列完全相同 , 共有 601bp 。 序 列在 GenBank 上進(jìn)行 BL AST 搜索 , 經(jīng)比對分析 , 所 檢測的樣品的序列同 Zhang 等人報(bào)道的 D. p hase 2 olorum var. cauli vora 菌株 713的序列 (A F000567 完全 相 同 ; 與 其 他 兩 種 被 鑒 定 為 DPC 的 序 列 (A F000563,A F000212 都僅有 1個(gè)堿基的差異 , 相 似度也達(dá)到 99%。聚類樹說明測試菌株與其他兩 個(gè) DPC 菌株成為一組的支持率相當(dāng)高 。根據(jù)分離菌株的子囊

19、及子囊孢子的形態(tài)特征能 夠鑒定到 Diaporthe 屬 , 同時(shí)由該菌株能夠使大豆幼 苗致病 , 是大豆上的一種寄生菌 , 結(jié)合進(jìn)境大豆常見 病原真菌的特征 , 可以初步判定該菌株屬于 Dia 2 porthe phaseolorum , 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道 9, 由子囊著生特 征、 子囊孢子大小可以判斷接近于 DPC 。 分子生物學(xué) 方法 結(jié) 果 表 明 該 菌 株 屬 于 Pomosis/Diaporthe 屬。 PCR 2RFLP 分析表明與 DPC 酶切圖譜非常相似。 ITS 保守區(qū)的基因分析表明此種真菌在序列上與 DPC 的 一個(gè)菌株完全相同 , 與 Pomosis 屬其他種的遺傳距離

20、較遠(yuǎn) , 所以可以判定此種真菌是 DPC 的一個(gè)菌株。 6 1 第 33卷第 2期 (2007PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007調(diào) 查 研 究 Template. 本次研究的菌株 ; 其余序列左邊是 GenBank 中的登記號 , 右面對應(yīng)其種類圖 4 基于 ITS rDNA 序列經(jīng) UPG MA 檢測的系統(tǒng)發(fā)育樹 (分支上的數(shù)字代表 1000次自舉檢測支持率 3 討論大豆北方莖潰瘍病病原菌屬于子囊菌門、 球殼目、間座殼科、 間座殼屬 , 無性階段為擬莖點(diǎn)霉屬。 在美國、阿根廷等國大豆生產(chǎn)上 , 能與大豆莖莢枯腐病菌 (黑點(diǎn)病菌 (D. phaseolor

21、um var. soj莖點(diǎn)種腐病菌 (病菌 (D. (DPM 共同引起間座殼 -Diaporthe 2Phomopsis com 2plex , 危害超過其中任何單一真菌病害 9。 除 DPS 外的其余 3種病菌在我國未見報(bào)道。近年來 , 從美國 、 巴西 、 阿根廷等國進(jìn)境的大豆逐年增加 ,2005年海關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)達(dá)到 2659萬 t 。 本試驗(yàn)證明不但大豆籽粒能夠攜帶病菌 , 大豆莖稈等大豆下腳料也可以成為帶菌載體 。而所有進(jìn)境大豆中都攜帶著大量豆稈 、 豆莢 、 土塊 、 各類雜草籽等雜質(zhì) 。 如果對進(jìn)境大豆的檢測能力不足 , 對大豆加工廠的監(jiān)管不嚴(yán) , 很可能造成各類危險(xiǎn)性有害生物的擴(kuò)散

22、和危害 。 因此 , 必須加強(qiáng)對大豆危險(xiǎn)性有害生物檢測和鑒定方法的研究 , 盡快在各口岸推廣 。另外還要進(jìn)一步加強(qiáng)對各大豆加工廠的檢疫監(jiān)管 , 對下腳料進(jìn)行無害化處理 , 嚴(yán)防有害病菌入侵 。筆者曾于 2004年 3月從美國大豆稈中檢出 P.longicolla, 由于該病菌未發(fā)現(xiàn)有性階段 , 分生孢子器表面較粗糙 , 莖稈保濕培養(yǎng)分生孢子產(chǎn)生時(shí)期較早 ,較容易與其他 3種病菌區(qū)分。 DPS 的子囊和子囊孢子明顯較大 , 也較容易區(qū)分。 DPC 與 DPM 很接近 , 子囊和子囊孢子差異不大。 有報(bào)道稱 DPM 子囊殼散生 , 喙寬 100m 左右 , 菌落老熟后呈褐色 ; 而 DPC 子囊殼

23、叢生 , 喙寬 60m 左右 , 菌落老熟后仍呈白色 9。但在實(shí)際鑒定過程中 , 大豆莖稈上的 DPC 也有密集和散生的情況 , 喙的長寬也因不同菌株而有差異 , 子囊、 子囊孢子的大小也有不同。 近年來 , 利用病原菌核糖體 ITS (internal transcribed 區(qū)域進(jìn)行病害診斷 區(qū)具有相對保守 性 , , 可以通過 PCR, 隨著 DNA 測序技術(shù)的不斷成熟 , , 而時(shí)間在不斷縮短。 病 原真菌通過在 G enbank 比對基因保守區(qū)測序結(jié)果 , 結(jié) 合形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果和致病性鑒定結(jié)果 , 鑒定到菌株所 屬種的方法已經(jīng)趨向成熟。通過大豆病原真菌的更多檢出與標(biāo)準(zhǔn)菌株的積 累 ,

24、 可以在 ITS 區(qū)序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異性引物 , 直接 從大豆種子和豆稈上檢測區(qū)分大豆上的各種檢疫性 病原物 , 以滿足口岸檢測準(zhǔn)確 、 快速的要求 。參考文獻(xiàn)1 吳品姍 , 嚴(yán) 進(jìn) . 值得關(guān)注的大豆新病害 J.植物檢疫 ,2003, 17(4 :226-228.2 BACKMAN P A , WEAV ER D B , MOR GAN 2J ON ES G. Soy 2 bean stem canker :anemerging disease problemJ.Plant Dis 2 ease ,1985,69(8 :641-647.3 PIOL I R N , MORANDI E N ,

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28、4:494-504. 7 0 1調(diào) 查 研 究 第 33卷第 2期 (2007PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007 8 ZHAN G A W ,RICCIONI L ,PEDERSEN W L ,et al. Molecu 2lar identification and phylogenetic grouping ofDiaport hephaseolorum and Phomopsis longicolla isolates from soybeanJ.Phytopat hology ,1998,88:1306-1314.9 HARTMAN G L , S

29、INCLAIR J B , RUPE J C. Compendium ofS oybean Disease (4th Edition M.Minnesota :APSPress ,1999.收稿日期 : 2006-08-083致 謝 : 本文昆蟲學(xué)名由浙江大學(xué)徐志宏教授鑒定 。雙 斑 錦 天 牛 的 生 物 學(xué) 特 性 及 防 治3余黎紅 , 陳國利 , 劉國軍(浙江省常山縣林業(yè)局 324200摘要 雙斑錦天牛 A calole pta subl usca (Thomson 在常山縣危害大葉黃楊 ,1年發(fā)生 1代 , 以老熟幼蟲在受害植株 蛀道中越冬 ,4月上旬至 6月中旬化蛹 ,5月上旬至

30、7月上旬成蟲羽化 ,5,5月中旬幼蟲孵 化 ,11月幼蟲停止取食進(jìn)入越冬 。 根據(jù)其生活習(xí)性提出了綜合防治措施 , 關(guān)鍵詞 雙斑錦天牛 ; 生物學(xué)特性 ; 防治措施 中圖分類號 S 433. 5pt a subl uscaYu , Chen Guoli , Liu Guojun(Forest ry B ureau of Zhej iang Province , 324200, China Abstract Only one generation of Acalolepta sublusca (Thomson occurred in a year in Changshan , Zhejiang

31、Province , and it overwintered as old larvae in the tunnels of the trunks. The overwintering larvae pupated from early April to mid 2J une. The adults emerged from early May to early J uly. The females began to lay eggs in early May. The larvae appeared in mid 2May. Integrated control measures were taken ag