肺缺血再灌注損傷時一氧化碳的變化及葛根素對其影響

1、肺缺血再灌注損傷時一氧化碳的變化及葛根素對其影響         【摘要】  目的:觀察兔肺缺血再灌注損傷時一氧化碳的變化及葛根素對其的影響。方法:30只健康日本大耳白兔隨機分成假手術對照組（C組）、肺缺血再灌注組（IR組）和葛根素組（Pur組）。復制兔單側肺缺血再灌注損傷模型，各組在缺血前、缺血1 h、再灌注1 h、3 h和5 h分別抽血，檢測一氧化碳血紅蛋白(COHb)濃度、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)含量。實驗結束時取肺組織檢測cGMP含量，電鏡觀察肺組織超微結構的改變。結果:血漿COHb濃度、cGMP

2、含量和肺組織cGMP 含量IR組、Pur組明顯高于C組，以Pur組為著（P0.01）。電鏡顯示IR組有明顯的肺超微結構損傷，而Pur組損傷較輕。結論:葛根素可通過提高內(nèi)源性CO水平，對缺血再灌注損傷肺組織發(fā)揮保護作用。 【關鍵詞】  肺 缺血再灌注損傷 一氧化碳 環(huán)磷酸鳥苷 葛根素   Abstract:  Objective:To study variations of carbon monoxide in lung ischemia-reperfusion injury and effects of puerarin. Methods:The uni

3、lateral lung ischemia-reperfusion model was replicated in vivo. Rabbits were randomly divided into three groups (n=10 in each), control (C) group, ischemia-reperfusion (IR) group and puerarin (Pur) group. The blood specimens gathered before ischemia, ischemia 1 h, reperfusion 1 h, 3 h and 5 h were t

4、ested for the content of carboxyhemoglobin (COHb), cyclic guanosine monophosphate(cGMP). The lung tissues sampled at 5 hours after reperfusion were assayed for the content of cGMP, the ultrastructural changes were observed under electron microscope. Results:The plasma content of COHb, the content of

5、 cGMP of plasma and lung tissue in IR and Pur group were much higher than that in C group, and the index in Pur group increased more significantly（P 0.01）. Severe ultrastructural morphological damage in IR group was observed under eletron microscope, but lightly injury was found in Pur group. Conclu

6、sion:Puerarin provides significant protective effects on lung during ischemia-reperfusion injury through increasing the plasma content of COHb.   Key words:   lung; reperfusion injury; carbon monoxide; cyclic guanosine monophosphate; puerarin   肺缺血再灌注損傷（Lung ischemia re

7、perfusion injury，LIRI）是肺溶栓及肺移植影響預后的一個重要因素，因為LIRI約20%的肺移植患者會出現(xiàn)致死性的移植物功能不全，也是術后一年15%的死亡率的主要原因之一，故對LIRI進行干預、減輕損傷是當前國內(nèi)外的研究熱點。一氧化碳（CO）是具有舒張血管、抗血小板聚集、抑制血管平滑肌細胞增生和血管內(nèi)皮細胞凋亡等作用的細胞信使分子1。本實驗通過觀察LIRI時CO水平的變化及葛根素對它的影響，以探討CO在LIRI中的作用及葛根素防治LIRI的機制。   1  材料和方法   1.1 材料  健康日本大耳白兔30只，雌雄不

8、拘，體重1.72.7 kg，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供。葛根素注射液（2 ml/100 mg，批號：228901），為浙江康恩貝制藥有限公司生產(chǎn)；125I-cGMP放免藥盒由上海中醫(yī)藥大學同位素室提供；其余均為市售分析純試劑。   1.2  模型復制及分組  參照Sekido法復制在體兔LIRI模型，即20%氨基甲酸乙酯（5 ml/kg）靜脈注射麻醉，頸靜脈插管滴注生理鹽水（0.51.5 ml/min），頸總動脈插管以備抽血；氣管切開接動物呼吸機，吸純氧，呼吸頻率為2030次/min，潮氣量為10 ml/kg；沿左胸骨切斷第3、第4、第5肋骨，游離左肺

9、門后留置阻斷帶，在肺呼氣后于左肺門處用阻斷帶結扎肺動脈、肺靜脈及左主支氣管，此之為左肺缺血，開放恢復供血及通氣為左肺再灌注。30只家兔隨機分為三組，每組10只：假手術對照（control，C）組,僅左肺門過阻斷帶，不阻斷肺門，其余操作同缺血再灌注組。缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）組，左肺門過阻斷帶后（缺血前，T0）抽血，然后阻斷左肺門1 h（缺血1h，T1）抽血，隨即松開阻斷帶再灌注5 h，分別于再灌注1 h（T2）、3 h（T3）、5 h（T4）抽血，再灌注末取左肺組織標本。缺血再灌注葛根素（IR+puerarin，Pur）組，缺血前5 min靜脈給予葛根素（3

10、0 mg/kg），其余操作同IR組。   1.3  血液指標檢測  血漿COHb含量，采用樂宏元等報告的方法測定。血漿cGMP含量，采用放射免疫法測定。   1.4  肺組織cGMP含量檢測  實驗畢，取左肺組織50 mg左右，制成勻漿，以3500 r/min離心15 min，取上清液于60 水浴中吹干，殘渣放于4 保存待檢。采用放射免疫法測定cGMP含量。   1.5  肺組織超微結構觀察  取左肺門旁1 mm×1 mm×1 mm大小的組織23塊，以2.

11、5%戊二醛前固定，以1%鋨酸后固定，常規(guī)脫水，包埋，超薄切片，常規(guī)染色，H-600型透射電鏡觀察。   1.6  統(tǒng)計學處理方法  采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnets T3檢驗。            2  結果   2.1  血漿COHb水平的變化  C組COHb含量各時點變化無統(tǒng)計學意義；IR組COHb含量隨著缺血和再灌注時間的

12、延長而逐漸升高，與C組相比差異非常明顯(P0.01)；Pur組這種升高趨勢更加明顯，缺血和再灌注各時點值均明顯高于C組和IR組(P0.01)（見表1）。   2.2  血漿cGMP含量的變化  C組各時點cGMP含量無明顯變化；IR組cGMP含量隨時間延長逐漸升高，與C組相比差異有顯著性(P0.01)；Pur組缺血和再灌注各時點cGMP含量明顯高于C組和IR組 (P0.01)（見表2）。   2.3  肺組織cGMP含量  與C組相比，IR組、Pur組肺組織cGMP含量明顯升高(P0.01)，而且 Pur組cGMP

13、含量明顯高于IR組(P0.01)（見圖1）。   2.4  肺組織超微結構改變  C組毛細血管內(nèi)皮細胞結構正常，連接緊密，基底膜完整（見圖2）；型肺泡上皮細胞正常；型肺泡上皮細胞結構完整，線粒體嵴清楚，板層小體未見改變，微絨毛無減少。IR組毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹，基底膜有斷裂、不完整，線粒體腫脹，核染色質(zhì)邊集、核膜皺縮，基底部與彈力板分離形成拱橋樣改變（見圖3）；型肺泡上皮細胞吞飲小泡較少；型肺泡上皮細胞微絨毛脫落明顯，核固縮，胞漿濃縮，胞漿內(nèi)板層小體數(shù)量減少、排空增多；肺泡隔水腫，肺泡隔及毛細血管內(nèi)炎癥細胞附壁增多，以中性粒細胞為主。Pur組毛細血管內(nèi)皮

14、細胞輕度腫脹，線粒體輕度空泡化，核固縮現(xiàn)象不明顯，染色質(zhì)分布較均勻（見圖4）；型肺泡上皮細胞吞飲小泡較多；型肺泡上皮細胞表面微絨毛輕度減少，個別板層小體稍有脹大；肺泡隔輕度水腫。   3  討論   CO作為一種重要的氣體信使分子，參與體內(nèi)許多病理、生理過程。血紅素在血紅素加氧酶（HO）催化下分解生成內(nèi)源性CO，一部分以原型經(jīng)肺排出體外，另一部分則以COHb的形式存在，因此，可以通過測定呼出氣中CO濃度或血中COHb濃度來反映機體內(nèi)CO水平，本研究采用樂宏元的方法檢測COHb濃度是以此為依據(jù)的。內(nèi)源性CO以自分泌或旁分泌方式與自身或臨近細胞胞漿

15、中sGC血紅素基因中的Fe2+結合，使其構象發(fā)生改變而激活，從而催化GTP生成cGMP，cGMP激活cGMP依賴的蛋白激酶或磷酸二酯酶，或通過調(diào)節(jié)離子通道發(fā)揮生物學效應。本實驗結果顯示，IR組血漿COHb含量隨著缺血和再灌注時間的延長而逐漸升高，與C組相同時點比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)，血漿及肺組織血漿cGMP含量也明顯升高，提示LIRI可引起內(nèi)源性CO增多，通過激活sGC引起cGMP升高，與文獻報道一致。   目前，關于CO對缺血再灌注組織保護作用的機制尚未完全闡明，可能與以下幾個環(huán)節(jié)有關：抗氧化作用。有學者證實，低濃度CO有助于細胞拮抗氧化應激，使動物接受低劑量

16、CO可大大提高動物對高氧性肺損傷的耐受性10。改善微循環(huán)。內(nèi)源性CO具有舒張血管、抑制血小板聚集，降低血液黏滯度，減少微循環(huán)血栓形成等作用1,5?？辜毎蛲?。Zhang等11發(fā)現(xiàn)CO抑制Fas/Fas L的表達，進而抑制Caspase3、8、9的激活及線粒體細胞色素C的釋放，增加抗凋亡基因Bcl-XL、Bcl-2的表達。抗炎癥作用。Otterbein等12報道，低濃度CO能在體內(nèi)、外選擇性地下調(diào)致炎細胞因子TNF-、IL-1、MIP-1的表達，同時上調(diào)抗炎細胞因子IL-10的表達?！緟⒖嘉墨I】  1 Wu LY, Wang R. Carbon Monoxide: endogenous

17、 production, physiological functions, and pharmacological applications J. Pharmacol Rev, 2005, 57(): 585-630. Sekido N, Mukaida A, Harada A, et al. Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against in interleukin8J. Nature, 1993, 365(6447):654-657.樂宏元, 宋小興, 劉和平. 一氧化碳血

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