紫菀的毒性部位及對(duì)小鼠的急性肝損傷作用研究

1、紫菀的毒性部位及對(duì)小鼠的急性肝損傷作用研究(1)                       作者：王蕾，張勉，金晶，黃芳，張朝鳳【摘要】  目的分離富集紫菀的毒性成分，研究毒性部位的肝臟急性毒性。方法采用柱層析色譜法分離，以小鼠急性毒性為指標(biāo)，篩選出紫菀的毒性部位，并測(cè)定了LD50。小鼠急性肝臟毒性研究方法主要采用的是血清生化指標(biāo)(ALT，AST，TBIL)檢測(cè)和肝

2、組織病理切片檢查。結(jié)果經(jīng)硅膠柱層析分離富集，得到紫菀的毒性部位Fr2，其LD50為0.052 g/kg。與對(duì)照組比較，單次給藥后，LD0劑量組小鼠血清ALT、AST均有顯著升高，TBIL沒(méi)有顯著差異。組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，紫菀毒性部位LD0劑量可引起小鼠肝臟輕度細(xì)胞水腫，可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死、肝小葉及匯管區(qū)見(jiàn)有炎細(xì)胞浸潤(rùn);LD100劑量下可引起小鼠肝細(xì)胞呈不同程度脂肪變性、細(xì)胞水腫，可見(jiàn)肝細(xì)胞壞死、肝小葉及匯管區(qū)均見(jiàn)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論紫菀毒性部位的LD50為0.052 g/kg，單次給藥小劑量對(duì)小鼠肝臟有輕微損傷，大劑量可引起小鼠較為嚴(yán)重的急性肝損傷并致死。 【關(guān)鍵詞】  紫菀;毒性

3、部位;LD50;急性肝損傷Abstract：ObjectiveThe ethyl acetate (EtOAc) part of 90% ethanol extract of Radix Asteris (RA) showed strong toxic effect (LD50 0.19 g/kg) to mice in our previous investigation. This paper aimed to obtain a refined toxic part from the EtOAc part, and to investigate the acute hepatotoxici

4、ty of this toxic part to mice.MethodsThe toxic part was searched by comparing the toxicity of the combined fractions through the gel silica column chromatography using the death of mice as index. LD50 of the toxic part was determined. The acute hepatotoxicity of the toxic part to mice was measured b

5、y biochemical indicators (ALT, AST and TBIL) in serum and histological examination of liver.ResultsFr2 fraction obtained from the EtOAc part was confirmed as the toxic part and its LD50 was 0.052 g / kg. The acute hepatotoxic test of the toxic part in a lower dose (LD0) showed that ALT, AST were sig

6、nificantly increased but TBIL had no obvious changes as compared to control group. Histological examination showed that a lower dose (LD0) of Fr2 could induce slight edema and spotty necrosis of liver cell, as well as phlogocyte infiltration; and a higher dose (LD100) could induce serious liver inju

7、ry in mice.ConclusionThe value of LD50 (0.052g/kg) indicate that Fr2 is the refined toxic fraction of RA. The results of biochemical indicator test and histological examination confirmed the acute hepatotoxicity of Fr2 which induced more serious liver injury to mice given a higher dose than given a

8、lower dose.Key words：Radix Asteris;Toxic part;LD50;Acute liver injury紫菀(Radix Asteris)為菊科植物紫菀Aster tataricus L. f.的干燥根及根莖，辛、苦、溫，具有潤(rùn)肺下氣、消痰止咳的功效，用于痰多喘咳，新久咳嗽，勞嗽咳血1。歷代本草及現(xiàn)代中醫(yī)藥專著均沿襲了其無(wú)毒的說(shuō)法。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，紫菀水煎液灌胃給予小鼠有一定的急性毒性和肝臟毒性2;進(jìn)一步的研究表明，紫菀以90%乙醇提取毒性最強(qiáng)，通過(guò)毒性部位的追蹤，發(fā)現(xiàn)其醋酸乙酯部位為紫菀的粗毒性部位(LD50為0.19 g/kg) 3。本實(shí)驗(yàn)在前期工

9、作的基礎(chǔ)上，仍以小鼠急毒為篩選指標(biāo)，對(duì)醋酸乙酯部位進(jìn)一步細(xì)分，得到毒性成分更集中的部位，并首次研究其對(duì)小鼠的肝臟毒性。1材料與儀器1.1動(dòng)物昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量1822 g，由南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2藥物及試劑紫菀購(gòu)自河北省安國(guó)市藥材市場(chǎng)，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)生藥學(xué)研究室張勉教授鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)藥科大學(xué)生藥學(xué)研究室。提取溶劑為市售90%工業(yè)酒精;石油醚、醋酸乙酯、甲醇、氯仿均為市售分析純;薄層色譜硅膠及柱色譜硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒(ALT)，批號(hào)：20091112，谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定試劑盒(AST)，批號(hào)：20091112，血清總膽紅素測(cè)定試劑盒(TBIL)

10、，批號(hào)：20091112，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。1.3儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi實(shí)驗(yàn)儀器公司產(chǎn)品，型號(hào)：R-2000;數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品，型號(hào)：HH-4;電子天平，型號(hào)：PL303，Matter - Toledo Group;醫(yī)用數(shù)控超聲儀，型號(hào)：KQ - 250DE，昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品。高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)：TLG-16，湘儀集團(tuán);1500酶標(biāo)儀，Thermo Electrom 公司產(chǎn)品。2方法2.1紫菀各部位的制備方法紫菀藥材粉碎成粗粉，分別用10，8，8倍量90%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味的稠膏狀，加水混懸，依次用

11、石油醚和醋酸乙酯萃取，得到紫菀醋酸乙酯部位。取醋酸乙酯部位浸膏，采用硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫，各流分根據(jù)薄層色譜結(jié)果合并，得到A-1、A-2、A-3三個(gè)部分，各部分均以1 g/kg(浸膏量)給藥，給藥體積0.2 ml/10g，進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。取A-2部位浸膏，采用硅膠柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫，收集各極性段的流分根據(jù)薄層色譜結(jié)果合并，得到Fr1、Fr2、Fr3三個(gè)部分。各部分均以0.4 g/kg(浸膏量)給藥，給藥體積0.2 ml/10g，進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。2.2急性毒性實(shí)驗(yàn)方法健康昆明種雄性小鼠，隨機(jī)分組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，不禁水，灌胃給予相應(yīng)的藥物，一次給藥;空白組給

12、以相同體積的0.5% CMC-Na。給藥0.5 h后開(kāi)始觀察小鼠的中毒體征。連續(xù)7 d觀察小鼠死亡情況，隨時(shí)取出死亡小鼠，記錄死亡時(shí)間。2.4紫菀毒性部位急性肝損傷實(shí)驗(yàn)健康昆明種雄性小鼠，隨機(jī)分組，每組10只。灌胃給予LD0劑量的紫菀毒性部位，給藥體積0.2 ml/10g，空白組給予相同體積的0.5% CMC-Na溶液。給藥后禁食12 h，不禁水，摘眼球取血，3 500 r/min離心10 min，取血清備用，解剖取肝臟，10%福爾馬林溶液固定，HE染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。按照試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)換酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和總膽紅素(TBIL)的含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)

13、，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。健康昆明種雄性小鼠，隨機(jī)分組，每組10只。灌胃給予LD100劑量的紫菀毒性部位，給藥體積0.2 ml/10 g，空白組給予相同體積的0.5% CMC-Na溶液。給藥組待小鼠死亡后解剖取肝臟，10%福爾馬林溶液固定，HE染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。組織病理學(xué)檢查判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)病變程度，記為“-”“+”“+”“+”?！?”表示無(wú)明顯病變;“+”表示肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞水腫或肝細(xì)胞脂肪變性的細(xì)胞約占25%，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，肝小葉內(nèi)或匯管區(qū)少量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞增生;“+”表示肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞水腫或肝細(xì)胞脂肪變性的細(xì)胞約占50%，細(xì)胞碎片狀壞死，小葉內(nèi)或匯管區(qū)中等量的

14、炎細(xì)胞浸潤(rùn);“+”表示肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞水腫或肝細(xì)胞脂肪變性的細(xì)胞數(shù)約占75%或以上，橋接狀壞死或大片壞死，肝小葉內(nèi)或匯管區(qū)大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)或淋巴濾泡形成。本篇論文由網(wǎng)友投稿，讀書人只給大家提供一個(gè)交流平臺(tái)，請(qǐng)大家參考，如有版權(quán)問(wèn)題請(qǐng)聯(lián)系我們盡快處理。3結(jié)果3.1紫菀毒性部位的篩選小鼠經(jīng)灌胃給藥后，A-2組小鼠活動(dòng)明顯減少，精神萎靡，被毛蓬松潮濕，雙目緊閉，尾巴、爪子呈現(xiàn)烏青色，不自主顫抖等現(xiàn)象，呼吸先快后慢，直至呼吸停止。給藥后36 h為死亡高峰期，死亡現(xiàn)象均發(fā)生在24 h內(nèi)。尸體解剖后，肉眼觀察肝顯黃色或白色斑點(diǎn)，表現(xiàn)為明顯的肝中毒;其他組小鼠反應(yīng)正常。急毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，A-2組小鼠給

15、藥后全部死亡，其他組未出現(xiàn)死亡，確定A-2有毒性。A-2細(xì)分的3組灌胃給藥后，F(xiàn)r2組小鼠體征表現(xiàn)同A-2組，急毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，F(xiàn)r2給藥小鼠全部死亡，其他組未出現(xiàn)死亡，故確定Fr2部位為紫菀的毒性部位。表1A-1、A-2、A-3給藥小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2紫菀毒性部位小鼠LD50的測(cè)定實(shí)驗(yàn)紫菀毒性部位不同劑量灌胃給藥后，小鼠死亡分布情況見(jiàn)表3，經(jīng)計(jì)算得紫菀毒性部位LD50=0.052 g/kg，95%可信限為0.0390.069 g/kg。3.3紫菀毒性部位對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響LD0劑量給藥后，小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果(表4)顯示，與對(duì)照組相比，毒性部位Fr2組小鼠血清中ALT

16、、AST值升高，TBIL沒(méi)有顯著性差異。表2Fr1、Fr2、Fr3給藥小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3紫菀毒性部位不同劑量給藥后小鼠死亡分布情況表4LD0劑量紫菀毒性部位對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響3.4紫菀毒性部位對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)影響LD0劑量單次給藥，小鼠處死后解剖，肉眼觀察肝臟呈鮮紅色，質(zhì)柔軟，與空白組無(wú)明顯差別;LD100劑量給藥后，約3 h小鼠開(kāi)始死亡，小鼠死亡后立刻取出尸體解剖，肉眼觀察肝臟表面有黃色或白色斑點(diǎn)，肝臟顏色較空白組淺。組織病理學(xué)結(jié)果(圖1)顯示，與空白組(a)比較，LD0劑量組(b)小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)尚清楚，部分肝索排列紊亂，肝細(xì)胞呈輕度細(xì)胞水腫(+);可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死(+)、肝

17、小葉及匯管區(qū)見(jiàn)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)(+)，纖維結(jié)締組織增生不明顯;LD100劑量組(c)小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞呈不同程度脂肪變性、細(xì)胞水腫(+);可見(jiàn)肝細(xì)胞壞死(+)、肝小葉及匯管區(qū)均見(jiàn)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)(+)。纖維結(jié)締組織增生不明顯。a-空白組b-LD0劑量組c-LD100劑量組圖1紫菀毒性部位對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)的影響4討論紫菀始見(jiàn)于神農(nóng)本草經(jīng)，歷代本草專著記載很多，但均未對(duì)其毒性有記載。神農(nóng)本草經(jīng)將其列為中品，僅記載其“味苦溫”，本草經(jīng)集注本草綱目等均有明確記載，曰“無(wú)毒”，僅本草經(jīng)疏中提到“不宜專用及多用”。后世多接受典籍的記載，而認(rèn)為紫菀無(wú)毒。文獻(xiàn)報(bào)道4，紫菀中所含的皂苷類成分由于

18、具有溶血作用，粗制劑不宜注射用。本課題組的研究表明紫菀的水提物和醇提物均有毒性，且隨著醇濃度升高毒性增強(qiáng)。本文以急性毒性為指標(biāo)，對(duì)粗毒性部位即醋酸乙酯部位進(jìn)行了進(jìn)一步的追蹤，得到了更為精制的毒性部位。紫菀所含主要化學(xué)成分為萜類及其皂苷、肽類、香豆素、蒽醌及黃酮類、有機(jī)酸及酚類等5，哪一類或哪幾類化合物是毒性成分，以及是否與其有效部位及有效成分相同，還需深入研究。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，紫菀毒性部位的LD50為0.052 g/kg，可見(jiàn)其毒性不容忽視。紫菀毒性部位采用小鼠單次灌胃給藥，LD0劑量下可引起小鼠血清中ALT和AST升高，TBIL值沒(méi)有差異性變化，推斷低劑量下紫菀毒性部位可引起輕度肝損傷，但可能與膽汁淤積無(wú)關(guān)。組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，LD0劑量下小鼠肝細(xì)胞呈輕度細(xì)胞水腫，可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，肝小葉及匯管區(qū)見(jiàn)有炎細(xì)胞浸潤(rùn);LD100劑量下小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞呈不同程度脂肪變性、細(xì)胞水腫，可見(jiàn)肝細(xì)胞壞死、肝小葉及匯管區(qū)均見(jiàn)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。說(shuō)明單次給藥后，LD0劑量下可引起小鼠肝臟輕微損傷，與生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果一致，LD100劑量下可引起顯著的急性肝損傷，并導(dǎo)致死亡。但其小劑量是否有毒性蓄積作用以及肝損傷機(jī)