姜黃素對Ⅱ型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白BiP與p--eIF2α表達(dá)的影響

1、.溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文姜黃素對型糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白 BiP與p-eIF2tt的影響 碩士研究生：吳艷導(dǎo)師：曹紅中文摘要目的觀察腹腔注射100mgkgd姜黃素對II型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(DNP) 大鼠機(jī)械痛敏(MWT)、熱痛敏(TWL)的影響及脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)蛋白BiP和p-eIF20t表達(dá)的影響，探討姜黃素影響其 表達(dá)機(jī)制。方法雄性SD大鼠90只，體重1601809，高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周誘導(dǎo)胰島 素抵抗后，繼以單次小劑量鏈脲佐菌素(STZ)35mgkg腹腔注射，3d后血糖 167mmoll者入選為D組(81只)，在注射STZ前和14

2、d后采用Electronic Von Fery 觸覺測痛儀和甩尾足底測試儀測大鼠MWT、TWL，且將D組隨機(jī)分為3組 (n=27)：II型糖尿病神經(jīng)病理性痛組(DNP組)：繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)，不作任何處理；II型糖尿病神經(jīng)病理性痛+姜黃素100mgkgd組(DCur組)： 高脂高糖飼料喂養(yǎng)，注射STZl4d后開始腹腔注射姜黃素100mgkgd，持續(xù)14d；型糖尿病神經(jīng)病理性痛+溶劑對照組(DSC組)：高脂高糖飼料喂養(yǎng)，注射 STZl4d后開始腹腔注射玉米油4mlkg，持續(xù)14d；另取27只大鼠為正常對照組 (N組)，給予普通飼料喂養(yǎng)，不作任何處理。所有組別在給姜黃素3、7、14d 后測血糖、

3、MWT與TWL，并在同時(shí)間點(diǎn)取大鼠L46脊髓和DRG，各時(shí)間點(diǎn)均 9只。用免疫組織化學(xué)法測定BiP和PeIF2ct在大鼠脊髓背角和DRG的動(dòng)態(tài)變化， 用Western blot法測定大鼠脊髓背角和DRG中BiP、p-eIF2ct蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1大鼠體重、血糖、胰島素濃度及胰島素敏感指數(shù)的變化：與N組 比較，飼養(yǎng)8周后D組大鼠體重明顯增高(N組41320士17009，D組4*;溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文46108：1：29039)(P<O05)，血糖水平也較N組增高但未達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)(N 組634士046 mmol1，D組653+036 mmol1)，空腹胰島素濃度也明顯升高(N 組3

4、93+0549ML，D組4。50-a：0。299ML)(氏005)，胰島素敏感指數(shù)明顯下降 (N組27+035，D組378+05 1)(P<005)：2痛閾的變化：注射STZ前各組MWT(N組40574-3379，D組4110士5039)、 TWL(N組12674-243s，D組12834-152s)基礎(chǔ)值無差別；與N組相比，注射STZl4d后各組大鼠MWT降低、T、禮縮短(氏005)；與DNP組相比，給姜黃素7d后DCur組大鼠MWT升高、TWL延長，在給姜黃素14d后達(dá)到明顯變化 (氏O05)；DSC組與DNP組比較，給姜黃素后各時(shí)間點(diǎn)MWT、TWL無明顯 變化：3脊髓背角和DRG中

5、BiP表達(dá)：(1)免疫組化結(jié)果顯示：N組大鼠脊髓背 角及DRG僅有少量BiP的陽性細(xì)胞表達(dá)；與N組相比，DNP組、DCur組、DSC組BiP、p-elF2a表達(dá)顯著增多(氏005)；給姜黃素7d后，DCur組表達(dá)量開始降低，BiP的陽性細(xì)胞率脊髓背角與DRG分別為1500-&224、1416+197， 給姜黃素14d后，DCur組BiP的表達(dá)與DNP組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<005)； 各時(shí)間點(diǎn)DSC組的表達(dá)與DNP組相比無差別。(2)免疫印跡法顯示：N組大鼠 脊髓背角和DRG中都僅有少量BiP蛋白表達(dá)；DNP組、DCur組、DSC組脊髓 和DRG中BiP蛋白表達(dá)均較N組水平高

6、(火O05)；與DNP組相比，DCur組 在給姜黃素7d后表達(dá)開始降低(尸<O05)，并呈下降趨勢；各時(shí)間點(diǎn)DSC組蛋 白表達(dá)與DNP組基本一致，兩組差異無明顯差異。4脊髓和DRG中p-elF2a表達(dá)：(1)免疫組化結(jié)果顯示：N組大鼠脊髓背 角及DRG僅有少量p-elF2a的陽性細(xì)胞表達(dá)；與N組相比，DNP組、DCur組、 DSC組BiP、p-elF2a表達(dá)顯著增多(P<O05)；給姜黃素7d后，DCur組表達(dá)量 開始降低，PelF2a的陽性細(xì)胞率脊髓背角與DRG分別為874+109、 796+055；給姜黃素1 4d后，DCur組p-elF2a的表達(dá)與DNP組相比差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意

7、義(P<005)：各時(shí)間點(diǎn)DSC組的表達(dá)與DNP組相比無差別。(2)免疫 印跡法顯示：N組大鼠脊髓背角和DRG中都僅有少量P。elF2a蛋白表達(dá)；DNP 組、DCur組、DSC組脊髓和DRG中p-elF2a蛋白表達(dá)均較N組水平高(P<005)；與DNP組相比，DCur組在給姜黃素7d后表達(dá)開始降低(P<O05)，給姜黃素溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文14d后，DCur組p-elF2a蛋白表達(dá)繼續(xù)下降，與DNP組(P<005)相比差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各時(shí)間點(diǎn)DSC組蛋白表達(dá)與DNP組基本一致，兩組差異無明顯差 異。結(jié)論II型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠較正常大鼠其痛閾明顯降低，脊髓背

8、 角和DRG中ERS相關(guān)蛋白BiP、p-elF2a表達(dá)增加；腹腔注射姜黃素100mgkgd能有效緩解II型DNP誘發(fā)的機(jī)械痛敏和熱痛敏，其機(jī)制可能與姜黃素抑制脊髓背角和DRG的BiP、p-eIF2a表達(dá)有關(guān)。 關(guān)健詞糖尿病，神經(jīng)病理性疼痛，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，大鼠The effects of curcumin on the expression of endoplasmic reticulum stress proteins BiP and p-elF2a in type II diabetic neuropathic pain ratsPostgraduate：Wu YanTutor

9、：Cao Hong【Abstract】Objective To investigate the effects of curcumin on mechanical withdrawal threshold(MWT)，thermal withdrawal latency(TWL)and the expressions of endoplasmic reticulum stressrelated proteinsBiP and p-eIF2a in spinal dorsal hom and dorsal root ganglion in type II diabetic neuropathic

10、pain rats·Methods 90 male SpragueDawley(SD)rats，weight 1 60-1 809，were fed on ahighfat and fructose diet for 8 weeks to induce insulin resistance，and then wereratinjected intraperitoneally with low dose of streptozotocin(STZ，35mgkg)once，theblood glucose1 67mm011 was selected as the group D，the

11、mechanical withdrawal 缸eshold(MWT)and thermal withdrawal latency(TWL)were evaluated before and at 14d after STZ injection，and 81 rats were divided into 3 groups(n227)：group DNP： t11ey were fed on highfat and fructose diet and dont make any processing；group DCur：high fat and sugar feed，type 2 diabeti

12、c neuropathic pain and intraperitonal injection of curcumin lOOmgkgd for 14d；group DSC：high fat and sugar feed，type II diabetic neuropathic pain and intraperitonal injection of com oil 4mlkg for 14d· Another 27 nomal SD rats were adopted as control group(group N)，and were fedwith nonnal forage

13、and dont make any processingMWT and TWL were measuredat3d7d1 4d afler curcumin injection，the lumbar segment 4-6 of the spinal cord andme L46 DRG were removed at the same timeThe changes of BiP、p-elF2ablotexpression were determined by immunohistochemical staining and westernResuits1Changes of weight，

14、blood glucose，insulin level and insulin sensitivity index：7溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文Compared with group N，the weight of group D was significantly increased after raising 8 weeks(group N：41320士17OOg，group D：46108士29039)(P<005)，the concentration of serum glucose in group D was higher than group N，but not reach t

15、he diagnostic criteria of diabetes(group N：634士046 mmol1group D：653+036 mmol1)，the insulin concentration was also increased(group N：393士054pML， group D：450-士029pML)(P<005)and insulin sensitivity index was obviously declined(group N：-27士035，group D：-378+05 1)(P<005)2Change of the pain threshold

16、：There was no significant defference in MWT(group N：4057士3379，group D：4110-士5039)and TWL(group N：1267士243s， group D：1 283土152s)basic value among four group before and after injection STZ Compared with group N，MWT and TWL were significantly low after STZ given 1 4d in other groups(P<005)；Compared

17、with group DNP,the pain threshold in group DCur were higher at curcumin post-given 7d，and had significant increased at 1 4d after injection curcumin(P<005)；it was no difference between group DNP and group DSC in different time points after injection curcumin3Expressions of BiP in the dorsal horn

18、of spinal cord and DRG：there was no significant expression of BiP in group N(1)immunohistochemical results：In group DNP,DCur,DSC，the expression of BiP was markedly increased compared with group N(P<005)；with treatment of cureumin for 7d，the expression of BiP(spinal dorsal horn 1500士224，DRGl416士19

19、7)in group DCur began to drop，at 14d after injection curcumin，the level of BiP expression was significant lower than group DNP(P<005)；the expression of BiP had no differences between group DNP and group DSC(2)Western blot result：The level of BiP expression in group DNP,DCur, DSC were higher than

20、what the group N showed；compared with group DNP,the expression of BiP was reduced in group DCur at curcumin postgiven 7dp<005)，and moved on a downtrend to 1 4d，it indicated that there was some slight and subtle differences between group DNP and group DSC4Expressions of p-elF2a in the dorsal horn

21、of spinal cord and DRG：there wasno significant expression of p-eIF2a in group N(1)immunohistochemical results：Ingroup DNP,DCur,DSC，the expression of p-elF2a was markedly increased compared8溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文with group N(P<O05)；with treatment of curcumin for 7d，the expression of p-elF20t(spinal dorsal ho

22、rn 874士109，DRG796士055)in group DCur began to drop，at 1 4d after iIljeCtion curcumin，the level of pelF2a expression was significant lower than group DNP(P<005)；the expression of p-elF2a had no differences between group DNP and group DSC(2)Westem blot result：The level of p-elF2ct expression in grou

23、p DNP,DCur,DSC were higher than what the group N showed； compared with group DNP,the expression of p-elF2a was reduced in group DCur at curcumin post-given 7d(p<005)，and moved on a downtrend to 1 4d，it indicated that there wad some slight and subtle differences between group DNP and group DSCConc

24、lusions Type II diabetic neuropathic pain rats showed that its pain threshold reduced significantly and its expressions of BiP and p-elF2a were increased compared with normal ratsCurcumin could markedly reduced the pain of type II diabetic neuropathic pain in rats，which mechanisms may relevant with

25、reducing the expressions of BiP and p-elF2a【Key words】type II diabetes mellitus，neuropathic pain，endoplasmic reticulumstress，BiP,p-eIF20t，rats9溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文縮略詞表3溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文前言隨著人民生活水平的迅速提高和人均壽命的延長，糖尿病的患病率逐年上 升，其中以II型糖尿病為主，占到90，并且常伴有全身肥胖或體脂分布異常。 II型糖尿病的發(fā)病機(jī)制主要包括胰島B細(xì)胞分泌胰島素不足和胰島素抵抗二個(gè) 環(huán)節(jié)。高血糖、高血脂狀態(tài)下和胰腺上胰島淀粉樣

26、物質(zhì)的沉積，或是它們的聯(lián)合 作用，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性逐漸破壞，出現(xiàn)明顯的糖尿病，甚至引起各種急慢 性并發(fā)癥，導(dǎo)致機(jī)體功能障礙和衰竭，成為致殘、致死的主要原因。在糖尿病所 有并發(fā)癥中，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(Diabetic Neuropathic Pain，DNP)是其最常見 的慢性并發(fā)癥之一，其疼痛可表現(xiàn)為自發(fā)性痛，也可以表現(xiàn)為觸誘發(fā)痛及痛覺超 敏【l】，還有多種臨床癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致足部潰瘍或截肢。 II型糖尿病目前的治療主要是用藥物控制血糖，但是其神經(jīng)病變導(dǎo)致的疼痛以及 其他癥狀和體征往往難以治療，目前各大醫(yī)院的藥物治療、介入治療、脊髓刺激、 鞘內(nèi)輸注甚至腦深部刺激，

27、常常收效甚微，或根本無效。因此研究II型DNP發(fā) 生機(jī)制和探索有效的治療方法已成為當(dāng)前的艱巨任務(wù)，有著極其重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值 和社會意義。糖尿病狀態(tài)下的高血糖激活神經(jīng)細(xì)胞線粒體內(nèi)膜使蛋白解耦聯(lián)，促使線粒體 活性氧(ROS)不斷生成，導(dǎo)致DNA損傷，隨后激活核DNA修復(fù)酶聚ADP2核多聚酶(P6岫)，該酶的激活導(dǎo)致糖酵解限速酶一一磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)的活性顯著抑制，GAPDH的上游代謝物迅速積聚，糖酵解支路轉(zhuǎn)向糖代謝支路， 蛋白質(zhì)糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)形成增多【2】。NFrd3的激活因素包括高血糖、 ROS生成增多、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、AGEs等【3】，而活性狀態(tài)下的NF迎可使凝 血組織因

28、子、內(nèi)皮素、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP1)等基因的表達(dá)增加，導(dǎo)致血 管通透性改變、血流調(diào)節(jié)功能受損、神經(jīng)內(nèi)膜血流灌注減少，直接和間接促進(jìn)細(xì) 胞包括神經(jīng)細(xì)胞的損傷，神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與神經(jīng)損傷密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)位于細(xì)胞核附近的胞質(zhì)區(qū)域，是細(xì)胞合成、加工蛋白質(zhì)與貯存Ca2+ 的主要場所，也是蛋白質(zhì)合成與翻譯后修飾、多肽鏈正確折疊與裝配的重要場所。 對應(yīng)激極為敏感。多種因素如缺血、缺氧或氧化應(yīng)激等各種原因使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)10溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文Ca2+耗竭、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)糖基化抑制、二硫鍵錯(cuò)配、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)向高爾基體轉(zhuǎn) 運(yùn)減少等生理功能紊亂時(shí)，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積蓄 等，細(xì)胞啟動(dòng)內(nèi)

29、源性自我保護(hù)反應(yīng)機(jī)制使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生改變，統(tǒng)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng) 激(endoplasmie reticulum stress，ERS)E4,52它有利于恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和維 持細(xì)胞存活【6j。有研究顯示：肥胖產(chǎn)生的同時(shí)也有細(xì)胞應(yīng)激和炎癥信號通路的激 活，并因此提出一系列學(xué)說，如炎癥病因?qū)W說、氧化應(yīng)激學(xué)說和炎癥氧化應(yīng)激、 炎癥學(xué)說等，但尚不清楚引發(fā)細(xì)胞應(yīng)激的起源_7'81。整體動(dòng)物、細(xì)胞、分子水平 上的實(shí)驗(yàn)研究表明ERS是聯(lián)系肥胖、胰島素抵抗和型糖尿病的重要紐帶拶J； Martenson等研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物存在“應(yīng)激致痛”現(xiàn)象【10】，但是ERS在II型糖尿病神經(jīng) 病理性疼痛中的作用缺乏研究。姜

30、黃素(eurcumin)是姜科植物姜黃的提取物，它是一種酚性色素，是一種 天然的有效成份，其分子結(jié)構(gòu)中包含兩個(gè)鄰甲基化的酚和一個(gè)p二酮功能基團(tuán)， 這種結(jié)構(gòu)特性使其具有多種生物活性。另外，它具有極低的毒性，歷史悠久的藥 用價(jià)值，廣泛的藥理作用如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、清除自由基等【11,12】。我們實(shí) 驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素緩解I型糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛與其降低大鼠脊髓背角和DRG細(xì)胞中p-JNK、PNFrd3、PCERB等的表達(dá)有關(guān)【13】。但姜黃素在 II型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的作用以及其與ERS的關(guān)系未見報(bào)道。因此本研究應(yīng)用高脂高糖飼料喂養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗后，再輔助小劑 量鏈脲佐

31、菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射致使大鼠II型糖尿病的發(fā)生，觀 察大鼠機(jī)械痛敏與熱痛敏的變化，并在給予姜黃素后觀察其對大鼠機(jī)械痛敏、熱 痛敏和脊髓背角及DRG中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BiP和PelF20t表達(dá)的影響。探討ERS在II型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的作用和姜黃素對機(jī)械痛敏、熱痛敏及 BiP、PelF20t表達(dá)的影響，為ERS在II型糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中的發(fā)生發(fā)展 及將后姜黃素在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文材料與方法1實(shí)驗(yàn)材料11主要試劑和藥品試劑或藥品生產(chǎn)公司鏈脲佐菌素(0602010)美Sigma公司姜黃素(28260)美國Sigma公

32、司玉米油(C8267)美Sigma公司大鼠胰島素ELISA試劑盒上海西塘公司兔抗BiP多克隆抗體(Ab53067)英國Abcam公司兔抗PeIF2a單克隆抗體英國Abeam公司 兔抗3-Tubulin多克隆抗體(SC。9104)美國Santa Cruz公司 HRP標(biāo)記兔二抗(APl32P)美國Chemicon公司 超敏型抗兔二步法檢測試劑盒(PV-9001)北京中杉金橋公司 O01M PBS磷酸鹽緩沖液(ZLI9062)北京中杉金橋公司 001M檸檬酸緩沖液(ZLI一9064)北京中杉金橋公司DAB顯色試劑盒(ZLI一9018)北京中杉金橋公司Harris蘇木素液(ZLI一9039)北京中杉金

33、橋公司 彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker(SM0617)美國Fermentas公司 BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012)碧云天生物技術(shù)研究所 PMSF(ST506)碧云天生物技術(shù)研究所RIPA裂解液(強(qiáng))(P0013B)碧云天生物技術(shù)研究所 SDSPAGE蛋白上樣緩沖液(5×)(P0015)碧云天生物技術(shù)研究所 十二烷基硫酸鈉SDS(ST627)碧云天生物技術(shù)研究所TEMED四甲基乙二胺(ST728)碧云天生物技術(shù)研究所過硫酸銨(AP)(ST005)碧云天生物技術(shù)研究所甘氨酸(ST085)碧云天生物技術(shù)研究所Tris(ST765)碧云天生物技術(shù)研究所30Acr-Bis(29：1

34、)(ST003)碧云天生物技術(shù)研究所】2溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文15M Tris-HCl,pH88(ST789)碧云天生物技術(shù)研究所1M Tris-HCl，pH68(ST768)碧云天生物技術(shù)研究所麗春紅染色液(P0022)碧云天生物技術(shù)研究所Westem一抗稀釋液(P0023A)碧云天生物技術(shù)研究所Westem封閉液 碧云天生物技術(shù)研究所 超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(P0018) 碧云天生物技術(shù)研究所 水合氯醛(MWl654) 上海國藥集團(tuán)多聚甲醛(分析純1408)上海凌峰化學(xué)有限公司12主要儀器和器械儀器或器械(型號)生產(chǎn)公司Electronic Von Fery觸覺測痛儀(2390型)美國I

35、I TC公司甩尾足底測試儀(336型)美國II TC公司血糖分析儀及試紙美國強(qiáng)生公司制冰機(jī)(AFl00)意大利Scotsman公司超純水裝置(PS9000705)美國Labconco公司低溫冰箱(Thermo Forma 700)美國熱電公司精密pH計(jì)(PHS3C)上海雷磁儀器廠Leica病理切片機(jī)(RM3325)德國Leica公司 高速冷凍離心機(jī)(ALLEGRA64A)美國貝克曼公司 電熱鼓風(fēng)干燥箱上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司SSW型電熱恒溫水槽上海博迅實(shí)業(yè)有限公司酶標(biāo)儀(ELx800)美國BIOTEK公司顯微鏡(CX4112L02)日本Olympus公司 顯微熒光照相系統(tǒng)(Nikon E800

36、)日本Nikon公司 電子計(jì)時(shí)器日本日立公司型電子天平上海精密科學(xué)儀器公司超聲破膜儀(VCl30PB)美國Sonics公司BioRad電泳轉(zhuǎn)膜儀(Power pac)美國BioRad公司溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文Eppendorf移液器德國Eppendorf公司旋轉(zhuǎn)振蕩器北京德天佑科技有限公司APED處理防脫片(ZLI9501)北京中杉金橋公司PVDF膜(D00010)美國Solarbio公司Alpha Innotech曝光機(jī)(702500)MicroChemi公司13試劑配制(1)4多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)-PFA409溶于500ml 001M的 PBS液中，持續(xù)加熱

37、磁力攪拌至6065，使成乳白色懸液。用01molL的NaOH 液滴加攪拌，使液體呈清亮，再加入O01M的PBS液定容至1000ml，冷卻、常 溫保存?zhèn)溆?。整個(gè)配制過程在通風(fēng)廚中完成。(2)鏈脲佐菌素液：STZl00mg溶于10ml 001mmol1檸檬酸鹽緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用。(3)姜黃素液：姜黃素用玉米油溶解配置成25mgml的溶液，避光于4保 存，使用前均震蕩搖勻。(4)人工腦脊液：NaCl 126mM、KCl 3Mm、KH2P04 14Mm、NaHC03 26mM、葡萄糖4mM、MgS04 13raM、CaCl2 14 mM，高壓滅菌備用。 (5)PMSF：001749溶于異丙醇配成10m

38、molL，一20。C保存。(6)10AP：AP019、ddH2010ml溶解后，4保存，保存時(shí)間為1周。 (7)10SDS：SDSIOg、ddH20100ml，50。C水浴下溶解，常溫保存。 (8)10AP：AP019、ddH2010ml溶解后，4"C保存，保存時(shí)間為2周。 (9)8ml 10分離膠：30Acr-Bis 264ml、15M Tris(pH88)20ml、IOSDS80肛l、TEMED四甲基-胺32d、lOAP80pI、ddH2032ml，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。(10)4ml 5濃縮膠：30Acr-Bis 052ml、1M TrisHCI(pH68)10ml

39、、10SDS 40I_tl、TED四甲基乙二胺401xl、10AP20Ltl、ddH20 244ml，加入TEMED 混勻后即可即可灌膠。(11)電泳緩沖液(1×)：Tris(MWl2114)3039、甘氨酸(MW7507)18779、SDSlg、ddH20至1000ml。(12)轉(zhuǎn)移緩沖液(1×)：Tris(MWl2114)589、甘氨酸(MW7507)299、14溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文甲醇200ml，ddH20至1000ml。(13)IOxTBS緩沖液：NaCl 889、嘶s 1219、ddH20800ml溶解后，濃鹽酸 調(diào)pH至75，ddH20定容至1000ml。(1

40、4)TBST緩沖液：IOOmlIO)(TBS緩沖液加lmlTween20，ddH20定容至1000ml。2實(shí)驗(yàn)方法21動(dòng)物模型制備雄性SD大鼠90只，體重160-一1809，清潔級標(biāo)準(zhǔn)，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 中心提供。動(dòng)物喂以高脂高糖飼料(67普通飼料+10豬油十20蔗糖+2膽固 醇+1膽酸鈉)并自由攝食、飲水，室溫保持在200C250C，濕度5080， 12h12h白天黑夜循環(huán)照明。于實(shí)驗(yàn)開始即第0周、飼養(yǎng)第8周分別測體重、血 糖，并取血測血清胰島素及評估胰島素敏感性。飼養(yǎng)8周后大鼠禁食不禁飲12h后按35mgkg單次腹腔注射1STZ溶液。3d后測定大鼠尾靜脈血糖，血糖穩(wěn) 定且167mmol

41、l入選實(shí)驗(yàn)【14】，14d后測大鼠痛閾，降低到基礎(chǔ)值的85以下入選為D組，其余剔除。22動(dòng)物分組采用隨機(jī)數(shù)字表法，將D組大鼠隨機(jī)分為三組(n一27)：DNP組：II型糖 尿病神經(jīng)病理性痛組，不作任何處理；(g)DCur組：II型糖尿病神經(jīng)病理性痛+ 姜黃素lOOmgkgd組，在注射STZl4d后開始腹腔注射姜黃素lOOmgkgd，持續(xù)14天；)DSC組：II型糖尿病神經(jīng)病理性痛+玉米油溶劑對照組，在注射STZl4d后開始腹腔注射姜黃素的溶劑玉米油4mlkgd，持續(xù)14天。另取27只 正常大鼠為對照組(N組)，給予普通飼料喂養(yǎng)，不作任何處理。 3胰島素水平測定31取血清：大鼠禁食不禁飲12h，抽

42、取各組大鼠尾靜脈血液標(biāo)本測血糖，靜置5min，40C、4000r，離心20min，取上清液，4保存?zhèn)溆谩?32 ELISA法測胰島素水平： (1)10x標(biāo)本稀釋液用ddH20作1：10倍稀釋成l×備用。(2)標(biāo)準(zhǔn)品液配制：標(biāo)準(zhǔn)品使用前加入O5mlddH20混勻，配成40ngml溶液， 設(shè)8管標(biāo)準(zhǔn)管，第1管加1×標(biāo)本稀釋液900p1，第28管加1×標(biāo)本稀釋液各5001xl，溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文在第1管中加入40ngml標(biāo)準(zhǔn)品溶液loopl混勻后用加樣器吸出500d，移至第2 管，如此反復(fù)對倍稀釋，從第7管吸出500tl棄去，第8管為空白對照。(3)稀釋標(biāo)本：血清標(biāo)

43、本用1×標(biāo)本稀釋液作l：20倍稀釋，即101d標(biāo)本加l× 標(biāo)本稀釋液190pl混勻。(4)稀釋洗滌液：洗滌液用ddH20作1：20倍稀釋，即lml濃縮洗滌液加ddH2019ml混勻。(5)加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋后的標(biāo)本lOOpl，將反應(yīng)板充分混勻后置 37。C水浴箱2h后，棄去孔內(nèi)液體，用稀釋后的洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次， 在濾紙上印干。(6)加第一抗體工作液：每孔加第一抗體工作液100“1，將反應(yīng)板充分混勻后 置37"C水浴箱1h后，棄去孔內(nèi)液體，用稀釋后的洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌46 次，在濾紙上印干。(7)21：1酶標(biāo)抗體工作液：每孔加酶標(biāo)抗體工作

44、液lOOpl，將反應(yīng)板充分混勻后 置37"C水浴箱30min后，棄去孔內(nèi)液體，用稀釋后的洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌 4-6次，在濾紙上印干。(8)加底物工作液：每孔加底物工作液100¨1，將反應(yīng)板充分混勻后置37。C， 暗處反應(yīng)15min。(9)加終止液：每孔加終止液lOOpl，30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。 (10)計(jì)算胰島素含量及胰島素敏感性指數(shù)：所有OD值都應(yīng)減去空白值后再行計(jì)算。胰島素敏感性指數(shù)(ISI)=1(空腹血糖×空腹胰島素)=I(FPG×FINS)， 此值為非正態(tài)分布，故計(jì)算時(shí)取其自然對數(shù)【1 51。4行為學(xué)測定分別于注射STZ

45、前(基礎(chǔ)狀態(tài))、注射STZl4d后及給姜黃素3、7、14d后 測定MWT和TWL。所有測定均在固定時(shí)間(8：0017：00)及安靜的環(huán)境下 進(jìn)行，室溫維持在(24o土O5)。41機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)的測定： 將大鼠置于底為金屬篩網(wǎng)(1×lcm2)的透明有機(jī)玻璃箱(22cm×22cm×22cm)中， 玻璃箱被架高于實(shí)驗(yàn)臺面50cm。待大鼠在箱中適應(yīng)15min后，用IITC2390型 Electronic VonFery觸覺測痛儀垂直刺激大鼠雙后趾，單次刺激時(shí)間1秒，刺16溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文激間

46、隔10s。記錄測試時(shí)大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為時(shí)的刺激強(qiáng)度值，測5次取平 均值即為其MWT16】。42熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)測定：用IITC336甩 尾足底測試儀于上述各時(shí)點(diǎn)測定TWL。將大鼠置于3mm厚的玻璃板上，使用熱 輻射照射其后趾相應(yīng)部位，記錄從照射到縮爪回避的時(shí)間，每只大鼠雙足各測5次，每次間隔5min，取后3次的平均值即為其TWL【17】。 5免疫組織化學(xué)法51標(biāo)本取材及制作：于注射姜黃素3、7、14d機(jī)械痛敏和熱痛敏測定后經(jīng) 腹腔注射5水合氯醛400 mgkg麻醉動(dòng)物，各時(shí)間點(diǎn)取6只剖胸后經(jīng)左心室 主動(dòng)脈插管，快速灌注生理鹽水20

47、0 ml，待右心室流出清亮液體后再灌注4多聚甲醛400ml，灌注成功的表現(xiàn)為大鼠肝臟發(fā)白、四肢和尾巴僵直。取大鼠L46 節(jié)段脊髓和相應(yīng)DRG，固定后石蠟包埋，切片，片厚4-51am，晾干各用。52免疫組化染色：用sP法免疫組織化學(xué)染色、DAB顯色。 (1)切片經(jīng)60烤片2h至石蠟溶解，二甲苯脫臘至水化：二甲苯I、II各10min、無水乙醇、95乙醇、80乙醇、75乙醇各5rain、PBS液(pn 7274)沖洗5minx3次； (2)抗原高壓熱修復(fù)：枸櫞酸修復(fù)液加熱至微沸后將切片放入，蓋上高壓鍋加壓閥，待其噴氣時(shí)開始計(jì)時(shí)，高壓修復(fù)(BiPlomin，p-elF2a15min)后離開熱源，自來水

48、流水冷卻至室溫，取出玻片，PBS液沖洗5min×3次； (3)封閉：3過氧化氫封閉20min，PBS液沖洗5minx3次； (4)IN入一抗4"C孵育1624h(BiP一抗稀釋度為1：150，p-elF2a一抗稀釋度為1：200)；PBS液沖洗5minx3次；(5)加HRP標(biāo)記抗兔二抗37孵育lh，PBS液沖洗5minx3次；(6)DAB顯色(BiP 4min，p-eIF2a5min)自來水沖洗；蘇木素復(fù)染(BiP 2min，p-elF2a10s)自來水沖洗； (7)1鹽酸酒精分化5s，自來水沖洗；(8)脫水、透明：95乙醇I、II各5min，無水乙醇I、II各5min，二

49、甲苯 I、II各10min；中性樹膠封片、晾干、鏡檢觀察。(9)使用Nikon E800型熒光顯微照相系統(tǒng)采集圖象，染色陽性反應(yīng)為棕黃色 顆粒，間隔5張順序選取脊髓背角(I、II板層)和DRG片子6張只，計(jì)算脊 髓背角和DRG中BiP和p-eIF2a的陽性細(xì)胞率(陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)總細(xì) 胞數(shù)×100)。溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文6免疫印跡61標(biāo)本取材：于注射姜黃素3、7、14d痛閾測定后經(jīng)腹腔注射5水合氯醛400 mgkg麻醉動(dòng)物，各時(shí)間點(diǎn)取3只快速分取脊髓L4-6節(jié)段及相應(yīng)節(jié)段DRG， 用預(yù)冷4。C的人工腦脊液洗猙血液，液氮中快速制冷，80低溫保存?zhèn)溆谩?2免疫印跡測蛋白：內(nèi)參為I

50、-tubulin。 (1)制作樣本蛋白：操作均在4。C完成。80冰箱取出新鮮組織標(biāo)本，按重量體積比1：10加入裂解液，使用研磨器間斷研磨30min至細(xì)胞破碎裂解，超聲破 膜(振幅40)10sx3次，靜置30min，然后12000r、4。C離心20min，取上清液 置80冰箱備用；(2)測蛋白濃度：以BCA試劑盒BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白在BioTek熒光分析儀上比 色測定吸光值，描繪蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定樣本蛋白濃度：根據(jù)所測樣品吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白含量，乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實(shí)際濃度(即50tg 中159l樣品中蛋白含量)：(3)蛋白樣本融化，每管加入ddH20配成129l上樣量，再加入5&#

51、215;上樣緩沖液 39l，煮沸5min蛋白變性后置20冰箱備用；(4)制膠：使用BioRad垂直板電泳裝置，清洗玻璃板，晾干后邊緣對齊后放 入夾中卡緊，然后垂直嵌入橡皮條固定于電泳架上，使兩板間形成密閉凹槽，沿 玻璃灌注10 o60分離膠，待膠面升到綠帶中間線高度即可，加水液封，37溫箱 靜置15min，凝后用吸水紙將膠上層水吸干，將剩余空間灌滿4濃縮膠，插梳 子(梳子保持水平)靜置凝固；(5)取配好的樣品，冰中凍融，震蕩器搖勻，短暫離心，將玻璃板固定于電泳 槽中，內(nèi)槽灌滿電泳緩沖液，兩手分別捏住梳子兩邊豎直向上輕輕將其拔出，用 移液器加樣(每孔樣品159l，Marker3btl)，外槽加電

52、泳液至玻璃板下13，記錄 Marker及樣本加樣排列順序；(6)電泳：冰冷環(huán)境中，濃縮膠電壓70V，待溴芬蘭跑至分離膠線時(shí)改用120V 電壓，待跑出底線時(shí)即可終止電泳，電泳結(jié)束后，將玻璃板輕輕撬開，根據(jù)Marker 標(biāo)記獲取所需目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶的凝膠，放入轉(zhuǎn)移液中平衡15min備用； (7)轉(zhuǎn)膜：剪取與凝膠相當(dāng)大小的PVDF膜，剪去膜右上角作為標(biāo)記，在甲醇 中通過毛細(xì)血管作用浸透后沒入ddH20中2min，轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移緩沖液中浸浴平衡18溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文10rain，將在轉(zhuǎn)移液中平衡后的膠蓋于濾紙上按順序固定好(從負(fù)極到正極依次 為濾紙凝膠PVDF膜濾紙)，輕輕用玻棒搟去氣泡、夾好固定

53、，置轉(zhuǎn)膜槽(確 定正負(fù)極無誤)，灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液，設(shè)定轉(zhuǎn)膜儀參數(shù)300mA，50min，置入冰浴 環(huán)境；(8)轉(zhuǎn)膜后可將PVDF膜用麗春紅染色，了解蛋白轉(zhuǎn)移情況。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間 要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，目的 蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短，染色后的PVDF膜用TBST液漂洗 10minx 3次；(9)封閉：加入封閉液(含5脫脂牛奶的TBST液)室溫?fù)u床上封閉(BiP、 Tubuin封閉lh，p-elF2a封閉2h)，TBST沖洗10min×3次；(10)加一抗工作液：BiP多克隆抗體(兔抗大鼠，脊髓1：1000稀釋，DRGl：1000稀釋

54、)，p-eIF2a單克隆抗體(兔抗大鼠，脊髓1：1000稀釋，DRGl：2000稀釋)， 40過夜孵育18小時(shí)，TBST液沖洗10minx3次；QD加二抗工作液：5脫脂牛奶稀釋的羊抗兔Ig堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG抗體 (山羊抗兔，按1：8000稀釋)，室溫?fù)u床上孵育lh，TBST洗膜10minx3次；滴加超敏ECL發(fā)光液用Alpha Innotech曝光機(jī)曝光、拍照。用Alpha EaseFC軟件分析目的蛋白，內(nèi)參蛋白的平均光密度值。 7統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 1 60統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。全部數(shù)據(jù)以均數(shù)4-標(biāo)準(zhǔn)差表示，采 用單因素方差分析，繼以最小顯著差異t檢驗(yàn)行兩兩比較。P<005為差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義。溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文結(jié)果1一般情況觀察 正常組大鼠毛色光滑柔軟，每日飲食、尿量正常，性格溫順，而在注射STZl4d的造模組大鼠則毛色暗淡，每日飲食、飲水、尿量明顯增多。 2體