發(fā)酵復習重點

1、篩選菌株時需考慮的一些指標A. 菌的營養(yǎng)特征，可利用廉價的原料；B. 菌的生長溫度應選擇溫度高于40的菌種，這可大大降低大規(guī)模發(fā)酵的冷卻成本；C. 菌對所采用的設備和生產過程的適應性；D. 菌的穩(wěn)定性；E. 菌的產物得率和產物在培養(yǎng)液中的濃度；F. 產物易于從培養(yǎng)液中分離。誘變育種用各種物理、化學的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，稱為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質稱為誘變劑營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型：是指喪失了合成一種或多種必需生長因子能力的菌株，它們只能在補充了相應的生長因子的培養(yǎng)基上才能正常生長。完全培養(yǎng)基(CM, Complete Medium) ：含有滿足所有營養(yǎng)缺

2、陷型和野生型菌株生長所需營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基，其中的生長因子多是通過添加蛋白胨或酵母高等天然物質而提供?；九囵B(yǎng)基(MM, Minimal Medium)：不含生長因子的培養(yǎng)基，在MM上營養(yǎng)缺陷型不能生長，但野生型菌株則能生長。補充培養(yǎng)基(SM, Supplemented Medium)：補充了一種或數種生長因子，以滿足特定的營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷型突變株的育種過程 誘變處理； 后培養(yǎng)： 在CM中進行，消除突變細胞的表型延遲（生理性延遲和分離延遲） 淘汰野生型： 降低野生型細胞的數量和比例，使營養(yǎng)缺陷型細胞得以相對濃縮。 檢出缺陷型 鑒定缺陷型差別殺菌：利用芽孢或孢子比營養(yǎng)細胞更耐熱的特點

3、?？股胤ǎ呵嗝顾啬軞⑺郎L態(tài)的細菌而對休止態(tài)的細菌無作用。菌絲過濾法：適用于絲狀真菌饑餓法：某些缺陷型菌株在某些培養(yǎng)條件下會因代謝不平衡自行死亡，可是如果在細胞中發(fā)生了另一營養(yǎng)缺陷型突變，這一細胞反而會因代謝平衡的恢復而避免死亡，從而可被濃縮。代謝類似物：只有調節(jié)功能，不能合成有活性的生物大分子。加入代謝類似物，將關閉相關代謝物的合成，從而影響微生物的生長。微生物發(fā)酵產酶的生產方式固體培養(yǎng)發(fā)酵液體深層發(fā)酵固定化細胞發(fā)酵誘導調節(jié)：某些酶在通常情況下不合成或合成甚少，但加入“誘導物(Inducer)”后，就能大量合成，這種現象稱為誘導(Induction)。阻礙調節(jié)：阻礙有兩種類型： 尾產物(反

4、饋)阻礙和分解代謝產物阻礙提高酶產量的方法：條件控制：如添加誘導物、降低阻礙物濃度遺傳控制：如基因突變、基因重組發(fā)酵培養(yǎng)基的要求 培養(yǎng)基能夠滿足產物最經濟的合成。 發(fā)酵后所形成的副產物盡可能的少。 培養(yǎng)基的原料應因地制宜，價格低廉；且性能穩(wěn)定，資源豐富，便于采購運輸，適合大規(guī)模儲藏，能保證生產上的供應。 所選用的培養(yǎng)基應能滿足總體工藝的要求，如不應該影響通氣、提取、純化及廢物處理等。一、按純度合成培養(yǎng)基 : 原料其化學成分明確、穩(wěn)定天然培養(yǎng)基: 采用天然原料原料來源豐富(大多為農二、按狀態(tài)固體培養(yǎng)基 體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基三、按用途培養(yǎng)基按其用途可分為孢子（斜面） 培養(yǎng)基、 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)

5、基三種無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質，這種經微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質的無機氮源叫生理酸性物質，如硫酸胺，若菌體代謝后能產生堿性物質的則此種無機氮源稱為生理堿性物質，如硝酸鈉。1、 生長因子從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。2、 前體前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼微生物在生物合成過程中合成到產物物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但是產物的產量卻因加入前體而有較大的提高。3、 產物促進劑所謂產物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產量的添加劑

6、。三、培養(yǎng)基設計的步驟 根據前人的經驗和培養(yǎng)基成分確定時一些必須考慮的問題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分； 通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分； 當培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實驗次數常采用一些合理的實驗設計方法消毒與滅菌的區(qū)別消毒：是指用物理或化學方法殺死物料，容器，器具內外的病源微生物，一般只能殺死營養(yǎng)細胞而不能殺死細菌的芽孢。滅菌：是用物理或化學方法殺死或除去物料和設備（環(huán)境中）所有有生命的有機體的技術或工藝過程。包括營養(yǎng)細胞，細菌芽孢和孢子1. 干熱滅菌法常用的干熱滅菌條件為在160下保溫1h。主要是使微生物由于氧化作用而死亡。其不

7、如濕熱滅菌有效。一些要求保持干燥的實驗器具和材料(如培養(yǎng)皿、接種針等)常用干熱滅菌。2. 濕熱滅菌法使用飽和蒸氣壓滅菌。由于蒸汽有很強的穿透力，且在冷凝時放出大量的冷凝熱，使蛋白質凝固變性而殺滅各種微生物。是最常用的滅菌方法。致死溫度：殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。在致死溫度下，殺死全部微生物所用的時間稱為致死時間，溫度愈高，致死時間愈短。濕熱滅菌的優(yōu)點1.來源容易，操作費用低，本身無毒；2. 蒸汽有強的穿透力，滅菌易于徹底；3. 蒸汽有很大的潛熱；4. 操作方便，易管理。微生物的熱死滅動力學方程-dN/dt=KNN：任一時刻的活細菌濃度(個/L)t：時間(min)K：比熱死速率常數(mi

8、n-1)積分得：lnN/N= -Kt分批滅菌將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽，培養(yǎng)基和所用設備一起進行滅菌的操作過程（也稱為實罐滅菌）。連續(xù)滅菌的設計將配置好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐輸送的同時，加熱，保溫和冷卻，進行滅菌。優(yōu)點：比分批滅菌的溫度更高，保溫時間則比較短，有利于減少營養(yǎng)物質的破壞；滅菌過程中蒸汽用量平穩(wěn)。缺點：設備比較復雜，投資較大。連續(xù)滅菌與間歇滅菌的比較間歇滅菌的優(yōu)缺點 優(yōu)點 設備投資較少 染菌的危險性較小 人工操作較方便 對培養(yǎng)基中固體物質含量較多時更為適宜 缺點 滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負荷波動大，一般只限于中小型發(fā)酵裝置。連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點 優(yōu)點 保留較

9、多的營養(yǎng)質量 容易放大 較易自動控制； 糖受蒸汽的影響較少； 縮短滅菌周期； 在某些情況下，可使發(fā)酵罐的腐蝕減少； 發(fā)酵罐利用率高； 蒸汽負荷均勻。 缺點 設備比較復雜，投資較大。影響滅菌的因素實際滅菌中，除了雜菌的種類，數量，滅菌的溫度和時間外，培養(yǎng)基的成分， pH值，培養(yǎng)基中顆粒與泡沫等對培養(yǎng)基滅菌也有影響?？諝夂康臏y定培養(yǎng)法：微生物學中已介紹過光學法 ：用粒子計數器通過微粒對光線的散射作用來測量粒子的大小和含量。空氣除菌的方法1. 輻射滅菌2. 加熱滅菌3. 靜電除菌4 介質過濾介質過濾除菌利用有孔介質從氣體中除去微生物過 濾 機 理A. 慣性碰撞 在氣流速度較大時，是介質過濾的主要

10、作用。慣性沖擊取決于微粒的動能，纖維阻力，氣流速度；與氣流速度成正比。B. 攔截在氣流速度較小時才起作用，在介質過濾中非主要功能，氣流速度與截留效應成反比。C. 步朗運動氣流速度小時，是主要的作用，氣流速度 與截留效應成反比。D. 重力沉降 作用很小。E. 靜電吸附作用 直接攔截 慣性撞擊 擴散攔截穿透率 穿透率：P=N2/N1數與原有微粒數的比值。Eg: 如果要求每1000次使用周期中只允許有一個雜菌通過，原有顆粒數為5000(個/m3 )，即經過濾后要求無菌度N=10-3，則：P=10-3/(5000*60*V1)其： 為分批發(fā)酵的時間或過濾器的無菌周期(h)V1為通風量 m3/min (

11、時間換算)種子擴大培養(yǎng)菌種的擴大培養(yǎng)就是把保藏的菌種，即砂土管，冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產菌種接入試管斜面活化，再經過扁瓶或藥瓶和種子罐，逐級擴大培養(yǎng)后達到一定的數量和質量的純種培養(yǎng)過程。這些純種的培養(yǎng)物稱為種子。實驗室種子的制備一般采用兩種方式對于產孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。對于產孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。種子罐級數：是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數，取決于：1. 菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；2. 所采用發(fā)酵罐的容積3. 對于生長快的細菌，種子用量用量比例小

12、，故種子罐相應也少。種齡： 是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。接種量： 是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。為加大接種量，還采用雙種法、 倒種法、分割法和添加法。分批發(fā)酵是指在一封閉系統內含有初始限量基質的發(fā)酵方式。在這一過程中，除了氧氣、消泡劑及控制pH的酸或堿外，不再加入任何其它物質。發(fā)酵過程中培養(yǎng)基成分減少，微生物得到繁殖。第一類型 產物直接來源于產能的初級代謝（自身繁殖所必需的代謝），菌體生長與產物形成不分開。第二類型 產物也來源于能量代謝所消耗的基質，但產物的形成在與初級代謝分開的次級代謝中，出現兩個峰，菌體生長進入穩(wěn)定期，出現產物形成高峰。

13、第三種類型 產物是在基質消耗和菌體生長之后，菌體利用中間代謝反應來形成的，即產物的形成和初級代謝是分開的。生長關聯型 (第一類型）生長無關聯型（第二，三類型）1. 如果生產的產品是生長關聯型（如菌體與初級代謝產物），則宜采用有利于細胞生長的培養(yǎng)條件，延長與產物合成有關的對數生長期；2. 如果產品是非生長關聯型（如次級代謝產物），則宜縮短對數生長期，并迅速獲得足夠量的菌體細胞后延長平衡期，以提高產量。補料分批培養(yǎng)謂流加發(fā)酵，即補料分批發(fā)酵(Fed-batchfermentation)，有時又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方法。連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基料液連續(xù)

14、輸入發(fā)酵罐，并同時放出含有產品的相同體積發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內料液量維持恒定，微生物在近似恒定狀態(tài)（恒定的基質濃度、恒定的產物濃度、恒定的pH、恒定菌體濃度、恒定的比生長速率）下生長的發(fā)酵方式。所加的培養(yǎng)基是一種限制性基質，并保持在較低的恒定值。其它的條件，如溶氧、無機鹽等，都很充足。恒化培養(yǎng)使培養(yǎng)基中限制性基質的濃度保持恒定恒濁培養(yǎng)使培養(yǎng)基中菌體的濃度保持恒定供氧與產物的合成溶解氧濃度過低（代謝異常，產量降低）；溶解氧濃度過高（代謝異常，菌體提前自溶）。供氧方面：液膜阻力是主要限制因攪拌的作用：1成小氣泡，增大比表面積2體渦流運動，增加氣液接觸時間3液湍流運動，促進傳質4菌體分散，避免結團亞硫酸

15、鹽氧化法在Cu2+存在下，2SO32- + O2 2SO42-剩余的SO32-與過量的碘作用：SO32- + I2 SO42- + 2I-再用Na2S2O3滴定剩余的碘 S2O32- + I2 S4O62- + 2I-CO2對發(fā)酵的影響CO2是微生物的代謝產物，同時也是某些合成代謝的基質。它是細胞代謝的重要指標。在發(fā)酵過程中， CO2有可能對發(fā)酵有促進作用，也有可能有抑制作用。溫度對發(fā)酵的影響及控制Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q輻射發(fā)酵熱的測定 通過測定一定時間內冷卻水的流量和冷卻水進出口溫度，由下式求得這段時間內的發(fā)酵熱。溫度對發(fā)酵的影響1響各種酶的反應速率和蛋白質性質2響發(fā)酵液的物理性

16、質如溶解氧，粘度，基質的分解吸收速率等3響生物合成的方向。發(fā)酵溫度的控制通過在發(fā)酵罐中安裝換熱裝置來控制溫度發(fā)酵罐：夾套(10 m3以下)盤管(蛇管) (10 m3以上)pH對發(fā)酵過程的影響1. 微生物生長和生物合成的最適pH各類微生物都有其最適的和能耐受的pH范圍。微生物生長階段的最適pH與產物合成階段的最適pH往往是不一樣的，與菌種和產物的化學性質有關。2. 對菌體生長和代謝的影響pH影響酶的活性pH影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態(tài)pH影響培養(yǎng)基某些組分和中間代謝產物的離解pH不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產物的質量和比例發(fā)生改變3. 對發(fā)酵液或代謝產物物理化學的影響，特別是對產物

17、穩(wěn)定性的影響。2. pH的控制調節(jié)基礎培養(yǎng)基的配方培養(yǎng)基的成分，初始pH，緩沖劑補料控制直接加酸加堿；補加碳源或氮源，如補加生理酸性物質（ NH4)2SO4或堿性物質（氨水）； 補糖等。發(fā)酵罐分類n 根據反應是否需要氧氣為基準：Ø 嫌氣(厭氧)發(fā)酵罐Ø 通氣(好氧)發(fā)酵罐按照發(fā)酵罐設備特點分類：Ø 機械攪拌通風發(fā)酵罐：包括循環(huán)式，如伍式發(fā)酵罐，文氏管發(fā)酵罐， 以及非循環(huán)式的通風式發(fā)酵罐和自吸式發(fā)酵罐等。Ø 非機械攪拌通風發(fā)酵罐： 包括循環(huán)式的氣提式、 液提式發(fā)酵罐，以及非循環(huán)式的排管式和噴射式發(fā)酵罐。帶有錐形底、 蓋的圓柱形發(fā)酵罐全容積為：V = p 4

18、 D 2 (H + h 1 + h 2 )發(fā)酵罐罐數的確定 N=nt/24+1N：發(fā)酵罐個數（個）n：每24小時內進行加料的發(fā)酵罐數t： 發(fā)酵周期（ 小時）冷卻水耗量的計算Q=WCP(t2-t1) (W:Kg/h) 攪拌器的作用是打碎氣泡，使空氣與溶液均勻接觸， 使氧溶解于發(fā)酵液中。攪拌器有軸向式（槳葉式、螺旋槳式）和徑向式（渦輪式）兩類擋板的作用是改變液流的方向，由徑向流改為軸向流，促使液體劇烈翻動，增加溶解氧。微生物反應通風攪拌罐放大的方法-比擬放大1. 以幾何相似放大。2. 以體積溶氧系數為基準的放大。3. 以P0/V相等為準則的比擬放大。4. 以單位培養(yǎng)液體積攪拌功率相等為基準的放大。5. 以攪拌渦輪尖端線速率為基準的比擬放大。6. 以混合時間相等為基準的比擬放大。染菌的原因1、 設備滲漏2、空氣帶菌3、種子帶菌4、滅菌不徹底5、技術管理不善1.無菌的檢查塵埃粒子檢測無菌平板檢測2.及發(fā)酵液無菌狀況檢測酚紅肉湯培養(yǎng)基檢測 平板劃線 顯微鏡觀察1.單罐染菌不是系統問題， 而是該罐本身的問題。 如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過濾器失效一、 多罐染菌系統問題， 如空氣過濾系統有問題， 特別是總過濾器長期沒有檢查，可能受潮失效；移種或補料的分配站有滲漏或滅菌不徹底三、前期染菌種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底四、中后期