免疫印跡法的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、LOGO關(guān)于免疫印跡法的實(shí)驗(yàn)技術(shù)關(guān)于免疫印跡法的實(shí)驗(yàn)技術(shù)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁(yè)，共46頁(yè) 一、Western-Blot簡(jiǎn)介vWestern Blot，又稱(chēng)為免疫印跡，又稱(chēng)為免疫印跡（Immunoblot）,是是70年代末年代末80年代初發(fā)年代初發(fā)展起來(lái)的蛋白質(zhì)測(cè)定技術(shù)。展起來(lái)的蛋白質(zhì)測(cè)定技術(shù)。v蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認(rèn)為是美國(guó)斯坦福大蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認(rèn)為是美國(guó)斯坦福大學(xué)的喬治學(xué)的喬治斯塔克（斯塔克（George Stark）。在尼）。在尼爾爾伯奈特（伯奈特（Neal Burnette）于）于1981年所年所著的分析生物化學(xué)（著的分析生物化學(xué)（Analytical Biochemistry）中

2、首次被稱(chēng)為）中首次被稱(chēng)為Western Blot。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁(yè)，共46頁(yè)v印跡法（印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法。方法。vWestern Blot 印跡方法，是檢測(cè)蛋白質(zhì)混合印跡方法，是檢測(cè)蛋白質(zhì)混合液體中某種特定目的蛋白的液體中某種特定目的蛋白的定性方法定性方法，也可作為，也可作為確定同一種蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞或者同一種細(xì)胞不確定同一種蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞或者同一種細(xì)胞不同條件下的同條件下的相對(duì)含量的半定量方法。相對(duì)含量的半定量方法?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁(yè)，共46頁(yè)

3、v實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)用途實(shí)驗(yàn)用途2實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 4實(shí)驗(yàn)方法及步驟實(shí)驗(yàn)方法及步驟3 3 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理3 1現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁(yè)，共46頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理v 將獲得的蛋白質(zhì)樣品通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠 【SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE)】電泳使蛋白質(zhì)按分子量的大小進(jìn)行分離 凝膠上分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相支持物（硝酸纖維素膜或PVDF 膜）上 用抗靶蛋白的非標(biāo)記抗體（一抗）與轉(zhuǎn)印后膜上的靶蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合與經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記（偶聯(lián)）的二抗結(jié)合 用ECL發(fā)光或DAB顯色檢測(cè)。如果轉(zhuǎn)印膜上含有靶蛋白，經(jīng)DAB顯色后上出現(xiàn)

4、棕黃色條帶蛋白條帶?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁(yè)，共46頁(yè)vWestern Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針探針”是抗體，是抗體，“顯色顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體載體上的蛋白質(zhì)或多肽

5、作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁(yè)，共46頁(yè)實(shí)驗(yàn)用途v用于檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)是否存在。蛋白質(zhì)是否存在。v對(duì)特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量半定量分析?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁(yè)，共46頁(yè)蛋白免疫印跡組成凝膠電泳凝膠電泳1SDS -聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠電泳，使胺凝膠電泳，使待測(cè)樣品中的蛋待測(cè)樣品

6、中的蛋白質(zhì)按分子量大白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成小在凝膠中分成帶帶2把凝膠中已分成條把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上一種固相支持物上樣品的印跡樣品的印跡3用特異性的抗體檢用特異性的抗體檢測(cè)出已經(jīng)印跡在膜測(cè)出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相上的所要研究的相應(yīng)抗原應(yīng)抗原免疫學(xué)檢測(cè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁(yè)，共46頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟v 提取細(xì)胞或組織蛋白提取細(xì)胞或組織蛋白測(cè)定蛋白含測(cè)定蛋白含量量制備制備SDS-PAGE膠膠蛋白變蛋白變性、上樣性、上樣電泳電泳 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜封閉封閉一一抗抗TBST洗膜洗膜HRP標(biāo)記的二抗標(biāo)記的二抗TBST洗膜洗膜ECL底物顯色底物顯色X光片曝光、顯色光片曝光、

7、顯色結(jié)果分析結(jié)果分析現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁(yè)，共46頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁(yè)，共46頁(yè)二、蛋白樣本的制備和濃度的測(cè)定二、蛋白樣本的制備和濃度的測(cè)定v蛋白的提?。阂话惆ńM織蛋白提取、細(xì)胞蛋白蛋白的提?。阂话惆ńM織蛋白提取、細(xì)胞蛋白的提取的提取 組織蛋白提取組織蛋白提取v組織和裂解液（加入蛋白酶抑制劑，組織和裂解液（加入蛋白酶抑制劑，為防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解）按比例配制）按比例配制-置于玻璃置于玻璃勻漿器中，充分研磨（冰上操作）勻漿器中，充分研磨（冰上操作）4離心，離心，12000rpm，10min取上清分裝取上清分裝1.5ml離心管離心管中中20保存。保存。（低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降

8、解。）v 蛋白酶抑制劑：蛋白酶抑制劑：如PMSF、EDTA、EGTA等，要根據(jù)具體情況具體選擇?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁(yè)，共46頁(yè)注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)v注意個(gè)人防護(hù)。注意個(gè)人防護(hù)。PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道黏膜、眼嚴(yán)重?fù)p害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，一旦眼睛或皮膚接觸了睛及皮膚，一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，立即，立即用大量水沖洗。用大量水沖洗。v所用離心機(jī)需提前預(yù)冷。所用離心機(jī)需提前預(yù)冷。v為防止蛋白降解，所有操作應(yīng)在冰上完成。為防止蛋白降解，所有操作應(yīng)在冰上完成。v吸取蛋白上清液時(shí)，注意不要把沉淀吸上來(lái)。吸取蛋白上清液時(shí)，注意不要把沉淀吸上來(lái)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁(yè)，共46頁(yè)蛋白濃度的測(cè)定蛋白濃度的測(cè)定原因

9、：原因：vWestern Blot作為一項(xiàng)半定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，電作為一項(xiàng)半定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，電泳前，必須對(duì)不同的樣品進(jìn)行總蛋白含量測(cè)定。泳前，必須對(duì)不同的樣品進(jìn)行總蛋白含量測(cè)定。v蛋白質(zhì)總量不足可能妨礙對(duì)目的蛋白的鑒定蛋白質(zhì)總量不足可能妨礙對(duì)目的蛋白的鑒定; 蛋白質(zhì)含量太高則會(huì)使帶形扭曲蛋白質(zhì)含量太高則會(huì)使帶形扭曲,甚至?xí)绊懮踔習(xí)绊懘穗娪痉椒ǖ姆直媪Α４穗娪痉椒ǖ姆直媪Α，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁(yè)，共46頁(yè)方法：方法：v目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮脲法（脲法（Biuret法）、法）、Folin酚試劑法酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法以及考馬斯亮

10、藍(lán)法法）、紫外吸收法以及考馬斯亮藍(lán)法Bradford法）。法）。v目前實(shí)驗(yàn)室測(cè)蛋白濃度都用試劑盒，如目前實(shí)驗(yàn)室測(cè)蛋白濃度都用試劑盒，如BCA法試法試劑盒劑盒.現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁(yè)，共46頁(yè)BCA法工作原理vBCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理與Lowery法相似。即在堿性環(huán)境下蛋白在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中肽鍵結(jié)構(gòu)與質(zhì)分子中肽鍵結(jié)構(gòu)與Cu2+絡(luò)合并將絡(luò)合并將Cu2+還原還原成成Cu1+。BCA特異地與特異地與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nM處有最大光吸收值并處有最大光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，顏色的深淺與蛋白

11、質(zhì)的含與蛋白質(zhì)濃度成正比，顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可以根據(jù)吸收值測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。該量成正比，可以根據(jù)吸收值測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。該測(cè)定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，試劑及其形成的測(cè)定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)去垢劑顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)去垢劑等影響小。等影響小。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁(yè)，共46頁(yè)SDS-PAGE電泳SDS-PAGE電泳法，即十二烷基硫酸鈉電泳法，即十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法。聚丙烯酰胺凝膠電泳法。原理原理v 1在蛋白質(zhì)混合樣品中各蛋白質(zhì)組分的遷移率主要取決于分子在蛋白質(zhì)混合樣品中各蛋白質(zhì)組分的遷移率主要取決于分子大小

12、和形狀以及所帶電荷多少。大小和形狀以及所帶電荷多少。v 2在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），），SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，在一定條件氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合（的結(jié)合（1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)使各種蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不數(shù)量遠(yuǎn)

13、遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。此時(shí)，蛋白質(zhì)分子的電同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。此時(shí)，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其它因素對(duì)電泳泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其它因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十六頁(yè)，共46頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁(yè)，共46頁(yè)實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備設(shè)備和材料的準(zhǔn)備設(shè)備和材料的準(zhǔn)備:v電泳槽的準(zhǔn)備電泳槽的準(zhǔn)備(本實(shí)驗(yàn)用垂直電泳槽本實(shí)驗(yàn)用垂直電泳槽)、電泳儀的、電泳儀的準(zhǔn)備、離心機(jī)、電磁爐、煮鍋、移液槍、槍頭、準(zhǔn)備、離心機(jī)、電磁爐、煮鍋、移液槍、槍頭、燒杯、

14、量筒燒杯、量筒試劑的準(zhǔn)備和配置試劑的準(zhǔn)備和配置:v雙蒸水、雙蒸水、30%丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris-HCl(PH為為8.8)、Tris-HCl(PH為為6.8)、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨(AP)、TEMED、電泳上樣緩沖、電泳上樣緩沖液、電泳緩沖液、蛋白液、電泳緩沖液、蛋白Marker現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁(yè)，共46頁(yè)v 根據(jù)待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)分子量選擇分離膠和濃縮膠的濃度根據(jù)待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)分子量選擇分離膠和濃縮膠的濃度.（一般濃縮膠為（一般濃縮膠為5%，分離膠根據(jù)所測(cè)蛋白分子量定），分離膠根據(jù)所測(cè)蛋白分子量定）凝膠濃度（）線(xiàn)性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-

15、945.057-212現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁(yè)，共46頁(yè)作用作用v濃縮膠：當(dāng)樣品上樣并接通兩極間電流后濃縮膠：當(dāng)樣品上樣并接通兩極間電流后(電泳槽電泳槽的上方為負(fù)極，下方為正極的上方為負(fù)極，下方為正極)，在凝膠中形成移動(dòng)，在凝膠中形成移動(dòng)界面并帶動(dòng)凝膠中所含界面并帶動(dòng)凝膠中所含SDS負(fù)電荷的多肽復(fù)合物負(fù)電荷的多肽復(fù)合物向正極推進(jìn)。樣品首先通過(guò)高度多孔性的濃縮膠，向正極推進(jìn)。樣品首先通過(guò)高度多孔性的濃縮膠，使樣品中所含使樣品中所含SDS 多肽復(fù)合物在分離膠表面聚多肽復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱(chēng)積層）（集成一條很薄的區(qū)帶（或稱(chēng)積層）（0.5-1cm）。）。v分離膠：由于膠孔徑小，而且成

16、為一個(gè)整體的篩分離膠：由于膠孔徑小，而且成為一個(gè)整體的篩狀結(jié)構(gòu)，它們對(duì)大分子阻力大，小分子阻力小，狀結(jié)構(gòu)，它們對(duì)大分子阻力大，小分子阻力小，起著分子篩效應(yīng)，也就是蛋白質(zhì)在分離膠中，以起著分子篩效應(yīng)，也就是蛋白質(zhì)在分離膠中，以分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)而出現(xiàn)遷移率的差異，最分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)而出現(xiàn)遷移率的差異，最終達(dá)到彼此分開(kāi)。終達(dá)到彼此分開(kāi)。(PH為為8.8)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁(yè)，共46頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 組裝組裝SDS-PAGE凝膠用玻璃槽凝膠用玻璃槽 配制和灌注分離膠配制和灌注分離膠 用水壓線(xiàn)用水壓線(xiàn)30-40分鐘直至分離膠凝固分鐘直至分離膠凝固 倒掉壓線(xiàn)水配制和灌注濃縮膠倒掉壓線(xiàn)水配制和灌注

17、濃縮膠 插入樣品梳插入樣品梳 凝膠直至濃縮膠凝固凝膠直至濃縮膠凝固 制備樣品制備樣品樣品樣品:上樣緩沖液上樣緩沖液=4:1,混勻混勻1000C加熱加熱5分鐘分鐘,離心取上清離心取上清) 拔出樣品梳拔出樣品梳 加入電泳緩沖液加入電泳緩沖液,上樣，電泳上樣，電泳 電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止夾心式垂直電泳槽夾心式垂直電泳槽現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁(yè)，共46頁(yè)蛋白變性的原因蛋白變性的原因v上樣蛋白為蛋白樣本和上樣緩沖液的混合上樣蛋白為蛋白樣本和上樣緩沖液的混合物，按比例配制，物，按比例配制，100煮煮5min。v其目的是將其目的是將SDS 與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋與蛋白質(zhì)

18、充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)同時(shí)使白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)同時(shí)使整個(gè)蛋白帶上負(fù)電荷。整個(gè)蛋白帶上負(fù)電荷?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁(yè)，共46頁(yè)v 玻璃板要清潔玻璃板要清潔,對(duì)齊卡嚴(yán)，防止漏膠。對(duì)齊卡嚴(yán)，防止漏膠。v 丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在聚合前具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在聚合前具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，其作用具有累積性，故稱(chēng)量或配膠時(shí)應(yīng)戴易吸附于皮膚，其作用具有累積性，故稱(chēng)量或配膠時(shí)應(yīng)戴手套及口罩手套及口罩 .v 過(guò)硫酸銨會(huì)緩慢分解，應(yīng)隔周新鮮配制過(guò)硫酸銨會(huì)緩慢分解，應(yīng)隔周新鮮配制.v 溶液中一旦加入溶液中一旦加入TEMED，應(yīng)立即混勻并快速

19、灌注入玻璃夾槽中，應(yīng)立即混勻并快速灌注入玻璃夾槽中 .v 濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液(PH為為6.8)、分離膠緩沖液、分離膠緩沖液(PH8.8)，PH值要值要準(zhǔn)確。準(zhǔn)確。v 膠灌入前要充分混勻，灌膠要緩慢膠灌入前要充分混勻，灌膠要緩慢,避免有氣泡的產(chǎn)生避免有氣泡的產(chǎn)生.v 為保持電泳的平衡，在無(wú)樣品孔中也應(yīng)加入適量的電泳上樣為保持電泳的平衡，在無(wú)樣品孔中也應(yīng)加入適量的電泳上樣緩沖液緩沖液. v 正確連接電泳連線(xiàn)（負(fù)極在上，正極在下）以保證蛋白由正確連接電泳連線(xiàn)（負(fù)極在上，正極在下）以保證蛋白由上向下方向電泳。上向下方向電泳?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁(yè)，共46頁(yè)說(shuō)明：說(shuō)明：v 不是所有的蛋白質(zhì)都能用不

20、是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-凝膠電泳法測(cè)定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些凝膠電泳法測(cè)定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測(cè)出的分子量是不可靠的。包括：蛋白質(zhì)用這種方法測(cè)出的分子量是不可靠的。包括：電荷異?；驑?gòu)象異電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。膠原蛋白等。例如組蛋白例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量

21、是21,000，但，但SDS-凝膠電泳測(cè)定的結(jié)果卻是凝膠電泳測(cè)定的結(jié)果卻是35,000。因此，最好至少用。因此，最好至少用兩種方法來(lái)測(cè)定未知樣品的分子量，互相驗(yàn)證。兩種方法來(lái)測(cè)定未知樣品的分子量，互相驗(yàn)證。v 有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如-胰凝乳胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)诘鞍酌福┙M成的，它們?cè)赟DS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對(duì)于這一類(lèi)蛋白質(zhì)，因此，對(duì)于這一類(lèi)蛋白質(zhì)，SDS-凝膠電泳測(cè)定的只是它們的亞基或單條凝膠電泳測(cè)定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子

22、量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測(cè)定其分子量及分子中肽鏈的數(shù)目等，與還必須用其它方法測(cè)定其分子量及分子中肽鏈的數(shù)目等，與SDS-凝膠凝膠電泳的結(jié)果互相參照。電泳的結(jié)果互相參照。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十四頁(yè)，共46頁(yè)v蛋白質(zhì)印跡法就是將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠蛋白質(zhì)印跡法就是將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上。中轉(zhuǎn)移到固相支持物上。v常用的固相支持物有常用的固相支持物有NC （硝酸纖維素）膜、尼（硝酸纖維素）膜、尼龍膜及龍膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。（聚偏氟乙烯）膜。vPVDF（聚偏二氟乙烯）

23、，其具有更好的蛋白吸（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性，價(jià)附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性，價(jià)格比格比NC膜要貴。膜要貴。NC膜更常用。膜更常用?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁(yè)，共46頁(yè)附：附：膜的選擇主要根據(jù)：膜的選擇主要根據(jù)：v膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的膜能結(jié)合蛋白 的載量）的載量）v膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。┯袃煞N規(guī)格：膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。┯袃煞N規(guī)格：0.45um和和0.2um（for MW20kDa)。v不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)（也就是適合用于所選顯不影響后續(xù)的

24、顯色檢測(cè)（也就是適合用于所選顯色方法）色方法）現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十六頁(yè)，共46頁(yè)v 轉(zhuǎn)膜通常有兩種方法：毛轉(zhuǎn)膜通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。細(xì)管印跡法和電泳印跡法。電泳印跡效率更高。這種電泳印跡效率更高。這種方法是用有孔的塑料和有方法是用有孔的塑料和有機(jī)玻璃板將凝膠和硝酸纖機(jī)玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成維素膜夾成三明治三明治形狀，形狀，而后浸入兩個(gè)平行電極中而后浸入兩個(gè)平行電極中間的緩沖液中進(jìn)行電泳，間的緩沖液中進(jìn)行電泳，選擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂蛇x擇適當(dāng)?shù)碾娪痉较蚓涂梢允沟鞍踪|(zhì)離開(kāi)凝膠結(jié)合以使蛋白質(zhì)離開(kāi)凝膠結(jié)合在膜上。轉(zhuǎn)移后的膜就稱(chēng)在膜上。轉(zhuǎn)移后的膜就稱(chēng)為一個(gè)?。橐粋€(gè)印（blot）

25、，用于），用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)。對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十七頁(yè)，共46頁(yè)實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備v設(shè)備和材料的準(zhǔn)備設(shè)備和材料的準(zhǔn)備: 轉(zhuǎn)移電泳槽的準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移電泳槽的準(zhǔn)備(本實(shí)驗(yàn)用垂直電泳槽本實(shí)驗(yàn)用垂直電泳槽)、轉(zhuǎn)移電泳儀的準(zhǔn)備、膜、濾紙、海綿墊、玻璃轉(zhuǎn)移電泳儀的準(zhǔn)備、膜、濾紙、海綿墊、玻璃棒棒v試劑的準(zhǔn)備和配置試劑的準(zhǔn)備和配置:電轉(zhuǎn)液、甲醇（電轉(zhuǎn)液、甲醇（PVDF膜）、（考馬斯亮藍(lán)染色液、麗春紅染色膜）、（考馬斯亮藍(lán)染色液、麗春紅染色液）液）現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十八頁(yè)，共46頁(yè)v根據(jù)待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)分子量選擇轉(zhuǎn)移的電流大根據(jù)待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)分子量選擇轉(zhuǎn)移的電流大小及時(shí)間小及時(shí)間.我

26、們通常我們通常 200mA/膜，按照目的膜，按照目的蛋白蛋白分子大小、膠濃度分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時(shí)間，具體可以根據(jù)選擇轉(zhuǎn)移時(shí)間，具體可以根據(jù)實(shí)際適當(dāng)調(diào)整。實(shí)際適當(dāng)調(diào)整。目的蛋白分子大小目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度膠濃度 轉(zhuǎn)移時(shí)間轉(zhuǎn)移時(shí)間(h) 80-140 8% 1.5-2.0 25-80 10% 1.5 1540 12% 0.75 20 15% 0.5現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十九頁(yè)，共46頁(yè)v NC膜預(yù)處理：（剪裁與膠大小一致的膜預(yù)處理：（剪裁與膠大小一致的NC膜，將其浸入膜，將其浸入1轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移緩沖液平衡移緩沖液平衡5分鐘以上。注意：必須保證分鐘以上。注意：必須保證NC膜始終完全浸于膜始終完

27、全浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中，裁剪時(shí)要戴手套，避免手上蛋白將膜污染。）轉(zhuǎn)移緩沖液中，裁剪時(shí)要戴手套，避免手上蛋白將膜污染。）v 剪裁剪裁6層濾紙，比膠略大，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡后待用，同時(shí)層濾紙，比膠略大，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡后待用，同時(shí)4層海綿墊也用轉(zhuǎn)移液浸泡。層海綿墊也用轉(zhuǎn)移液浸泡。v 取膠：撬開(kāi)玻璃板，將多余的膠切除，把裁好的膠放人轉(zhuǎn)移液中。取膠：撬開(kāi)玻璃板，將多余的膠切除，把裁好的膠放人轉(zhuǎn)移液中。v 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜v 制作制作“三明治三明治”：由夾子的黑板（陰極）側(cè)開(kāi)始，依次為黑板：由夾子的黑板（陰極）側(cè)開(kāi)始，依次為黑板海綿墊片海綿墊片3層濾紙層濾紙膠膠NC膜膜三層濾紙（注意：排除氣泡）三層濾紙（注意：排除氣

28、泡）海綿墊片海綿墊片(陽(yáng)極陽(yáng)極)，扣緊轉(zhuǎn)膜夾板，放入含有轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)，扣緊轉(zhuǎn)膜夾板，放入含有轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中（見(jiàn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移示意圖）。移電泳槽中（見(jiàn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移示意圖）。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十頁(yè)，共46頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十一頁(yè)，共46頁(yè)v 正確連接轉(zhuǎn)移電泳連線(xiàn)，保證電荷由負(fù)極向正正確連接轉(zhuǎn)移電泳連線(xiàn)，保證電荷由負(fù)極向正極流動(dòng)。接通電源，恒壓狀態(tài)下轉(zhuǎn)膜（此步操作極流動(dòng)。接通電源，恒壓狀態(tài)下轉(zhuǎn)膜（此步操作宜在宜在4進(jìn)行）。進(jìn)行）。v小心取出轉(zhuǎn)移膜，做好標(biāo)記，在小心取出轉(zhuǎn)移膜，做好標(biāo)記，在1TBST液中液中漂洗兩次。漂洗兩次。v（用考馬斯亮藍(lán)快速染色液處理凝膠，檢查蛋白（用考馬斯亮藍(lán)快速染色液處

29、理凝膠，檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全轉(zhuǎn)移是否完全,用麗春紅染色液膜用麗春紅染色液膜,檢測(cè)蛋白質(zhì)是檢測(cè)蛋白質(zhì)是否轉(zhuǎn)移到膜上否轉(zhuǎn)移到膜上.）現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十二頁(yè)，共46頁(yè)陰極側(cè)陰極側(cè) 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十三頁(yè)，共46頁(yè)vPVDF膜需膜需100%甲醇預(yù)處理，再用緩沖液平衡，甲醇預(yù)處理，再用緩沖液平衡，才能用。才能用。v必須保證必須保證NC膜始終完全浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中膜始終完全浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中,濾紙濾紙要充分浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中要充分浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中.v操作要輕，避免膠膜的破損。操作要輕，避免膠膜的破損。v記住記住“黑面膠，白面膜黑面膠，白面膜”，夾子的黑面朝架子的，夾子的黑面朝架子的黑面。黑面。v必須保證必須保證

30、“三明治三明治”各層之間均無(wú)氣泡。各層之間均無(wú)氣泡。v電轉(zhuǎn)移時(shí)最好為恒流電轉(zhuǎn)移時(shí)最好為恒流,電轉(zhuǎn)移的時(shí)間和電流大小取電轉(zhuǎn)移的時(shí)間和電流大小取決于凝膠的厚度和蛋白質(zhì)分子量的大小決于凝膠的厚度和蛋白質(zhì)分子量的大小.分子量大分子量大,電流稍大時(shí)間長(zhǎng)電流稍大時(shí)間長(zhǎng);分子量大分子量大,電流小時(shí)間短電流小時(shí)間短;v注意做好膜上的標(biāo)記。注意做好膜上的標(biāo)記?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十四頁(yè)，共46頁(yè)v轉(zhuǎn)移結(jié)束后，借助抗原抗體反應(yīng)，利用轉(zhuǎn)移結(jié)束后，借助抗原抗體反應(yīng)，利用ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光）發(fā)光或（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光）發(fā)光或DAB（3,3二氨基二氨基聯(lián)苯胺）顯色技術(shù)檢測(cè)目的蛋白。聯(lián)苯胺）顯色技術(shù)檢測(cè)目的蛋白。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十

31、五頁(yè)，共46頁(yè)vDAB顯色原理：DAB在在HRP作用下形成紅褐色作用下形成紅褐色不溶產(chǎn)物不溶產(chǎn)物 ，從而指示目的蛋白位置及強(qiáng)弱。，從而指示目的蛋白位置及強(qiáng)弱。vECL試劑采用氧化還原反應(yīng)的原理：利用二抗上利用二抗上標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，使底物發(fā)生氧化，使底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而發(fā)出熒光。還原反應(yīng)，從而發(fā)出熒光。vECL發(fā)光相對(duì)于發(fā)光相對(duì)于DAB顯色而言，具有發(fā)光持久，顯色而言，具有發(fā)光持久，靈敏度高靈敏度高(一般可達(dá)到一般可達(dá)到pg級(jí)以上級(jí)以上 )等優(yōu)點(diǎn)，且等優(yōu)點(diǎn)，且DAB具有致癌性。具有致癌性?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十六頁(yè)，共46頁(yè)v ECL結(jié)果結(jié)果 DAB結(jié)果結(jié)果

32、 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十七頁(yè)，共46頁(yè) 1.設(shè)備和材料的準(zhǔn)備設(shè)備和材料的準(zhǔn)備:v 洗膜用平皿洗膜用平皿v 搖床搖床v ECL發(fā)光所需發(fā)光所需(避光盒、避光盒、X-光片、光片、X-光片曝光盒等光片曝光盒等) 2.試劑的準(zhǔn)備和配置試劑的準(zhǔn)備和配置:v 封閉液封閉液(5%脫脂奶粉、脫脂奶粉、BSA、WesternBlot 膜封閉液）膜封閉液） v 一抗一抗v 二抗二抗v 抗體稀釋液抗體稀釋液 v TBST緩沖液緩沖液v ECL試劑盒或試劑盒或DAB試劑盒試劑盒現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十八頁(yè)，共46頁(yè)v 1、封閉：將轉(zhuǎn)移后的膜浸入封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動(dòng)封閉、封閉：將轉(zhuǎn)移后的膜浸入封閉液中，室溫、搖床上緩慢

33、搖動(dòng)封閉1h（或（或4過(guò)夜）；（封閉硝酸纖維素膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，使抗過(guò)夜）；（封閉硝酸纖維素膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，使抗體只能跟特異的蛋白結(jié)合）體只能跟特異的蛋白結(jié)合）v 2.一抗反應(yīng)一抗反應(yīng) 將一抗用抗體稀釋液稀釋到所需濃度；將一抗用抗體稀釋液稀釋到所需濃度； 將封閉后的膜放入一抗工作液中，將封閉后的膜放入一抗工作液中，4反應(yīng)過(guò)夜反應(yīng)過(guò)夜(或或37,2小時(shí)小時(shí))。v 3.洗膜洗膜 將膜從一抗中取出，將膜從一抗中取出，TBST洗滌洗滌10min3，室溫下緩慢搖動(dòng)洗滌。，室溫下緩慢搖動(dòng)洗滌。v 4.二抗反應(yīng)二抗反應(yīng) 將二抗用抗體稀釋液稀釋到所需濃度。將二抗用抗體稀釋液稀釋到所需濃度。 將膜放入二抗工作液中室溫將膜放入二抗工作液中室溫30min。v 5.洗膜洗膜 TBST洗滌洗滌