抗原抗體的反應(yīng)

1、第七章第七章 抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用n免疫沉淀與免疫凝集免疫沉淀與免疫凝集n免疫標記免疫標記n免疫定位分析免疫定位分析n抗原抗體反應(yīng)的其他應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)的其他應(yīng)用n免疫分析方法是利用抗原與抗體特異性反應(yīng)的特性對免疫分析方法是利用抗原與抗體特異性反應(yīng)的特性對抗原或抗體進行量或質(zhì)的測定分析。這類分析方法具抗原或抗體進行量或質(zhì)的測定分析。這類分析方法具有特異、靈敏和快速的特點，有的可以表現(xiàn)出一個氨有特異、靈敏和快速的特點，有的可以表現(xiàn)出一個氨基酸分子的差異，如用單克隆抗體進行檢測的方法；基酸分子的差異，如用單克隆抗體進行檢測的方法；測定的量可以達到測定的量可以達到g甚至甚至ng的水平

2、，如的水平，如ELISA法，法，放射免疫法等；反應(yīng)在幾小時，幾分鐘甚至更短的時放射免疫法等；反應(yīng)在幾小時，幾分鐘甚至更短的時間可以看到測定的結(jié)果，如免疫沉淀法等。間可以看到測定的結(jié)果，如免疫沉淀法等。n這類免疫分析的方法可以用于醫(yī)學(xué)，免疫學(xué)中抗原抗這類免疫分析的方法可以用于醫(yī)學(xué)，免疫學(xué)中抗原抗體的分析體的分析(包括病原的診斷，免疫細胞表面分子的檢包括病原的診斷，免疫細胞表面分子的檢測等測等)，而且可以廣泛的用于生命科學(xué)的幾乎各個領(lǐng)，而且可以廣泛的用于生命科學(xué)的幾乎各個領(lǐng)域，甚至于食品科學(xué)，環(huán)境科學(xué)及分析化學(xué)等更為廣域，甚至于食品科學(xué)，環(huán)境科學(xué)及分析化學(xué)等更為廣泛的學(xué)科領(lǐng)域。泛的學(xué)科領(lǐng)域。n一、

3、免疫沉淀與免疫凝集一、免疫沉淀與免疫凝集n1溶液中的沉淀反應(yīng)溶液中的沉淀反應(yīng) 在體外，當(dāng)抗體與相應(yīng)抗原二者濃度比例適當(dāng)時，會發(fā)生在體外，當(dāng)抗體與相應(yīng)抗原二者濃度比例適當(dāng)時，會發(fā)生免疫沉淀免疫沉淀(immunoprecipitation)反應(yīng)，表明兩者之間有特反應(yīng)，表明兩者之間有特異性反應(yīng)。免疫沉淀反應(yīng)廣泛用于抗原或抗體的定性及定量異性反應(yīng)。免疫沉淀反應(yīng)廣泛用于抗原或抗體的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易觀察判斷，利用抗原和抗體分析。在液相中形成的沉淀不易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于判斷，即環(huán)狀沉淀試驗溶液之間的界面形成的沉淀線便于判斷，即環(huán)狀沉淀試驗(ring

4、precipitant test)(圖圖7l0)。沉淀試驗可以在玻璃管中。沉淀試驗可以在玻璃管中進行，將小試管或毛管的底部加入抗原溶液，在上層輕輕鋪進行，將小試管或毛管的底部加入抗原溶液，在上層輕輕鋪上不同稀釋倍數(shù)的抗體溶液，勿使界面破壞，為了使界面更上不同稀釋倍數(shù)的抗體溶液，勿使界面破壞，為了使界面更好地形成，常在下層抗原溶液中加入好地形成，常在下層抗原溶液中加入10的蔗糖或甘油。的蔗糖或甘油。抗原抗體溶液置于抗原抗體溶液置于37或或4孵育后，在界面上形成白色沉孵育后，在界面上形成白色沉淀線。玻片上沉淀的形成必須在顯微鏡下觀察。淀線。玻片上沉淀的形成必須在顯微鏡下觀察。2.凝膠擴散沉淀凝膠擴

5、散沉淀 抗原抗體可在半透明的半固相介質(zhì)中進抗原抗體可在半透明的半固相介質(zhì)中進行沉淀實驗?？乖肿雍涂贵w分子在凝膠行沉淀實驗?？乖肿雍涂贵w分子在凝膠介質(zhì)中自由擴形成濃度梯度，抗原與抗體介質(zhì)中自由擴形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的一定擴散部位相遇形成沉淀在比例合適的一定擴散部位相遇形成沉淀線。凝膠沉淀可用于測定抗原或抗體的相線。凝膠沉淀可用于測定抗原或抗體的相對濃度，也可用于比較不同抗原的特異性、對濃度，也可用于比較不同抗原的特異性、純度及相互關(guān)系。最常用的方法為純度及相互關(guān)系。最常用的方法為單向免單向免疫擴散疫擴散(radial immuno diffusion )和和雙向雙向免疫擴散免疫

6、擴散(doubleimmunodiffusion)。單向擴散法又稱單向擴散法又稱Mancini Mancini 法，將適當(dāng)濃度的抗體法，將適當(dāng)濃度的抗體混于瓊脂混于瓊脂(0(08 811) )中，瓊脂凝中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔開始向固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔開始向周圍擴散，并在小孔周圍合適的位置形成沉周圍擴散，并在小孔周圍合適的位置形成沉淀環(huán)。沉淀環(huán)的面積與抗原濃度呈正相關(guān)。通過淀環(huán)。沉淀環(huán)的面積與抗原濃度呈正相關(guān)。通過與已知抗原濃度形成的沉淀環(huán)面積進行比較，可與已知抗原濃度形成的沉淀環(huán)面積進行比較，可確定被測抗原的濃度確定被測抗原的濃度( (圖圖711)711

7、)。單擴散常用于測。單擴散常用于測定血清中定血清中IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA及補體的含量。及補體的含量。單擴散法的特點使用抗體濃度大，當(dāng)抗原濃度低單擴散法的特點使用抗體濃度大，當(dāng)抗原濃度低于于510g510gmLmL則不適用。則不適用。雙擴散法又稱為雙擴散法又稱為OuchterlonyOuchterlony法，在瓊脂板中抗原和抗法，在瓊脂板中抗原和抗體分別從相鄰的孔中向四周擴散，在抗原孔和抗體孔之體分別從相鄰的孔中向四周擴散，在抗原孔和抗體孔之間二者比例合適的部位形成沉淀線。瓊脂雙擴散常用于間二者比例合適的部位形成沉淀線。瓊脂雙擴散常用于分析抗原間的血清學(xué)關(guān)系和抗體間差異，相鄰孔

8、中不同分析抗原間的血清學(xué)關(guān)系和抗體間差異，相鄰孔中不同抗原與同一抗血清反應(yīng)形成的沉淀線形狀的變化顯示抗抗原與同一抗血清反應(yīng)形成的沉淀線形狀的變化顯示抗原間是否存在共同的抗原決定簇。當(dāng)兩個抗原完全原間是否存在共同的抗原決定簇。當(dāng)兩個抗原完全致致時，兩條沉淀線完全融合時，兩條沉淀線完全融合( (圖圖712A)712A)；如果兩個抗原無；如果兩個抗原無共同抗原決定簇而抗血清中有針對兩種抗原的抗體時，共同抗原決定簇而抗血清中有針對兩種抗原的抗體時，沉淀線互不干擾，呈交叉狀沉淀線互不干擾，呈交叉狀( (圖圖712B)712B)；當(dāng)兩個抗原只；當(dāng)兩個抗原只是部分抗原決定簇相同，還有其他不同的抗原決定簇，是

9、部分抗原決定簇相同，還有其他不同的抗原決定簇，則沉淀線在后者一方形成突出的小刺則沉淀線在后者一方形成突出的小刺( (圖圖712C)712C)。此外，。此外，根據(jù)抗體或抗原的不同，可形成其他不同特征的沉淀線。根據(jù)抗體或抗原的不同，可形成其他不同特征的沉淀線。OuchterlonyOuchterlony法靈敏度不高，形成沉淀線需較長時間法靈敏度不高，形成沉淀線需較長時間(1824h)(1824h)。但在抗原分析方面很有實用價值。但在抗原分析方面很有實用價值。3 3免疫電泳免疫電泳免疫擴散沉淀形成需較長時間，且靈敏度低。免疫電泳免疫擴散沉淀形成需較長時間，且靈敏度低。免疫電泳（immunoelect

10、rphoresis）是利用蛋白質(zhì)在凝膠中電泳遷移）是利用蛋白質(zhì)在凝膠中電泳遷移率不同能被分離開來的特性與免疫擴散結(jié)合一起進行分析的方率不同能被分離開來的特性與免疫擴散結(jié)合一起進行分析的方法。這種方法能提高分辨率和靈敏度。混合的蛋白質(zhì)抗原在法。這種方法能提高分辨率和靈敏度?；旌系牡鞍踪|(zhì)抗原在PH 86時帶負電荷，在電場的作用下，由負極向正極遷移，時帶負電荷，在電場的作用下，由負極向正極遷移，使混合的抗原組分得以分離，而抗體可以通過自由擴散，也可使混合的抗原組分得以分離，而抗體可以通過自由擴散，也可以通過電泳與分離的抗原形成相應(yīng)的特異性沉淀線。從而提高以通過電泳與分離的抗原形成相應(yīng)的特異性沉淀線。

11、從而提高免疫沉淀的靈敏度。常見的免疫電泳方法有血清免疫電泳，火免疫沉淀的靈敏度。常見的免疫電泳方法有血清免疫電泳，火箭電泳和對流免疫電泳箭電泳和對流免疫電泳(又稱電滲析又稱電滲析)。傳統(tǒng)的免疫電泳即指血。傳統(tǒng)的免疫電泳即指血清免疫電泳，將抗原混合物清免疫電泳，將抗原混合物(病人血清病人血清)在凝膠中用電泳分離后，在凝膠中用電泳分離后，沿電冰方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進行雙擴散。沉淀沿電冰方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進行雙擴散。沉淀線的特點顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白線的特點顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白組分的缺少或增加組分的缺少或增加(圖圖713)。

12、火箭電泳火箭電泳(rocket electrophoresis)，為單向免疫擴散與電泳，為單向免疫擴散與電泳結(jié)合的一種方法。已混合有抗體的凝膠上，做一小孔，加入結(jié)合的一種方法。已混合有抗體的凝膠上，做一小孔，加入抗原，電泳后，沿著電泳方向形成火箭型沉淀線，沉淀線的抗原，電泳后，沿著電泳方向形成火箭型沉淀線，沉淀線的高度與抗原量成正比高度與抗原量成正比(圖圖714)。火箭電泳可用于定量測定，?；鸺娪究捎糜诙繙y定，例如用于測定人血清中的甲胎蛋白。例如用于測定人血清中的甲胎蛋白。4.免疫共沉淀免疫共沉淀 免疫利用共沉淀是抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細免疫利用共沉淀是抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)

13、合以及細菌蛋白質(zhì)的菌蛋白質(zhì)的“protein A/G特異性地結(jié)合到抗體特異性地結(jié)合到抗體(免疫球蛋白免疫球蛋白)的的FC片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。目前多用片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。目前多用protein A/G預(yù)先結(jié)預(yù)先結(jié)合在合在argarose beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的上的prorein A/G就能達到吸附抗原的目的。通過低速離就能達到吸附抗原的目的。通過低速離心，可以從含有目的抗原的溶液中將目的抗原與其它抗原分離。心，可以從含有目的抗原的溶液中將目的抗原與其它抗原分離。 二、免疫標記二、免疫標記1放射免疫分析放射免

14、疫分析放射免疫分析法放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)的應(yīng)用始于的應(yīng)用始于60年年代末，廣泛用于激素、藥物等小分子化合物的定量分析，是靈敏、代末，廣泛用于激素、藥物等小分子化合物的定量分析，是靈敏、可靠的免疫分析方法之一。常用來標記抗原或抗體的同位素有可靠的免疫分析方法之一。常用來標記抗原或抗體的同位素有125I，131I，3H和和35S。放射活性的檢測液相反應(yīng)體系用液體閃。放射活性的檢測液相反應(yīng)體系用液體閃爍儀計數(shù)，而固相體系可用爍儀計數(shù)，而固相體系可用X射線膠片顯影。射線膠片顯影。125I 為為 射線射線(0.035meV)，131I 有硬有硬 射線射線(0.608

15、meV)和和 射射線線(0.36meV)兩種，半衰兩種，半衰期為期為60 d，放射性碘標記常用氯胺，放射性碘標記常用氯胺T法法(chloraminesT)。氯胺。氯胺T是氯代酰胺類氧化劑，在水中不穩(wěn)定，產(chǎn)生的氯離子將碘離子是氯代酰胺類氧化劑，在水中不穩(wěn)定，產(chǎn)生的氯離子將碘離子(I-)氧化為單質(zhì)碘氧化為單質(zhì)碘(I2)，單質(zhì)碘與抗原或抗體分子上的苯丙氨酸及，單質(zhì)碘與抗原或抗體分子上的苯丙氨酸及酪氨酸殘基的苯環(huán)或組氨酸的咪唑基共價相連，使之發(fā)生碘化反酪氨酸殘基的苯環(huán)或組氨酸的咪唑基共價相連，使之發(fā)生碘化反應(yīng)。應(yīng)。氚氚(3H)因其放射性損傷小因其放射性損傷小(軟軟 射線、射線、0.0185meV)，物

16、理半，物理半衰期長衰期長(1226 年年)而生物半衰期短，屬低毒型放射性同位素，而生物半衰期短，屬低毒型放射性同位素，用于標記免疫分子更合適。常用用于標記免疫分子更合適。常用N琥珀酰亞胺琥珀酰亞胺2，33H丙酸酯標記抗原或抗體分子，其活潑酯基易和蛋白質(zhì)的游離丙酸酯標記抗原或抗體分子，其活潑酯基易和蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)氨基反應(yīng)：標記反應(yīng)完成后，需除去未反應(yīng)的放射性試劑和其他產(chǎn)物，一般標記反應(yīng)完成后，需除去未反應(yīng)的放射性試劑和其他產(chǎn)物，一般用電泳，沉淀，離子變換層析，高壓液相層析及超速離心等方法用電泳，沉淀，離子變換層析，高壓液相層析及超速離心等方法將標記物純化，但最方便的方法是凝膠過濾，透析及超

17、濾。將標記物純化，但最方便的方法是凝膠過濾，透析及超濾。放射標記的抗原或抗體可直接用于抗原抗體反應(yīng)，形成的抗原抗放射標記的抗原或抗體可直接用于抗原抗體反應(yīng)，形成的抗原抗體反應(yīng)復(fù)合物，用第體反應(yīng)復(fù)合物，用第抗體或聚乙二醇沉淀分離后，測定其放射抗體或聚乙二醇沉淀分離后，測定其放射活性用于定量抗原或抗體。為了提高靈敏度，應(yīng)用競爭法進行活性用于定量抗原或抗體。為了提高靈敏度，應(yīng)用競爭法進行抗原或抗體定量，其放射活性與被測抗原或抗體呈反比抗原或抗體定量，其放射活性與被測抗原或抗體呈反比(圖圖717)。2 2酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗同位素標記的免疫分析方法，雖然有較高的靈敏度，但同位同位素標記的免

18、疫分析方法，雖然有較高的靈敏度，但同位素具有不穩(wěn)定，需要特殊設(shè)備。安全性差，廢物處理麻煩等素具有不穩(wěn)定，需要特殊設(shè)備。安全性差，廢物處理麻煩等缺點限制了其使用。非放射性標記方法逐步得到發(fā)展，其中缺點限制了其使用。非放射性標記方法逐步得到發(fā)展，其中酶標記免疫試驗是廣泛使用的方法。因酶促反應(yīng)使測定的結(jié)酶標記免疫試驗是廣泛使用的方法。因酶促反應(yīng)使測定的結(jié)果被放大，反應(yīng)的靈敏度接近放射免疫分析法。用于標記的果被放大，反應(yīng)的靈敏度接近放射免疫分析法。用于標記的酶的種類也越來越多，較常用的有堿性磷酸酶酶的種類也越來越多，較常用的有堿性磷酸酶(alkalinephosphatase(alkalinephos

19、phatase) )、辣根過氧化物、辣根過氧化物(horseradish (horseradish peroxidaseperoxidase) )、半乳糖苷酶半乳糖苷酶galactosidasegalactosidase) )和脲酶和脲酶(urease(urease) )等。酶免疫試驗法等。酶免疫試驗法(enzyme immunoassay(enzyme immunoassay，EIA)EIA)有兩有兩類方法，一類為均相法，即抗原與抗體反應(yīng)后，不必將結(jié)合類方法，一類為均相法，即抗原與抗體反應(yīng)后，不必將結(jié)合的與游離的抗原或抗體分離，就可測定被測分子的含量。如的與游離的抗原或抗體分離，就可測定被測

20、分子的含量。如酶放大免疫分折技術(shù)酶放大免疫分折技術(shù)(enzyme multiplied immunoassay(enzyme multiplied immunoassay，EMIT)EMIT)，將小分子抗原連接在酶分子的活性位點附近，當(dāng)抗體，將小分子抗原連接在酶分子的活性位點附近，當(dāng)抗體與這些抗原結(jié)合后，封閉了酶催化位點，使酶失去活性。與這些抗原結(jié)合后，封閉了酶催化位點，使酶失去活性。如果被測溶液中元相應(yīng)抗體，則酶能催化底物形成產(chǎn)物。同一標記物如果被測溶液中元相應(yīng)抗體，則酶能催化底物形成產(chǎn)物。同一標記物也可以競爭方式檢測抗原的含量，另一類為固相法，即將抗原或抗體也可以競爭方式檢測抗原的含量，另

21、一類為固相法，即將抗原或抗體吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，磁珠等表面，抗原與抗體反應(yīng)吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，磁珠等表面，抗原與抗體反應(yīng)后，將固相與液相分離除去游離的抗原或抗體，而結(jié)合的抗原或抗體后，將固相與液相分離除去游離的抗原或抗體，而結(jié)合的抗原或抗體上被標記的酶仍保持活性，催化底物形成有色產(chǎn)物，即酶聯(lián)免疫吸附上被標記的酶仍保持活性，催化底物形成有色產(chǎn)物，即酶聯(lián)免疫吸附試試(enzymelinked immunosorbent(enzymelinked immunosorbent assay assay，ELISA)ELISA)。ELISAELISA有直接法、間接法及夾心法等不

22、同反應(yīng)方式。直接法有直接法、間接法及夾心法等不同反應(yīng)方式。直接法(direct (direct ELISA)ELISA)是指用酶標記的抗原或抗體直接檢測包被在酶標板上的抗體或抗是指用酶標記的抗原或抗體直接檢測包被在酶標板上的抗體或抗原，被檢抗原或抗體的量與產(chǎn)物顏色成正比原，被檢抗原或抗體的量與產(chǎn)物顏色成正比( (圖圖718A)718A)；間接法；間接法(indirect ELISA)(indirect ELISA)是將酶標記在第二抗體上，當(dāng)抗原與第一抗體結(jié)合后，是將酶標記在第二抗體上，當(dāng)抗原與第一抗體結(jié)合后，再用酶標第二抗體來檢查第一抗體是合與抗原結(jié)合。有酶底物顯色的反再用酶標第二抗體來檢查第

23、一抗體是合與抗原結(jié)合。有酶底物顯色的反應(yīng)為正反應(yīng)，反之為負反應(yīng)應(yīng)為正反應(yīng)，反之為負反應(yīng)( (圖圖718B)718B)。夾心法。夾心法(sandwich ELISA)(sandwich ELISA)先用先用一種未標記的抗體包被酶標板，用于捕獲抗原分子，再用標記的具有相一種未標記的抗體包被酶標板，用于捕獲抗原分子，再用標記的具有相同抗原特性但來源于不同種類動物的抗體與之反應(yīng)。也可用間接法中的同抗原特性但來源于不同種類動物的抗體與之反應(yīng)。也可用間接法中的第二抗體進行該項反應(yīng)第二抗體進行該項反應(yīng)( (間接夾心法間接夾心法)()(圖圖718C)718C)。夾心法可用于檢測抗。夾心法可用于檢測抗原，尤其是

24、小分子的抗原，也可以用于檢測抗體。原，尤其是小分子的抗原，也可以用于檢測抗體。 用酶標記的第二抗體進行間接用酶標記的第二抗體進行間接ELISAELISA，避免了用酶標記每一種抗原，避免了用酶標記每一種抗原或抗體的復(fù)雜過程，因而得到更廣泛的應(yīng)用。常用的羊抗鼠或抗體的復(fù)雜過程，因而得到更廣泛的應(yīng)用。常用的羊抗鼠IgGIgG、羊抗、羊抗免免IgGIgG 及羊抗人及羊抗人IgGIgG 的酶交聯(lián)物已經(jīng)商品化，可根據(jù)需要選擇合適酶的酶交聯(lián)物已經(jīng)商品化，可根據(jù)需要選擇合適酶標第二抗體。不同的酶催化的底物不同，顯色產(chǎn)物的吸收波長也不一標第二抗體。不同的酶催化的底物不同，顯色產(chǎn)物的吸收波長也不一樣樣( (表表1

25、74)174)。酶標比色儀呵進行光吸收的測量。酶標比色儀呵進行光吸收的測量。 斑點酶免疫試驗斑點酶免疫試驗(dotELISA)(dotELISA)：ELISA ELISA 一般是在液相中進行酶底一般是在液相中進行酶底物顯色反應(yīng)的，所以反應(yīng)產(chǎn)物都是有色的可溶性化合物，便于用光吸物顯色反應(yīng)的，所以反應(yīng)產(chǎn)物都是有色的可溶性化合物，便于用光吸收法測定反應(yīng)的強度。收法測定反應(yīng)的強度。dotELISAdotELISA的原理與普通的原理與普通ELISAELISA相同，只是把相同，只是把反應(yīng)全部移到硝酸纖維素膜上進行，而不是在聚苯乙烯酶標板上進行。反應(yīng)全部移到硝酸纖維素膜上進行，而不是在聚苯乙烯酶標板上進行。

26、即把抗原、第一抗體、第二抗體都依次加到膜上，洗脫未反應(yīng)物及封即把抗原、第一抗體、第二抗體都依次加到膜上，洗脫未反應(yīng)物及封閉反應(yīng)物以外的膜表面都與普通閉反應(yīng)物以外的膜表面都與普通ELISAELISA相同。最后的顯色反應(yīng)是用另相同。最后的顯色反應(yīng)是用另外一類底物，這類底物反應(yīng)的產(chǎn)物是不溶于水的有色沉淀物，如堿性外一類底物，這類底物反應(yīng)的產(chǎn)物是不溶于水的有色沉淀物，如堿性磷酸酶的底物要用磷酸酶的底物要用BCIPBCIPNBTNBT，而不能用，而不能用pNPPpNPP。根據(jù)膜上沉淀物顏色。根據(jù)膜上沉淀物顏色有無與深淺判斷反應(yīng)的正負和量的多少。斑點掃描儀也可以幫助定量。有無與深淺判斷反應(yīng)的正負和量的多少

27、。斑點掃描儀也可以幫助定量。dotELISAdotELISA的優(yōu)點是靈敏度比普通的優(yōu)點是靈敏度比普通ELISAELISA高高1010010100倍，與放射免疫的倍，與放射免疫的靈敏度水平相當(dāng)。靈敏度水平相當(dāng)。3 3熒光與發(fā)光免疫分析熒光與發(fā)光免疫分析 用于標記抗體的熒光化合物有異硫青熒光素用于標記抗體的熒光化合物有異硫青熒光素(FITC)(FITC)和羅和羅丹明丹明(rhodamine(rhodamine) )熒光素等，適用于抗原細胞和組織的定位熒光素等，適用于抗原細胞和組織的定位分析。近年來用稀土元素分析。近年來用稀土元素( (鑭系元素鑭系元素) )的銪離子的銪離子(Eu3+)(Eu3+)、

28、鋱離、鋱離子子(Tb3+)(Tb3+)等代替熒光素標記抗體，將時間分辨技術(shù)引入生物等代替熒光素標記抗體，將時間分辨技術(shù)引入生物檢測領(lǐng)域，建立了時間分辨熒光免疫分析法檢測領(lǐng)域，建立了時間分辨熒光免疫分析法(time(timeresolved fluorommunoassayresolved fluorommunoassay，TrFIATrFIA) )，明顯提高了熒光免，明顯提高了熒光免疫分析技術(shù)的靈敏度和特異性。疫分析技術(shù)的靈敏度和特異性。 TrFIATrFIA的測定原理與熒光免疫分析法不同，當(dāng)銪離子螯的測定原理與熒光免疫分析法不同，當(dāng)銪離子螯合物標記抗體后，抗體與固相化的特異性抗原結(jié)合，抗體上

29、合物標記抗體后，抗體與固相化的特異性抗原結(jié)合，抗體上的的Eu3+Eu3+在紫外光在紫外光(340nm)(340nm)激發(fā)下，與增強液中的激發(fā)下，與增強液中的二酮體重二酮體重新形成新形成種微膠體螯合物，發(fā)出長壽命的高強度熒光種微膠體螯合物，發(fā)出長壽命的高強度熒光(613nm)(613nm)，比未激發(fā)時增強了，比未激發(fā)時增強了100 100 萬倍萬倍( (圖圖719)719)，可用時間，可用時間分辨熒光計記錄下來。分辨熒光計記錄下來。 稀土元素的熒光激發(fā)波長范圍較寬稀土元素的熒光激發(fā)波長范圍較寬300300380nm)380nm)，有利于增高激發(fā)能，提高標記抗體的靈敏性；，有利于增高激發(fā)能，提高標

30、記抗體的靈敏性；而發(fā)射波長很窄而發(fā)射波長很窄(613nm)(613nm)，造成激發(fā)波長和發(fā)射波長之，造成激發(fā)波長和發(fā)射波長之間的差別很大間的差別很大(270nm)(270nm)，有利于降低背景，利用干涉濾，有利于降低背景，利用干涉濾片排除散射熒光的干擾。片排除散射熒光的干擾。 稀土元素產(chǎn)生的熒光不但強度高，而且半衰期長稀土元素產(chǎn)生的熒光不但強度高，而且半衰期長(10(10100s)100s)，比普通熒光素高出，比普通熒光素高出5656個數(shù)量級。利個數(shù)量級。利用延遲測量時間可消除來自樣品，試劑等的干擾。稀用延遲測量時間可消除來自樣品，試劑等的干擾。稀土元素用雙功能基團螯合劑，如異硫酸土元素用雙功

31、能基團螯合劑，如異硫酸苯基苯基乙二乙二胺四乙酸可標記至抗體的酪氨酸和組氨酸殘基上。標胺四乙酸可標記至抗體的酪氨酸和組氨酸殘基上。標記方法簡單方便，穩(wěn)定性好，可使用記方法簡單方便，穩(wěn)定性好，可使用1212年的時間。年的時間。 發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析(luminescent immunoassay(luminescent immunoassay，LIR)LIR)也是也是近年發(fā)展起來的一項免疫分析新技術(shù)。用發(fā)光物質(zhì)標記抗近年發(fā)展起來的一項免疫分析新技術(shù)。用發(fā)光物質(zhì)標記抗體或抗原。其反應(yīng)原理與體或抗原。其反應(yīng)原理與ELISAELISA、RIARIA、FIA FIA 等類似。根據(jù)等類似。根據(jù)發(fā)光物的來

32、源不同，有化學(xué)發(fā)光發(fā)光物的來源不同，有化學(xué)發(fā)光(chemiluminessence(chemiluminessence) )和生物發(fā)光和生物發(fā)光(bioluminescence)(bioluminescence)不同方法。不同方法。 一些化學(xué)發(fā)光劑如熒光醇一些化學(xué)發(fā)光劑如熒光醇(1uminol)(1uminol)，可用于標記抗，可用于標記抗原或抗體，反應(yīng)時發(fā)光劑發(fā)生高能化學(xué)反應(yīng)，形成處于電原或抗體，反應(yīng)時發(fā)光劑發(fā)生高能化學(xué)反應(yīng)，形成處于電子激發(fā)態(tài)的分子，當(dāng)這些產(chǎn)物分子回到基態(tài)時，伴隨著光子激發(fā)態(tài)的分子，當(dāng)這些產(chǎn)物分子回到基態(tài)時，伴隨著光子的釋放，發(fā)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。熒光醇在標記過程中易丟子的釋放

33、，發(fā)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。熒光醇在標記過程中易丟失發(fā)光能力，異熒光醇失發(fā)光能力，異熒光醇(iso1uminol)(iso1uminol)相對更穩(wěn)定一些。一相對更穩(wěn)定一些。一些發(fā)光分子的發(fā)光反應(yīng)需要陽離子或酶的催化，還有一些些發(fā)光分子的發(fā)光反應(yīng)需要陽離子或酶的催化，還有一些化學(xué)發(fā)光分子如吖啶酯化學(xué)發(fā)光分子如吖啶酯 (acridine(acridine ester) ester)則不需催化劑則不需催化劑的作用，只需在酸性條件下用過氧化氫誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光。目的作用，只需在酸性條件下用過氧化氫誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光。目前把化學(xué)發(fā)光劑與發(fā)光增強劑結(jié)合使用，使光強度達到前把化學(xué)發(fā)光劑與發(fā)光增強劑結(jié)合使用，使光強度達到X X光

34、光膠片曝光的要求。膠片曝光的要求。生物發(fā)光常見的反應(yīng)系統(tǒng)為蟲熒素生物發(fā)光常見的反應(yīng)系統(tǒng)為蟲熒素(luciferin(luciferin) )在蟲熒在蟲熒酶酶(lucifase(lucifase) )的催化下，有的催化下，有ATPATP，Mg2+Mg2+及及O2O2存在發(fā)生存在發(fā)生瞬時發(fā)光反應(yīng)：瞬時發(fā)光反應(yīng)：發(fā)光反應(yīng)可用瞬時熒光儀檢測記錄，也可用膠片顯影。發(fā)光反應(yīng)可用瞬時熒光儀檢測記錄，也可用膠片顯影。4 4親和標記的免疫分析親和標記的免疫分析 金黃色葡萄球菌的金黃色葡萄球菌的A A蛋白與蛋白與IgG FcIgG Fc段有高度的親和段有高度的親和力。用酶、同位素、熒光素等標記力。用酶、同位素、熒

35、光素等標記A A蛋白，替代第二抗蛋白，替代第二抗體直接與抗體結(jié)合，可用于抗原抗體反應(yīng)的分析。體直接與抗體結(jié)合，可用于抗原抗體反應(yīng)的分析。A A蛋蛋白對不同種動物來源的白對不同種動物來源的IgGIgG 均有親和性，可用于多數(shù)抗均有親和性，可用于多數(shù)抗原抗體反應(yīng)的分析，但有些動物的原抗體反應(yīng)的分析，但有些動物的IgGIgG 或少數(shù)亞類不與或少數(shù)亞類不與A A蛋白結(jié)合，選擇時應(yīng)注意蛋白結(jié)合，選擇時應(yīng)注意( (見第三章見第三章) )。生物素。生物素(biotin)(biotin)是一種維生素，存在于多種生物組織中，也可以人工合是一種維生素，存在于多種生物組織中，也可以人工合成，能特異性地與來自卵蛋白的

36、親和素成，能特異性地與來自卵蛋白的親和素(avidin(avidin) )或鏈霉或鏈霉菌的鏈親合素菌的鏈親合素(strepavidin(strepavidin) )結(jié)合。生物素與親和素有結(jié)合。生物素與親和素有很高的親和力，比抗原抗體結(jié)合的親和力高很高的親和力，比抗原抗體結(jié)合的親和力高104 104 倍，并倍，并且一個親和素分子可與多個生物素分子結(jié)合。且一個親和素分子可與多個生物素分子結(jié)合。全物素是小分子化合物全物素是小分子化合物( (相對分子質(zhì)量為相對分子質(zhì)量為224)224)，能通過雙功，能通過雙功能連接劑能與抗原、抗體、酶等大分子上氨基、羧基及糖能連接劑能與抗原、抗體、酶等大分子上氨基、羧

37、基及糖基共價結(jié)合?；矁r結(jié)合。個大分子上可以標記數(shù)個生物素分子。鏈個大分子上可以標記數(shù)個生物素分子。鏈親和素是相對分子質(zhì)量為親和素是相對分子質(zhì)量為6 68 8l04l04的大蛋白質(zhì)，可用酶、的大蛋白質(zhì)，可用酶、熒光素等標記。標記后的生物素不影響其與親和素的結(jié)合，熒光素等標記。標記后的生物素不影響其與親和素的結(jié)合，因此在免疫分析中得到廣泛的應(yīng)用。一些不易制備抗體的因此在免疫分析中得到廣泛的應(yīng)用。一些不易制備抗體的生物大分子如核酸及多糖也常用親和素生物大分子如核酸及多糖也常用親和素生物素復(fù)合物生物素復(fù)合物(avidinn(avidinnbiotin complexbiotin complex，AB

38、C)ABC)系統(tǒng)檢測。如用生物素系統(tǒng)檢測。如用生物素標記核酸探針，用于核酸雜交的分析。此外，小分子藥物標記核酸探針，用于核酸雜交的分析。此外，小分子藥物地高辛地高辛(digoxin(digoxin) )也可用于標記許多生物大分子，再用地高也可用于標記許多生物大分子，再用地高辛作半抗原免疫獲得的相應(yīng)抗體進行檢測。用生物素、地辛作半抗原免疫獲得的相應(yīng)抗體進行檢測。用生物素、地高辛等小分子化臺物標記技術(shù)，在分子生物學(xué)實驗中得到高辛等小分子化臺物標記技術(shù)，在分子生物學(xué)實驗中得到廣泛的應(yīng)用，統(tǒng)稱為非放射性標記分析技術(shù)。廣泛的應(yīng)用，統(tǒng)稱為非放射性標記分析技術(shù)。三、免疫定位分析三、免疫定位分析1 1、免疫熒

39、光定位分析、免疫熒光定位分析 由于散射作用及生物材料所含天然熒光會影響熒光免疫分析由于散射作用及生物材料所含天然熒光會影響熒光免疫分析(fluorescence immunoassay(fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA)FIA)的靈敏度和特異性。但不同發(fā)光顏色的熒的靈敏度和特異性。但不同發(fā)光顏色的熒光化合物標記抗體用于免疫細胞化學(xué)光化合物標記抗體用于免疫細胞化學(xué)(immuno(immunocytochemistrycytochemistry) )和免疫組織化和免疫組織化學(xué)學(xué)(immunohistochemistry(immunohistochemistry) )檢測，對

40、某些有生物功能的分子在細胞或組織中檢測，對某些有生物功能的分子在細胞或組織中的表達和定位仍是非常有效的方法之一。的表達和定位仍是非常有效的方法之一。 常用的熒光色素常用的熒光色素(fluorochrome(fluorochrome) )為異硫氰熒光素（為異硫氰熒光素（fluorescein fluorescein isothiocyanateisothiocyanate，F(xiàn)ITC)FITC)和異硫氰四甲基羅丹明和異硫氰四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine(tetramethylrhodamine，TRITC)TRITC)等具有特殊的激發(fā)波長和發(fā)射波長等具有特殊的激發(fā)波長和發(fā)射

41、波長( (表表75)75)。熒光色素用雙功能交聯(lián)劑。熒光色素用雙功能交聯(lián)劑標記至抗體的標記至抗體的FcFc 段不影響其與細胞和組織中的抗原特異性結(jié)合。組織切片或段不影響其與細胞和組織中的抗原特異性結(jié)合。組織切片或細胞樣品處理既要使抗原結(jié)構(gòu)保持完整并且充分暴露，同時也要保持細胞或組細胞樣品處理既要使抗原結(jié)構(gòu)保持完整并且充分暴露，同時也要保持細胞或組織結(jié)構(gòu)的完整性。熒光色素可以標記特異性抗體，也可標記第二抗體，織結(jié)構(gòu)的完整性。熒光色素可以標記特異性抗體，也可標記第二抗體，A A蛋白蛋白或親和素。還可用不同的熒光色素標記不同的抗體，同時進行兩種以上抗原分或親和素。還可用不同的熒光色素標記不同的抗體，

42、同時進行兩種以上抗原分子的定位。熒光通過熒光顯微鏡來觀察，組織切片和細胞上的熒光暴露在紫外子的定位。熒光通過熒光顯微鏡來觀察，組織切片和細胞上的熒光暴露在紫外光下，會迅速衰弱成淬滅，因此觀察時要迅速，用熒光分析電腦軟件進行記錄光下，會迅速衰弱成淬滅，因此觀察時要迅速，用熒光分析電腦軟件進行記錄分析可以得到更為準確而清晰的納果。分析可以得到更為準確而清晰的納果。用熒光抗體鑒別淋巴細胞亞群，尤其是用熒光抗體鑒別淋巴細胞亞群，尤其是CD4+CD4+和和CD8+TCD8+T細胞細胞亞群，在臨床上具有重要意義。用熒光抗體標記的不同亞群，在臨床上具有重要意義。用熒光抗體標記的不同淋巴細胞亞群，根據(jù)熒光強度

43、及種類的差異用流式細胞淋巴細胞亞群，根據(jù)熒光強度及種類的差異用流式細胞儀可將不同細胞群分離，稱為熒光激活細胞分揀器儀可將不同細胞群分離，稱為熒光激活細胞分揀器(fluorescence(fluorescenceactivated cell sorteractivated cell sorter，F(xiàn)ACS)(FACS)(圖圖720)720)。用兩種特異性熒光抗體。用兩種特異性熒光抗體( (抗抗CD4 CD4 和抗和抗CD8)CD8)標記淋標記淋巴細胞，則有巴細胞，則有4 4 種不同標記強度的細胞。細胞通過種不同標記強度的細胞。細胞通過FACS FACS 的噴嘴形成微滴，一個細胞形成一個微滴，當(dāng)其

44、通過激的噴嘴形成微滴，一個細胞形成一個微滴，當(dāng)其通過激發(fā)光束時，產(chǎn)生的熒光信號被檢測到，在記錄的同時，發(fā)光束時，產(chǎn)生的熒光信號被檢測到，在記錄的同時，將信號反饋至下方電極板，電極板根據(jù)熒光的強度和種將信號反饋至下方電極板，電極板根據(jù)熒光的強度和種類使微滴發(fā)生偏向，進入相應(yīng)的收集管中。用類使微滴發(fā)生偏向，進入相應(yīng)的收集管中。用FACS FACS 獲得獲得不同細胞亞群在淋巴細胞所占的比例及數(shù)量，并可收集不同細胞亞群在淋巴細胞所占的比例及數(shù)量，并可收集不同亞群的細胞。不同亞群的細胞。2 2酶標記免疫定位酶標記免疫定位酶標記免疫定位的方法及基本原理與酶標記免疫定位的方法及基本原理與dotELISAdo

45、tELISA相同，所用相同，所用的酶底物在反應(yīng)后必須形成不溶于水的有色產(chǎn)物。酶標記免的酶底物在反應(yīng)后必須形成不溶于水的有色產(chǎn)物。酶標記免疫定位主要用于免疫組織化學(xué)進行組織和細胞內(nèi)的抗原定位疫定位主要用于免疫組織化學(xué)進行組織和細胞內(nèi)的抗原定位及免疫印跡分析以替代同位素標記的試驗。及免疫印跡分析以替代同位素標記的試驗。(1)(1)酶標免疫組織化學(xué)；免疫組織化學(xué)酶標免疫組織化學(xué)；免疫組織化學(xué)(immuuohistochemistry(immuuohistochemistry) )的原理與的原理與dotdotELISAELISA相相同只是固相抗原為組織切片或細胞樣品，用于標記抗體的酶同只是固相抗原為組

46、織切片或細胞樣品，用于標記抗體的酶和酶的底物見表和酶的底物見表7676。 組織切片的制備盡可能保持組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原分子在細組織切片的制備盡可能保持組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原分子在細胞中的天然定位及構(gòu)象，固定過程有助于結(jié)構(gòu)的保護和穩(wěn)定，使蛋白胞中的天然定位及構(gòu)象，固定過程有助于結(jié)構(gòu)的保護和穩(wěn)定，使蛋白質(zhì)肽鏈上的活性基團發(fā)生交聯(lián)并破壞氫鍵。常用的福爾馬林質(zhì)肽鏈上的活性基團發(fā)生交聯(lián)并破壞氫鍵。常用的福爾馬林(40(40甲醛甲醛) )及其衍生物作固定劑，易損壞抗原結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗體的結(jié)合效率降低，及其衍生物作固定劑，易損壞抗原結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗體的結(jié)合效率降低，甚至失去結(jié)合作用。因此采用更溫和的固定方法，

47、同時用蛋白酶如胰甚至失去結(jié)合作用。因此采用更溫和的固定方法，同時用蛋白酶如胰蛋白酶，胃蛋白酶及蛋白酶蛋白酶，胃蛋白酶及蛋白酶K K等酶解處理，破壞蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用，使等酶解處理，破壞蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用，使組織的抗原決定簇充分暴露。石臘包理及一系列脫水過程也易使抗原組織的抗原決定簇充分暴露。石臘包理及一系列脫水過程也易使抗原結(jié)構(gòu)破壞，改用環(huán)氧樹酯包埋可以提高組織結(jié)構(gòu)的分辨率，但仍對抗結(jié)構(gòu)破壞，改用環(huán)氧樹酯包埋可以提高組織結(jié)構(gòu)的分辨率，但仍對抗原結(jié)構(gòu)有破壞作用。組織樣品不經(jīng)過固定處理直接采用冰凍切片技術(shù)，原結(jié)構(gòu)有破壞作用。組織樣品不經(jīng)過固定處理直接采用冰凍切片技術(shù)，對抗原結(jié)構(gòu)的破壞最少，但易導(dǎo)致細胞

48、形態(tài)改變及不能長期保存而受對抗原結(jié)構(gòu)的破壞最少，但易導(dǎo)致細胞形態(tài)改變及不能長期保存而受到限制。此外植物細胞、種子、孢子及花粉等因緊密的細胞壁和其他到限制。此外植物細胞、種子、孢子及花粉等因緊密的細胞壁和其他胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，易干擾酶標記抗體的結(jié)合及顯色產(chǎn)物的形成，須用特殊的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，易干擾酶標記抗體的結(jié)合及顯色產(chǎn)物的形成，須用特殊的方法處理。而培養(yǎng)細胞可直接涂布在玻片上形成單層細胞，不需包埋方法處理。而培養(yǎng)細胞可直接涂布在玻片上形成單層細胞，不需包埋切片處理，直接用于免疫組織化學(xué)反應(yīng)。切片處理，直接用于免疫組織化學(xué)反應(yīng)。(2)免疫印跡：免疫印跡用于體外蛋白質(zhì)抗原的分析。蛋白質(zhì)經(jīng)免疫印跡：免疫印跡用于體

49、外蛋白質(zhì)抗原的分析。蛋白質(zhì)經(jīng)SDSPAGE分離后，不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)不同遷移率，在聚丙烯酰分離后，不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)不同遷移率，在聚丙烯酰胺凝膠胺凝膠(polyacrylamide gel)上形成不同的條帶。這些蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至上形成不同的條帶。這些蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜硝酸纖維膜(nitrocellulose membrane)上，其相對位置和含量與凝膠中保上，其相對位置和含量與凝膠中保持一致。結(jié)合在硝酸纖維膜上的蛋白質(zhì)，類似于固相載體上吸附的抗原，持一致。結(jié)合在硝酸纖維膜上的蛋白質(zhì)，類似于固相載體上吸附的抗原，可用酶標記的抗體進行與可用酶標記的抗體進行與dotELI

50、SA相同的顯色反應(yīng)，確定目的蛋白質(zhì)的相同的顯色反應(yīng)，確定目的蛋白質(zhì)的有無或相對分子質(zhì)量的大小有無或相對分子質(zhì)量的大小(圖圖721)。免疫印跡分析中標記抗體所用的酶。免疫印跡分析中標記抗體所用的酶及相應(yīng)底物與免疫組織化學(xué)相同，此外也可以用同位素標記或者非同位素及相應(yīng)底物與免疫組織化學(xué)相同，此外也可以用同位素標記或者非同位素的的ABC系統(tǒng)等進行標記以提高方法的靈敏度。免疫印跡法常用于生物工程系統(tǒng)等進行標記以提高方法的靈敏度。免疫印跡法常用于生物工程中表達的一些微量蛋白質(zhì)的檢測。中表達的一些微量蛋白質(zhì)的檢測。3免疫電子顯微鏡技術(shù)免疫電子顯微鏡技術(shù) 免疫電子顯微鏡免疫電子顯微鏡(immunoelect

51、romicroscope，IEM)技術(shù)是電子顯微鏡技術(shù)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)是電子顯微鏡技術(shù)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的項技術(shù)，大大項技術(shù)，大大提高了電鏡觀察的特異性。形態(tài)相同，但結(jié)構(gòu)和組成不相同提高了電鏡觀察的特異性。形態(tài)相同，但結(jié)構(gòu)和組成不相同的生物粒子，如細胞器，病毒顆粒等用免疫電鏡能有效地區(qū)的生物粒子，如細胞器，病毒顆粒等用免疫電鏡能有效地區(qū)分，尤其是對病毒等大顆?？乖Ｗ雍图毎⒔Y(jié)構(gòu)的觀察。分，尤其是對病毒等大顆?？乖Ｗ雍图毎⒔Y(jié)構(gòu)的觀察。免疫電子顯微鏡有兩類方法。一類是用抗體直接與所要觀察免疫電子顯微鏡有兩類方法。一類是用抗體直接與所要觀察的抗原顆粒結(jié)合，這種結(jié)合可以在電鏡的銅網(wǎng)上進行

52、。先用的抗原顆粒結(jié)合，這種結(jié)合可以在電鏡的銅網(wǎng)上進行。先用抗體捕捉抗原，再用抗體進行裝飾，或者只用抗體捕捉后用抗體捕捉抗原，再用抗體進行裝飾，或者只用抗體捕捉后用磷鎢酸負染后觀察。這種方法適合于觀察病毒、細菌、細胞磷鎢酸負染后觀察。這種方法適合于觀察病毒、細菌、細胞等大顆粒的抗原，一般不用于抗原的細胞組織定位。另一類等大顆粒的抗原，一般不用于抗原的細胞組織定位。另一類方法是應(yīng)用金標記抗體進行抗原的定位。方法是應(yīng)用金標記抗體進行抗原的定位。 應(yīng)用大小不同的金顆粒應(yīng)用大小不同的金顆粒(直徑直徑l40nm)標記不同特標記不同特異性的抗體，同時可以定位兩種以上的組分或抗原決異性的抗體，同時可以定位兩種

53、以上的組分或抗原決定簇在細胞內(nèi)的分布。根據(jù)金顆粒多少還可以對特異定簇在細胞內(nèi)的分布。根據(jù)金顆粒多少還可以對特異性抗原成分的強度進行估計。金顆粒通過非共價電子性抗原成分的強度進行估計。金顆粒通過非共價電子穩(wěn)定態(tài)吸附標記抗體，金標抗體可像普通抗體一樣直穩(wěn)定態(tài)吸附標記抗體，金標抗體可像普通抗體一樣直接用以大顆?？乖难b飾后觀察，還可用于組織和細接用以大顆?？乖难b飾后觀察，還可用于組織和細胞中抗原的定位觀察，樣品的切片制備要求與免疫組胞中抗原的定位觀察，樣品的切片制備要求與免疫組織化學(xué)相同。膠體金標記的抗體，也可用于光鏡水平織化學(xué)相同。膠體金標記的抗體，也可用于光鏡水平的免疫定位，但金顆粒必須大于的

54、免疫定位，但金顆粒必須大于20nm，標記抗體的濃，標記抗體的濃度較高。金顆粒在光鏡下呈淡紅色，不易識別，用銀度較高。金顆粒在光鏡下呈淡紅色，不易識別，用銀染色液處理后，在金顆粒周圍吸附大量的銀顆粒，呈染色液處理后，在金顆粒周圍吸附大量的銀顆粒，呈黑褐色大大提高了靈敏度，這種技術(shù)稱為免疫金銀黑褐色大大提高了靈敏度，這種技術(shù)稱為免疫金銀染色法染色法(immunogoldsliver staining，IGSS)，多用，多用于細胞表面標志定位，免疫細胞亞群計數(shù)，白血病分于細胞表面標志定位，免疫細胞亞群計數(shù)，白血病分型等。型等。四、抗原抗體反應(yīng)的其他應(yīng)用四、抗原抗體反應(yīng)的其他應(yīng)用1 1免疫親和層析免疫

55、親和層析免疫親和層析免疫親和層析(immunoaffinity(immunoaffinity chromatography) chromatography)是一種從多組分混和物中是一種從多組分混和物中分離純化單組分產(chǎn)物簡便而有效的方法，比凝膠過濾和離子交換層析獲得的分離純化單組分產(chǎn)物簡便而有效的方法，比凝膠過濾和離子交換層析獲得的產(chǎn)物純度更高。免疫球蛋白的氨基在弱堿性條件下產(chǎn)物純度更高。免疫球蛋白的氨基在弱堿性條件下( (如如PH 9PH 96 6的碳酸鹽緩沖的碳酸鹽緩沖液中液中) )能夠與活化的瓊脂糖能夠與活化的瓊脂糖(agarose(agarose) )或葡聚糖或葡聚糖(sepharose

56、(sepharose) )上的琥珀酰胺或上的琥珀酰胺或溴化氰基團交聯(lián)，未被結(jié)合的基團用小分子的羥胺或非特異性蛋白質(zhì)封閉。溴化氰基團交聯(lián)，未被結(jié)合的基團用小分子的羥胺或非特異性蛋白質(zhì)封閉。制備好的親和固相材料用高制備好的親和固相材料用高pHpH和低和低PHPH，高鹽和低鹽的緩沖液反復(fù)平衡，除去，高鹽和低鹽的緩沖液反復(fù)平衡，除去非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)，使親和固相材料穩(wěn)定。親和純化常用兩種方法將特異非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)，使親和固相材料穩(wěn)定。親和純化常用兩種方法將特異性蛋白抗原和非特異性蛋白質(zhì)分離。一種是將待純化樣品與因相基質(zhì)混和，性蛋白抗原和非特異性蛋白質(zhì)分離。一種是將待純化樣品與因相基質(zhì)混和，過濾或離心除去未結(jié)合的雜蛋白，再改變緩沖液條件，使目的蛋白洗脫，這過濾或離心除去未結(jié)合的雜蛋白，再改變緩沖液條件，使目的蛋白洗脫，這種方法稱批量純化法，一次可純化多個樣品。另一種更為常用的方法即柱層種方法稱批量純化法，一次可純化多個樣