堿性磷酸酶的分離提取

1、堿性磷酸酶的提取鑒定朱* 金* 王* 何*堿性磷酸酶堿性磷酸酶 廣泛存在于微生物界和動(dòng)物界。堿性磷酸酶能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，磷酸基團(tuán)從磷酸酯轉(zhuǎn)移到醇、酚或糖等磷酸受體上。 2如何獲取堿性磷酸酶如何獲取堿性磷酸酶 堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（AKPAKP）溶于）溶于30%30%乙醇或乙醇或33%33%丙酮丙酮。但在但在60%60%的乙醇或的乙醇或50%50%丙酮丙酮中則形成沉淀。中則形成沉淀。通過(guò)通過(guò)離心離心可以使可以使AKPAKP和其他蛋白分離，從而和其他蛋白分離，從而得到純化。反復(fù)進(jìn)行純化的操作，可以獲得到純化。反復(fù)進(jìn)

2、行純化的操作，可以獲得較高純度的得較高純度的AKPAKP。3 1.綜合運(yùn)用有機(jī)溶劑沉淀、離心、分光等方法，從組織中分離純化及鑒定特定蛋白質(zhì)的技能。2.掌握堿性磷酸酶制備的操作技術(shù)及鑒定的方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 實(shí)驗(yàn)原理v堿性磷酸酶在堿性堿性環(huán)境中作用于磷酸苯二 鈉，使之水解生成酚和磷酸鹽。酚在堿性堿性溶 液中與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀 氧化形成紅色醌類衍生物，其顏色深淺與 AKP活性成正比。5堿性磷酸酶的提取堿性磷酸酶的提取稱取兔肝稱取兔肝2g2g, ,剪碎后置于玻璃勻漿器中，加入剪碎后置于玻璃勻漿器中，加入0.01 mol/L0.01 mol/L的醋酸鎂及醋酸鈉混合液的醋酸鎂及醋酸鈉混合液4

3、ml4ml, , 進(jìn)行進(jìn)行勻漿。將其轉(zhuǎn)入離心管，并加勻漿。將其轉(zhuǎn)入離心管，并加2ml2ml 0.01 mol/L 0.01 mol/L的的醋酸鎂及醋酸鈉混合液清洗勻漿器，之后將之倒醋酸鎂及醋酸鈉混合液清洗勻漿器，之后將之倒入離心管，與原來(lái)的勻漿液混合。記錄入離心管，與原來(lái)的勻漿液混合。記錄體積體積a a，取，取0.1ml0.1ml作為作為A A液液于于EPEP管，待測(cè)比活性用。管，待測(cè)比活性用。6堿性磷酸酶的提取堿性磷酸酶的提取在離心管中剩余的液體加入在離心管中剩余的液體加入2ml2ml正丁醇，玻璃棒攪正丁醇，玻璃棒攪拌拌 2min2min，室溫放置，室溫放置30min30min，紗布過(guò)濾，置

4、于離心，紗布過(guò)濾，置于離心管。管。7堿性磷酸酶的純化堿性磷酸酶的純化 濾液加入濾液加入等體積的冷丙酮等體積的冷丙酮，邊倒邊搖，混勻后，邊倒邊搖，混勻后3000r/min 5min3000r/min 5min。棄上清棄上清，沉淀用，沉淀用4ml 0.5mol/L 4ml 0.5mol/L Mg(AC)Mg(AC)2 2溶解。記錄溶解。記錄體積體積b b。取。取0.1ml0.1ml作為作為B B液液于于EPEP管，待測(cè)比活性用。管，待測(cè)比活性用。 在懸液中在懸液中緩慢緩慢加入冷加入冷95%95%乙醇使其終體積為乙醇使其終體積為30%30%（0.460.46體積體積），混勻后），混勻后2000r/m

5、in 5min2000r/min 5min，轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管。上清液于另一離心管。 上清液中上清液中緩慢緩慢加入冷加入冷95%95%乙醇使其終體積為乙醇使其終體積為60%60%（0.850.85體積體積），混勻后），混勻后3000r/min 5min3000r/min 5min，沉淀用，沉淀用4ml 0.01M Mg(AC)4ml 0.01M Mg(AC)2 2、NaACNaAC混合液攪拌混懸?；旌弦簲嚢杌鞈摇?堿性磷酸酶的純化堿性磷酸酶的純化 其余懸液中其余懸液中緩慢緩慢加入冷丙酮，使得丙酮的體積分?jǐn)?shù)加入冷丙酮，使得丙酮的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到達(dá)到33%（0.5體積），混勻后體積），混勻后

6、2000r/min 離心離心5min，取上清液丟棄沉淀。取上清液丟棄沉淀。上清液中上清液中緩慢緩慢加入冷丙酮，使丙酮終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到加入冷丙酮，使丙酮終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%(0.34體積），混勻后體積），混勻后3000r/min離心離心15min。沉淀中加入沉淀中加入Tris-醋酸鎂緩沖液醋酸鎂緩沖液5ml，即為純化酶液。，即為純化酶液。作為作為D液液用于比活性測(cè)定。用于比活性測(cè)定。910堿性磷酸酶活性的鑒定堿性磷酸酶活性的鑒定磷酸苯二鈉磷酸苯二鈉 磷酸鹽磷酸鹽 + 酚酚 酚酚 + 4-氨基安替比林氨基安替比林 紅色醌類衍生物紅色醌類衍生物 AKP是一種底物特異性較低，在堿性環(huán)境中能水解是一種底物

7、特異性較低，在堿性環(huán)境中能水解磷酸基團(tuán)。最適磷酸基團(tuán)。最適pH范圍為范圍為8.810, 需要鎂離子作為需要鎂離子作為激活劑。激活劑。AKP 鐵氰化鉀鐵氰化鉀1112 管號(hào)管號(hào) 空白空白 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) A B C D酶液體酶液體 0.1 0.1 0.1 0.1酚標(biāo)準(zhǔn)液酚標(biāo)準(zhǔn)液 0.1Tris-Mg(AC)2 0.1復(fù)合底物復(fù)合底物 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.013 加入底物后加入底物后, 立即混勻立即混勻, 37 準(zhǔn)確準(zhǔn)確15 min后加入后加入0.5%鐵氰化鉀鐵氰化鉀2.0 ml終止反終止反應(yīng)應(yīng), 混勻混勻, 靜置靜置15 min , 510 nm比色比色14 酶活性單位（U/ml)=A樣A標(biāo)*0.1*稀釋倍數(shù)15 蛋白質(zhì)含量測(cè)定基本原理 BCA法16 17 1819人有了知識(shí)，就會(huì)具備各種分析能力，明辨是非的能力。所以我們要勤懇讀書，廣泛閱讀，古人說(shuō)“書中自有黃金屋