細菌鑒定的一般步驟(1)

1、整理ppt細菌鑒定的一般步驟辦公室：綜合樓B419郵箱：整理ppt一、確保菌株的純度n在鑒定菌株之前首先確保菌株的純度確保菌株的純度。n假若菌株沒有純化好，將會做大量的無用功整理ppt二、PCR擴增16S rRNA片段n菌落直接PCR 菌體新鮮、加菌量少、陰性菌較陽性菌容易、退火溫度要高點nDNA擴 PCR 高鹽法或CTAB法提取細菌總DNA DNA量不要加太多 整理ppt三、16S rRNA片段測序nPCR產(chǎn)物直接測序產(chǎn)物直接測序 條帶特異，注意產(chǎn)物的濃度要足夠，不要純化不要純化nPCR產(chǎn)物克隆測序產(chǎn)物克隆測序 挑單菌落，菌液測序或質(zhì)粒測序。 整理ppt四、系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建n首先將所獲得的1

2、6S rRNA片段序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列的比對（序列提交GenBank 獲得登錄號）n從相關(guān)數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)模式種16S rRNA片段序列n采用MEGA 軟件鄰近法做樹整理ppt核酸序列數(shù)據(jù)庫核酸序列數(shù)據(jù)庫n現(xiàn)在比較通用的核酸序列數(shù)據(jù)庫有：現(xiàn)在比較通用的核酸序列數(shù)據(jù)庫有：pGenbank（national institutes of health ）、pRDP。p EMBL（European molecular biology laboratory）、）、pDDBJ（DNA data bank of Japan）整理ppt五、發(fā)育樹的構(gòu)建及作用n確認目標(biāo)菌株跟模式菌株間的遺傳距離n確認目

3、標(biāo)菌株的分類定位n同源性較低，認定可能為新種或新屬，有必要重新擴同源性較低，認定可能為新種或新屬，有必要重新擴增序列克隆測序增序列克隆測序整理ppt六、序列同源性差異分析n16S rRNA序列同源性在大于97% 慎重考慮n16S rRNA序列同源性在97%以下 有做新種的意義n16S rRNA序列同源性在95%以下 有可能是新屬整理ppt新屬的判定依據(jù)n16S rRNA序列同源性在95%以下n擁有該科的共有特性n與相鄰屬的脂肪酸組成及含量有顯著差異n生理生化差異明顯n極性脂成分有差異n注意：判定依據(jù)要根據(jù)實際情況而定注意：判定依據(jù)要根據(jù)實際情況而定整理ppt七、幾個發(fā)育樹例子的分析整理ppt地

4、衣芽孢桿菌模式種的生理生化特性整理pptn分類在一個支上，同源性大于99%，初步判定為地衣芽孢桿菌 n生理生化特性的分析等nDNA雜交(實際情況而定)整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt確定菌株種屬n首先確定菌株屬的定位（與同屬模式菌株數(shù)據(jù)的比較）查閱文獻到IJSEM雜志閱讀鄰近種屬的分類文章整理ppt形態(tài)學(xué)分析n菌落形態(tài)菌株 wd的LB平板菌落照片整理pptn菌體照片間的比較菌株 wd掃描電鏡照片整理pptStarkeya koreensisLm et al. IJSEM (2006), 56, 24092414整理pptAncylobacter rudongensi

5、sIJSEM (2004), 54, 385388整理pptAngulomicrobium amanitiformeIJSEM (2004), 54, 651657整理ppt生理生化性質(zhì)IJSEM (2004), 54, 651657整理ppt選擇模式種進行實驗n菌種 15561 Angulomicrobium amanitifo 培養(yǎng)基編號： 1 830n菌種 5895 Angulomicrobium tetraedrale 培養(yǎng)基編號： 628n菌種 18406 Starkeya novella 培養(yǎng)基編號： 830菌株送國際菌種保藏中心保藏菌株送國際菌種保藏中心保藏整理ppt細胞壁脂肪酸（與模式種同步試驗）整理pptn測定G+C含量整理pptDNA-DNA雜交同源性測定整理pptnAPI實驗進行生理生化的特性的獲得n“Biolog”鑒定系統(tǒng)進行糖代謝的特性研究整理ppt生理生化特性總結(jié)Lm et al. IJSE