生物化學(xué)的生物合成4學(xué)時(shí)

1、生生生生物物物物化化化化學(xué)學(xué)學(xué)學(xué)課課課課程程程程 課課課課件件件件 上上上上傳傳傳傳至至至至網(wǎng)網(wǎng)網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)絡(luò)絡(luò)絡(luò) 信信信信息息息息的的的的傳傳傳傳遞遞遞遞 宋千成宋千成 生物學(xué)發(fā)展生物學(xué)發(fā)展 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity ngineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 達(dá)爾文（達(dá)爾文（C.R.Darwin） （1809.2.121882.4.19） 孟德爾（孟德爾（G.J.Mendel) (1822.7.20-1884.1.6) 航行。 于1865年發(fā)現(xiàn)遺傳定

2、律，被稱為“現(xiàn) 以博物學(xué)家的 參加了五年的 在動(dòng)植物和地質(zhì)方面進(jìn)行了大量的觀察和 ，經(jīng)過綜合探討，形成了生物進(jìn)化的 代遺傳學(xué)之父(father of modern genetics）” 。 概念。1859年 了物種 。 Institute of Genetic Engineering Institute of Genetic Engineering DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity Maurice Wilkins, Max Perutz, Francis Crick, John Steinbec

3、k, James Watson and John Kendrew were the Nobel Prize winners in 1962. Max Perutz （19142002） 他做出這個(gè) 發(fā)現(xiàn)的部分 是他從 錯(cuò)誤地錯(cuò)誤地 努力工作和努力思考努力工作和努力思考， 他總是拒絕將它們相互取代，這樣他當(dāng)然有時(shí)間打網(wǎng)球和追求 子。 Institute of Genetic Engineering DNADNA克隆、克隆、 與重組技術(shù)的歷史與重組技術(shù)的歷史 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity Paul Berg Herbert Boy

4、er and Stanley Cohen 1972 Paul Berg 構(gòu)建了世界上第一個(gè)構(gòu)建了世界上第一個(gè)DNA重組重組 1973年，年，Stanley Cohen等人首次獲得體外重組等人首次獲得體外重組DNA的的 克隆克隆 Institute of Genetic Engineering DNADNA克隆、克隆、 與重組技術(shù)的歷史與重組技術(shù)的歷史 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity Herbert Boyer and Robert Swanson 1976年世界上第一家年世界上第一家 工程公司工程公司 Genentech創(chuàng)立創(chuàng)立

5、 Institute of Genetic Engineering DNADNA克隆、克隆、 與重組技術(shù)的歷史與重組技術(shù)的歷史 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 1977年年Genentech公司公司 實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中表達(dá)人類蛋白質(zhì)（生長(zhǎng)激實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中表達(dá)人類蛋白質(zhì)（生長(zhǎng)激 素抑制素），首次實(shí)現(xiàn)在其他物種中表達(dá)人類蛋白質(zhì)。素抑制素），首次實(shí)現(xiàn)在其他物種中表達(dá)人類蛋白質(zhì)。 隨后生產(chǎn)出人胰島素（隨后生產(chǎn)出人胰島素（1978），生長(zhǎng)素），生長(zhǎng)素（1979），干擾素（），干擾素（1980）。）。 1980年美國(guó)高等年美國(guó)高等 批準(zhǔn)

6、了批準(zhǔn)了 工程技術(shù)的專利。工程技術(shù)的專利。 1985年年Genentech公司將第一個(gè)公司將第一個(gè) 人胰島素推向了市場(chǎng)。人胰島素推向了市場(chǎng)。 工程工程 neering DNADNA克隆、克隆、 與重組技術(shù)的歷史與重組技術(shù)的歷史 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 1977年，年， Walter Gilbert和和Allan Maxam 的化學(xué)裂解的化學(xué)裂解DNA sequencing） 法問世（法問世（Maxam-Gilbert 同年，同年，Sanger 等的雙脫氧等的雙脫氧 法（法（ Sanger dideoxy method）

7、（Sanger 由于胰島素序列和由于胰島素序列和DNA雙脫氧雙脫氧 法兩次獲得法兩次獲得 獎(jiǎng)）獎(jiǎng)） Institute of Genetic Engineering DNADNA克隆、克隆、 與重組技術(shù)的歷史與重組技術(shù)的歷史 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 法（法（ Sanger dideoxy method） 雙脫氧雙脫氧 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 人類人類 HumanHuman 組計(jì)劃組計(jì)

8、劃 TheThe GenomeGenome ProjectProject 美國(guó)從美國(guó)從7070年代起啟動(dòng)的年代起啟動(dòng)的 “腫瘤計(jì)劃”，“腫瘤計(jì)劃”，不惜不惜 血本的投入換來的是令人失望的結(jié)果。血本的投入換來的是令人失望的結(jié)果。 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 獎(jiǎng)得主獎(jiǎng)得主DulbeccoDulbecco在在19861986年年3 3 的的ScienceScience雜志上雜志上 月月7 7日日 了一篇題為“了一篇題為“腫瘤研究的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：腫瘤研究的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：

9、人類人類 組的全序列分析”組的全序列分析”的短文。的短文。 Renato Dulbecco (1914 2012) Institute of Genetic Engineering DNADNA克隆、克隆、 與重組技術(shù)的歷史與重組技術(shù)的歷史 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 人類人類 組計(jì)劃組計(jì)劃 DNADNA克隆、克隆、 與重組技術(shù)的歷史與重組技術(shù)的歷史 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 人類人類 組計(jì)劃組計(jì)劃 S So ou ut th he ern Mee ed

10、ica al Unive ers sity 2003年年，六個(gè)，六個(gè) 時(shí)時(shí)13年的人類年的人類 劃的完成。劃的完成。 ，耗資，耗資30億億 ，標(biāo)志人類，標(biāo)志人類 ，二十個(gè)，二十個(gè) 組序列圖繪制組序列圖繪制 ，歷，歷 組計(jì)組計(jì) Institute of Genetic Engineering 技術(shù)的飛躍 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 2003年，“HGP”獲得首張人類全 組圖譜，花費(fèi) 了30億 和13年的時(shí)間 CraigCraig VenterVenter開發(fā)出一種快速追蹤開發(fā)出一種快速追蹤20072007年年9 9月完成月完成

11、VenterVenter自身全自身全 費(fèi)約費(fèi)約1 1億億 方法，并于方法，并于 組的測(cè)定工作，花組的測(cè)定工作，花 Institute of Genetic Engineering 技術(shù)的飛躍 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 2008.4.17Nature雜志，雜志， 454 Life Sciences公司，花費(fèi)約公司，花費(fèi)約150萬萬 新技術(shù)：美國(guó)新技術(shù)：美國(guó)454 ，4 。 NOW:5000 1000 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica

12、 al Unive ers sity 醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué) ： 生物學(xué)將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)帶入生物學(xué)將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)帶入 遺傳學(xué)遺傳學(xué) 生物化學(xué)生物化學(xué) 生物學(xué)生物學(xué) Institute of Genetic Engineering 多多態(tài)性態(tài)性 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 表型差異性表型差異性 疾病易感性疾病易感性 敏感性敏感性 差異差異 患病風(fēng)險(xiǎn)患病風(fēng)險(xiǎn) 醫(yī)療醫(yī)療 I f Genetic Engineering 疾病疾病 化醫(yī)療化醫(yī)療( ( alizedalized medmedi iS So oc cu ui it th hn ne ere en

13、 ) )Mee edica al Unive ers sity 治療“因人而異”、“量體裁衣”，治療“因人而異”、“量體裁衣”， 考慮遺傳因素、考慮遺傳因素、 、 、體重、生理病理特征等情況，、體重、生理病理特征等情況， 制定安全、合理、有效、制定安全、合理、有效、 的的 治療方案。治療方案。 給適合的給適合的 、 在適合的時(shí)候、在適合的時(shí)候、 使用適合的治療使用適合的治療 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 現(xiàn)代現(xiàn)代 生物學(xué)在生物學(xué)在 化醫(yī)療中發(fā)揮關(guān)鍵作用化醫(yī)療中發(fā)揮關(guān)鍵作用 Environment Disease Institu

14、te of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 奧斯卡獎(jiǎng)得主，榮登奧斯卡獎(jiǎng)得主，榮登 所選擇的治療。所選擇的治療。 ，不是因?yàn)檠菁?，而是因?yàn)樗皇且驗(yàn)檠菁迹且驗(yàn)樗?Institute of Genetic Engineering Angelina Jolie：My medical choiS Sco oeu ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 接受了乳腺切除手術(shù)接受了乳腺切除手術(shù) “當(dāng)我知道這個(gè)事實(shí)的時(shí)候，“當(dāng)我知道這個(gè)事實(shí)的時(shí)候， 我就決定未

15、雨綢繆將風(fēng)險(xiǎn)降到我就決定未雨綢繆將風(fēng)險(xiǎn)降到 最低，希望最低，希望 女性也去做這女性也去做這 個(gè)個(gè) 測(cè)試”測(cè)試” 2013.5.14 朱莉朱莉 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity Why did she do that? 因因 有有 史：史：母親和阿姨分別母親和阿姨分別 癌和癌和 缺陷：缺陷：BRCA1BRCA1 突變，突變， 癌的風(fēng)癌的風(fēng) 她個(gè)人罹患她個(gè)人罹患 和和 險(xiǎn)分別高達(dá)險(xiǎn)分別高達(dá)87%87%和和50%50% Institute of Genetic Engin

16、eering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 術(shù)后，安吉麗娜朱莉術(shù)后，安吉麗娜朱莉 降至降至5%5%以下。以下。 已經(jīng)從已經(jīng)從87%87% Institute of Genetic Engineering 信信信信息息息息的的的的傳傳傳傳遞遞遞遞 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity ：是為生物活性產(chǎn)物編碼的是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片段功能片段， 這些產(chǎn)物主要是這些產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)或是各種或是各種RNA RNA 轉(zhuǎn)錄 翻譯 蛋白質(zhì) DNA RNA 逆轉(zhuǎn)錄

17、DNADNA的生物的生物 RNARNA的的生生生生物物物物 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的的的的生生生生物物物物 表達(dá)調(diào)控表達(dá)調(diào)控 ( ( ) ) ) ) ( (轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄) ) ( ( ( (翻譯翻譯) ) ) ) Institute of Genetic Engineering 生生生生物物物物化化化化學(xué)學(xué)學(xué)學(xué)課課課課程程程程 DNA的生物的生物 DNA Biosynthesis ( Replication ) 宋千成宋千成 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity ( (replication) ) 是指遺傳物質(zhì)的傳代，以是指遺傳物質(zhì)的傳代，以 母鏈

18、母鏈DNA為模板為模板 子鏈子鏈DNA的過程。的過程。 親代親代DNA 子代子代DNA Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容： 的基本規(guī)律的基本規(guī)律 DNADNA 的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化 的過程的過程 逆轉(zhuǎn)錄和其他逆轉(zhuǎn)錄和其他 方式方式 DNADNA損傷（突變）與修復(fù)損傷（突變）與修復(fù) Institute of Genetic Engineering 核酸的分類及分布核酸的分類及分布 S So ou ut th he ern M

19、ee edica al Unive ers sity 脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi) 攜帶遺傳信息攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和，決定細(xì)胞和 的遺傳表型。的遺傳表型。 存在于胞核、胞液和線粒體存在于胞核、胞液和線粒體 核糖核酸核糖核酸 (ribonucleic acid, RNA) 完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)；完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)； 某些某些 載體。載體。 RNARNA也可作為遺傳信息的也可作為遺傳信息的 Institute of Genetic Engineering DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型雙螺

20、旋結(jié)構(gòu)模型 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 兩條鏈反向平行，兩條鏈反向平行， 右手雙螺旋；右手雙螺旋； 螺旋螺旋直徑直徑2nm2nm，表面有，表面有大溝和小溝；大溝和小溝； 每圈螺旋含每圈螺旋含1010個(gè)堿基對(duì)個(gè)堿基對(duì)，螺距為螺距為3.4nm3.4nm。 兩條鏈通過堿基間的氫鍵相連，兩條鏈通過堿基間的氫鍵相連， 堿基互補(bǔ)配對(duì)（堿基互補(bǔ)配對(duì)（A=T;A=T; C=GC=G）；）； 氫鍵氫鍵維持雙鏈橫向穩(wěn)定性，維持雙鏈橫向穩(wěn)定性，堿堿 基堆積力基堆積力維持雙鏈縱向穩(wěn)定性。維持雙鏈縱向穩(wěn)定性。 Institute of Genetic

21、 Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 第第 一一 節(jié)節(jié) 的基本規(guī)律的基本規(guī)律 Basic Rules of DNA Replication Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 的基本規(guī)律的基本規(guī)律( (重點(diǎn)重點(diǎn)) ) 的方式的方式 半保留半保留 (semi-conservative replication) 雙向雙向 (bidirectional replication) 半不連續(xù)半

22、不連續(xù) (semi-discontinuous replication) Institute of Genetic Engineering 一、DNA 的基本特征：半保留 ern Mee edica al Unive ers sity DNA生物生物 時(shí)時(shí) DNA 與模板互補(bǔ)的子鏈。子代與模板互補(bǔ)的子鏈。子代DNA，一股單鏈來自親代，另一股一股單鏈來自親代，另一股 單鏈從新單鏈從新 ，這種，這種 方式稱為方式稱為半保留半保留 。 半保留式半保留式 全保留式全保留式 混合式混合式 netic Engineering D 3 復(fù)制的復(fù)制的 種可能方式種可能方式 Meselson-Stahl Exp

23、eriment 1958 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity Matthew Meselson (Right，b.1930) and Franklin Stahl (Left，b.1929) Escherichia Coli Institute of Genetic Engineering 密度梯度實(shí)驗(yàn)支持半保留密度梯度實(shí)驗(yàn)支持半保留 機(jī)制機(jī)制 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 含重氮含重氮-DNA的細(xì)菌的細(xì)菌 15NH4Cl 第二代第二代 第一代第一代 14NH4Cl

24、 g g neering 半保留半保留 的意義的意義: : S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性保守性。 A T G C G C T A A T C G T A G C C G C G A T C G T A G C G C A T G C G C T A A T C G T A G C C G C G A T C G T A G C G C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T

25、 G A C C + C C A C T G G G G T G A C C 叉叉 Insti子子tute代代of GDenNeticAEngineering 母鏈母鏈DNA 二、DNA 從起始點(diǎn)向兩個(gè)方向延伸 e ern Mee edica al Unive ers sity 原核生物原核生物 時(shí)，時(shí)，DNADNA從從起始點(diǎn)起始點(diǎn)( (origin)origin)向兩個(gè)方向解鏈，向兩個(gè)方向解鏈， 形成兩個(gè)延伸方向相反的形成兩個(gè)延伸方向相反的 ori 叉，稱為叉，稱為雙向雙向 。 ter A A A. . 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNADNA及及 B 起始點(diǎn)起始點(diǎn) C B.B. C.C. 中的兩個(gè)中的

26、兩個(gè) 叉叉 接近終止點(diǎn)接近終止點(diǎn)(termination,(termination, ter)ter) Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 真核生物真核生物每個(gè)每個(gè) 有多個(gè)有多個(gè) ori 起始點(diǎn)。起始點(diǎn)。 ori ori ori 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 子子 Institute of Genetic Engineering 三、半不連續(xù) S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 3 領(lǐng)頭鏈

27、：領(lǐng)頭鏈：順著解鏈方向生成的子鏈，順著解鏈方向生成的子鏈， 是連續(xù)進(jìn)行的是連續(xù)進(jìn)行的 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈 (leading strand) 解鏈方向解鏈方向 5 3 隨從鏈隨從鏈 (lagging strand) 岡崎片段岡崎片段(okazaki(okazaki fragment)fragment) 隨從鏈：隨從鏈： 反，不連續(xù)反，不連續(xù) 的方向與解鏈方向相的方向與解鏈方向相 5 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 第第 二二 節(jié)節(jié) DNA 的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)

28、變化 The Enzymology and Topology of DNA Replication Institute of Genetic Engineering 參與參與DNADNA 的物質(zhì)的物質(zhì): : S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶，聚合酶， 簡(jiǎn)寫為簡(jiǎn)寫為 DNA-pol； 模板模板(template): 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈；母鏈； 引物引物(primer

29、): 聚合；聚合； 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次 其他的酶和蛋白質(zhì)因子。其他的酶和蛋白質(zhì)因子。 Institute of Genetic Engineering 一、生成磷酸二酯鍵是一、生成磷酸二酯鍵是 的基本化學(xué)反應(yīng)的基本化學(xué)反應(yīng) s sity (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 DNADNA 新鏈生成需新鏈生成需引物引物和和模板模板； 新鏈的延長(zhǎng)只可沿新鏈的延長(zhǎng)只可沿5 5 3 3 方向進(jìn)行。方向進(jìn)行。 + PPi g g 二、DNA聚合酶催化核苷酸之間聚合S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sit

30、y 全稱：全稱：依賴依賴DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 (DNA(DNA- -dependentdependent DNADNA polymerasepolymerase，DNADNA- -pol)pol) 活性：活性： 1. 53 的聚合活性的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 3 5 5 外切酶活性外切酶活性: : 能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解 5 5 3 3 外切酶活性外切酶活性: : 能切除突變的能切除突變的 DNDN 段。段。 （一）原核生物的（一）原核生物的DNADNA聚合酶分為三型聚合酶分為三型 a al Unive ers

31、 sity Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity DNA-pol 功能：功能：對(duì)對(duì) 中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀， 對(duì)對(duì) N 端端 和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。 C 端端 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 604604個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸 大片段大片段/Klenow/Klenow 片段片段 DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 5 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 小片段小片段 5 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 KlenowKlenow片段片段是是中常

32、用的工具酶。中常用的工具酶。 DNADNA，進(jìn)行，進(jìn)行 生物學(xué)研究生物學(xué)研究 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity DNA-pol DNADNA- -polpol II II 發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。 DNADNA- -polpol 對(duì)模板的特異性不高，即使在已發(fā)生對(duì)模板的特異性不高，即使在已發(fā)生損傷的損傷的DNADNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認(rèn)為，它此認(rèn)為，它參與參與DNADNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)損

33、傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。 DNA-pol 是原核生物是原核生物 延長(zhǎng)中真正起催化延長(zhǎng)中真正起催化 作用的酶。作用的酶。 Institute of Genetic Engineering （二）常見的真核細(xì)胞（二）常見的真核細(xì)胞DNADNA聚合酶聚合酶 Unive ers sity Institute of Genetic Engineering 三、 保真性的酶學(xué)依據(jù) S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity DNADNA 的保真性至少要依賴三種機(jī)制：的保真性至少要依賴三種機(jī)制： 遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律； 聚合酶在聚合酶

34、在 延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能； 出錯(cuò)時(shí)出錯(cuò)時(shí)DNADNA- -polpol的即時(shí)校讀功能。的即時(shí)校讀功能。 Institute of Genetic Engineering （一）核酸外切酶活性 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 核核核核 酸酸酸酸 外外外外切切切切 酶酶酶酶( (e ex xo on nu uc cl le ea as se e) )是指能從核酸鏈的是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來的酶，外切酶是末端把核苷酸依次水解出來的酶，外切酶是有方向性的。有方向性的。 核酸外切酶活性在核酸外切酶

35、活性在以校正以校正 中辨認(rèn)切除錯(cuò)配堿基并加中辨認(rèn)切除錯(cuò)配堿基并加 A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻入配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對(duì)的底物。正確配對(duì)的底物。 B：堿基配對(duì)正確，：堿基配對(duì)正確， DNA-pol不表不表 現(xiàn)活性?，F(xiàn)活性。 Institute of Genetic Engineering （二）堿基的正確選擇 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity DNADNA聚合酶協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）聚合酶協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵） 鍵的有序形成。鍵的有序形成。

36、 嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。 Institute of Genetic Engineering 四、 中DNA解鏈伴有 拓?fù)鋵W(xué)變化 e edica al Unive ers sity DNADNA 的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNADNA解成單鏈解成單鏈 ，它才能起模板作用。，它才能起模板作用。 （一）多種酶參與（一）多種酶參與DNADNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài) Engineering 原原核生核生物物 起始的相關(guān)蛋白

37、起始的相關(guān)蛋白質(zhì)質(zhì) 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（ ） 通用通用名名 功功能能 DnaA (dnaA) 辨認(rèn)起始點(diǎn)辨認(rèn)起始點(diǎn) DnaB (dnaB) 解螺旋解螺旋酶酶 解解開開DNA雙雙鏈鏈DnaC (dnaC) 運(yùn)送和協(xié)同運(yùn)送和協(xié)同DnaB DnaG (dnaG) 引物引物酶酶 催催化化RNA引物生引物生成成 SSB 單鏈單鏈DNA 穩(wěn)定已解開的單穩(wěn)定已解開的單鏈鏈結(jié)合蛋結(jié)合蛋白白 拓?fù)洚悩?gòu)拓?fù)洚悩?gòu)酶酶 (gyrA, B) 理理順順DNA鏈鏈 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 解螺旋酶解螺旋酶(helicase)(helicase)：利用利用A

38、TPATP供能，作用于氫供能，作用于氫鍵，使鍵，使DNADNA雙鏈解開雙鏈解開成為兩條單鏈。成為兩條單鏈。 引物酶引物酶(primase)(primase)： 物的酶物的酶。 起始時(shí)催化起始時(shí)催化生成生成RNARNA引引 單鏈單鏈DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(single(single strandedstranded DNADNA bindingbinding proteinprotein, , SSB)SSB)：在在 于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。 中維持模板處中維持模板處 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th

39、 he ern Mee edica al Unive ers sity E E . .C C o o l l i i 圖譜圖譜 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity （二）（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶理順拓?fù)洚悩?gòu)酶理順DNA鏈鏈 過程中正超螺旋的形成，需過程中正超螺旋的形成，需拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶水解并連接磷酸二酯鍵。水解并連接磷酸二酯鍵。 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al U

40、nive ers sity 拓?fù)洚悩?gòu)酶分類：拓?fù)洚悩?gòu)酶分類： 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 切斷切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股一股鏈，使鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。 反應(yīng)反應(yīng)不需不需ATP。 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 切斷切斷DNA 旋松弛。旋松弛。 兩股兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺 利用利用ATP供能，連接斷端，供能，連接斷端， DNA 旋狀態(tài)。旋狀態(tài)。 進(jìn)入負(fù)超螺進(jìn)入負(fù)超螺 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee

41、edica al Unive ers sity 拓?fù)涿傅淖饔梅绞剑和負(fù)涿傅淖饔梅绞剑?Institute of Genetic Engineering 五、五、DNA連接酶連接單鏈缺口連接酶連接單鏈缺口 h he ern Mee edica al Unive ers sity DNA連接酶連接酶(DNA ligase)作用方式：作用方式： 連接連接DNA鏈鏈3 -OH末端和相鄰末端和相鄰DNA鏈鏈5 -P末端，使二末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條鏈連接成一條 完整的鏈。完整的鏈。 5 3 O P O- 3 HO 5 O O- AT

42、P DNA連接酶連接酶 ADP 5 3 O P O- 3 5 O O Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity DNA連接酶功能：連接酶功能： 在在 中起最后接合缺口的作用。中起最后接合缺口的作用。 在在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺 口作用?？谧饔谩?也是也是 工程的重要工具酶之一。工程的重要工具酶之一。 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al U

43、nive ers sity DNA聚合酶，拓?fù)涿负瓦B接酶催化聚合酶，拓?fù)涿负瓦B接酶催化3 ,5 -磷酸二酯鍵生成的比較磷酸二酯鍵生成的比較 結(jié)果結(jié)果 提供核糖提供核糖3 -OH 提供提供5 -P 引物或延長(zhǎng)中的引物或延長(zhǎng)中的新鏈新鏈 游離游離dNTP 去去PPi DNA聚合酶聚合酶 (dNTP)n+1 連接酶連接酶 拓?fù)涿竿負(fù)涿?中不連續(xù)的兩條單鏈中不連續(xù)的兩條單鏈 切斷、整理后的兩鏈切斷、整理后的兩鏈 不連續(xù)連續(xù)鏈不連續(xù)連續(xù)鏈 改變拓?fù)錉顟B(tài)改變拓?fù)錉顟B(tài) Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Uni

44、ve ers sity 第第 三三 節(jié)節(jié) DNA生物生物 過程過程 The Process of DNA Replication Institute of Genetic Engineering 一、原核生物的一、原核生物的DNADNA生物生物 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity （一）（一） 起始：起始：DNA解鏈形成解鏈形成 體體 需要解決兩個(gè)問題：需要解決兩個(gè)問題： 1. DNA解開成單鏈，提供模板。解開成單鏈，提供模板。 引物，提供引物，提供3 -OH末端。末端。 2. 形成形成 體，體， Institute of Gene

45、tic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 體和引物體和引物 Dna B、 Dna C 3 Dna A 5 3 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 5 SSB 含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaCDnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNADNA 起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為 引物引物是由引物酶催化是由引物酶催化 體體。 的短鏈的短鏈RNARNA 。 Inst enetic Engineering （二）（二）半不連續(xù)半不連續(xù) S So ou ut th he ern Mee edica al Univ

46、e ers sity 的延長(zhǎng)指在的延長(zhǎng)指在DNADNA- -polpol催化下，催化下，dNTPdNTP以以dNMPdNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上， 其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 3 5 3 DNA-pol 5 dCTP dAT dTTP dGTP dCTP dTTP dATP dGTP Institute of Genetic Engineering 領(lǐng)頭鏈連續(xù)領(lǐng)頭鏈連續(xù) ，隨從鏈不連續(xù)，隨從鏈不連續(xù) o ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 領(lǐng)頭鏈的領(lǐng)頭

47、鏈的 ： 沿沿5 5 3 3 方向連續(xù)延伸方向連續(xù)延伸 隨從鏈的隨從鏈的 領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由同一種領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由同一種 DNA-pol催化延長(zhǎng)催化延長(zhǎng) eering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 復(fù)復(fù)制制過 程過 程簡(jiǎn)簡(jiǎn)圖圖 ngineering （三）三） 的終止過程：的終止過程： S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 切除引物、填補(bǔ)空缺、連接切口切除引物、填補(bǔ)空缺、連接切口 原核生物原核生物 是環(huán)狀是環(huán)狀DNADNA，雙向，雙向 的的 片段在片段在 的終止點(diǎn)的終止

48、點(diǎn)(ter)(ter)處匯合。處匯合。 Institute of Genetic Engineering 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接：隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接：S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 5 5 RNA酶酶 5 5 OH P DNA-pol dNTP 5 5 P ATP DNA連接酶連接酶 ADP+Pi 5 Engineering 5 Institute of Genetic 二、真核二、真核生物的生物的DNADNA生物生物 o ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 哺乳動(dòng)

49、物哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期細(xì)胞周期 期期 DNA 細(xì)胞能否細(xì)胞能否 ， 決定于進(jìn)入決定于進(jìn)入S S期及期及MM期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。 G1G1S S及及G2G2MM的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種作用。作用。 因子而實(shí)施調(diào)控因子而實(shí)施調(diào)控 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity （一）真核生物（一）真核生物 的起始與原核基本相似的起始與原核基本相似 真核生物每個(gè)真核生物每個(gè) 有多個(gè)

50、起始點(diǎn)，是多有多個(gè)起始點(diǎn)，是多 子子 。 有時(shí)序性，即有時(shí)序性，即 子以分組方式子以分組方式 激活而不是同步起動(dòng)。激活而不是同步起動(dòng)。 的起始需要的起始需要DNA-pol （引物酶活性）引物酶活性）和和 pol （解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù) 制因子制因子(replication factor, RF)。 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 增增 殖殖 細(xì)細(xì) 胞胞 核核 抗抗 原原 （ proliferation cell n

51、uclear antigen，PCNA）在在 起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作 用。用。PCNA為同源三聚體，具有與為同源三聚體，具有與E.coli DNA 聚聚 合酶合酶的的 亞基相同的功能和相似的構(gòu)象，即形亞基相同的功能和相似的構(gòu)象，即形 成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)DNA ，在，在RFC的作用下的作用下 PCNA結(jié)合于引物模板鏈；并且結(jié)合于引物模板鏈；并且PCNA使使pol 獲獲 得持續(xù)得持續(xù) 能力。能力。PCNA水平也是檢驗(yàn)細(xì)胞增殖水平也是檢驗(yàn)細(xì)胞增殖 的重要指標(biāo)。的重要指標(biāo)。 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th

52、 he ern Mee edica al Unive ers sity 細(xì)胞能否細(xì)胞能否 ，決定于進(jìn)入，決定于進(jìn)入S期及期及M期這兩個(gè)關(guān)期這兩個(gè)關(guān) 鍵點(diǎn)。鍵點(diǎn)。G1S及及G2M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性 有關(guān)。蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種有關(guān)。蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種 因子而實(shí)施調(diào)控作用。相關(guān)的激酶都有調(diào)節(jié)亞基因子而實(shí)施調(diào)控作用。相關(guān)的激酶都有調(diào)節(jié)亞基 即細(xì)胞周期蛋白即細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，和催化亞基即細(xì)胞周期，和催化亞基即細(xì)胞周期 蛋白依賴激酶蛋白依賴激酶(cyclin dependent kinase，CDK)。 Institute of Geneti

53、c Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 哺乳類動(dòng)物的周期蛋白和哺乳類動(dòng)物的周期蛋白和CDK 相匹配的周期蛋白相匹配的周期蛋白 作用點(diǎn)作用點(diǎn) CDK G1期期 G1S期期S期期 G2期期 G2M期期 CDK2 Cyclin D1, D2, D3 Cyclin E Cyclin A Cyclin D1, D2, D3 CDK3和和CDK4 CDK1（CDC2） Cyclin A, B Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica a

54、l Unive ers sity 哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制CDK的蛋白質(zhì)，的蛋白質(zhì)， 例如錨蛋白例如錨蛋白(ankynin)是是CDK4的特異性抑制物，的特異性抑制物， P21蛋白能抑制多種蛋白能抑制多種CDK。錨蛋白和。錨蛋白和P21蛋白的抑蛋白的抑制制/活化可使細(xì)胞周期開放活化可使細(xì)胞周期開放/關(guān)閉，因此被形容為細(xì)關(guān)閉，因此被形容為細(xì) 胞周期的檢查點(diǎn)胞周期的檢查點(diǎn)(check point)蛋白。蛋白。 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers

55、sity （二）真核生物 /轉(zhuǎn)換 的延長(zhǎng)發(fā)生DNA聚合酶 DNA-pol 和和pol 分別兼有解螺旋酶和引物酶活分別兼有解螺旋酶和引物酶活 性。在性。在 叉及引物生成后，叉及引物生成后， DNA-pol 通過通過 PCNA的協(xié)同作用，逐步取代的協(xié)同作用，逐步取代pol ，在，在RNA引物引物 的的3 -OH基礎(chǔ)上連續(xù)基礎(chǔ)上連續(xù) 領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也 由由pol 催化催化 pol ，繼續(xù)，繼續(xù) 。然后由。然后由PCNA協(xié)同，協(xié)同，pol 臵換臵換 DNA子鏈。子鏈。 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern M

56、ee edica al Unive ers sity 真核生物真核生物 叉的延長(zhǎng)：叉的延長(zhǎng)： 3 5 親代親代DNA 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈 5 3 5 隨從鏈隨從鏈 3 5 3 引物引物 核小體核小體 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity （三）端粒酶參與解決（三）端粒酶參與解決 端粒（端粒（TelomeresTelomeres）：）：真核生物真核生物末端的結(jié)構(gòu)末端的結(jié)構(gòu) 富含富含GCGC的重復(fù)序列的重復(fù)序列 人：人：( (TTTTA AGGG)GGG)nn 末端末端 問題問題

57、 線性線性DNADNA 功能：功能： 維持維持 維持維持DNA 的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性 的完整性的完整性 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 端粒酶：端粒酶：RNARNA- -蛋白質(zhì)復(fù)合物蛋白質(zhì)復(fù)合物 既有模板，又有逆轉(zhuǎn)錄既有模板，又有逆轉(zhuǎn)錄酶酶 以自身的以自身的RNARNA為模板延長(zhǎng)為模板延長(zhǎng)DNADNA單鏈，然后反折為雙單鏈，然后反折為雙 鏈鏈, , 爬行模式爬行模式 端粒酶與生物體的衰老、腫瘤的發(fā)生有關(guān)端粒酶與生物體的衰老、腫瘤的發(fā)生有關(guān) Institute of Genetic Engineering 原核、真核生物原核、真核生物

58、DNA 的異同的異同 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 相相相相同同同同點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn) 聚合酶基本性質(zhì)相同聚合酶基本性質(zhì)相同 程基本相同程基本相同 半保留半保留 、半不連續(xù)、半不連續(xù) 、雙向、雙向 真真真真核核核核生生生生物物物物 原原原原核核核核生生生生物物物物 多多多多 起點(diǎn)起點(diǎn) 1 1個(gè)個(gè) 起；起； 全全全全部部部部 后才可開始下一次后才可開始下一次 起點(diǎn)可起點(diǎn)可連連連連連連續(xù)發(fā)生續(xù)發(fā)生酶和蛋白因子不同酶和蛋白因子不同 酶酶酶酶酶酶和和和和和和蛋蛋白白白白白白因子不同因子不同 末端末端需需需需端端端端粒粒粒粒和和和和端端端端粒粒粒

59、粒酶酶酶酶 Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 第四節(jié)第四節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄和其他逆轉(zhuǎn)錄和其他 方式方式 Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways Institute of Genetic Engineering S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 某些某些 的遺傳物質(zhì)是的遺傳物質(zhì)是RNA。少數(shù)。少數(shù) 生物如生物如 M13噬菌體，它的噬菌體，它的 型只含單

60、鏈型只含單鏈DNA。原核生。原核生 物的質(zhì)粒，真核生物的線粒體物的質(zhì)粒，真核生物的線粒體DNA，都是，都是 外存在的外存在的DNA。這些非。這些非 組，采用特殊組，采用特殊 的方式進(jìn)行的方式進(jìn)行 。 Institute of Genetic Engineering 一、逆轉(zhuǎn)錄一、逆轉(zhuǎn)錄 的的 組的組的 S So ou ut th he ern Mee edica al Unive ers sity 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 的的 組是組是RNA，其，其 方式是逆轉(zhuǎn)錄方式是逆轉(zhuǎn)錄 RNA 模板模板 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA-RNA 雜化雙鏈雜化雙鏈 單鏈單鏈DNA RNA酶酶 DNADNA聚合酶聚合酶 雙雙