細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)技術(shù)(Transwell)(精品文檔)_共4頁

1、遷移實(shí)驗(yàn)（ cell migration assay）實(shí)驗(yàn)介紹細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。實(shí)驗(yàn)步驟：1 材料準(zhǔn)備：可拍照顯微鏡， Transwell 小室，孔徑8m，沒包被膠的 (Coster 和 Corning公司的也較常用)， Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板24 孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購買的Transw

2、ell 小室相配套， BD 公司的 Matrigel ，無血清 DMEM ，(1% 胎牛血清 )DMEM 和 1640 培養(yǎng)基，DMEM 完全培養(yǎng)基，1640 完全培養(yǎng)基（也可加到20% 血清），無菌 PBS ，棉簽，胰酶，4% 多聚甲醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液（0.1% （ g/ml ）PBS 結(jié)晶紫）2 步驟和流程2.1 基質(zhì)膠鋪板：用 BD 公司的 Matrigel1 ：8（根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生mmp 的量來決定）稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37 30min 使 Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。2.2 制備細(xì)胞懸液制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12

3、24h ，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用 PBS 洗 1 2 遍），用含 BSA 的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml 。2.3 接種細(xì)胞取細(xì)胞懸液100l加入 Transwell小室。 24 孔板下室一般加入 600l含 20%FBS 的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng) 12 48h （主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定） 。 24h 較常見，時間點(diǎn)的

4、選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。2.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)直接計(jì)數(shù)法， “貼壁 ”細(xì)胞計(jì)數(shù)，這里所謂的“貼壁 ”是指細(xì)胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去，通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。取出 Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS 洗 2 遍，甲醇固定30 分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1% 結(jié)晶紫染色20 min ，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS 洗 3 遍。400 倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。本文檔下載后根據(jù)實(shí)際情況可編輯修改使用實(shí)驗(yàn)材料（ 1） Transwell chamber: 24-well,8.0- m

5、 pore membranes (Corning)（ 2）細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：無血清培養(yǎng)基，10 血清培養(yǎng)基，PBS ， 0.02 EDTA（ 3）固定液：甲醇（ 4）染色液： Giemsa 染液（ 5）封片劑：中性樹膠（ 6）其他：小鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片操作步驟（ 1）所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和 Transwell chamber放在 37溫育；（ 2）待測細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細(xì)胞，用PBS 和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為2×105 /ml ；（ 3）在下室（即 24 孔板底部）加入 600 800l 含 10 血清的培養(yǎng)基，上室加入 100

6、 150l細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng) 24 小時；（ 4）用鑷子小心取出 chamber ，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約 800l甲醇的孔中，室溫固定 30 分鐘；（ 5）取出 chamber ，吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約 800lGiemsa 染液的孔中，室溫染色 15 30 分鐘；（ 6）輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出 chamber ，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞；（ 7）用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；（ 8）顯微鏡下取 9 個隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。注意事項(xiàng)（ 1）根據(jù)待測細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的 chamber 。常用的為 8

7、.0- m 孔徑（如 AGS 細(xì)胞），如果細(xì)胞體積較大可以考慮用 10-m 孔徑；（ 2）根據(jù)待測細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時間。常規(guī)24-wellchamber接種細(xì)胞數(shù)約為 2 5× 104 /well ，遷移時間 12 36 小時；（ 3）由于 Corning公司的 24-Transwell內(nèi)含 12 個獨(dú)立的 chamber ，為了避免操作污染，每次實(shí)驗(yàn)可預(yù)先另準(zhǔn)備一塊24 孔普通培養(yǎng)板（Corning ）；（ 4）如果細(xì)胞遷移能力較弱，下室液體可用 3T3 細(xì)胞無血清培養(yǎng) 24 小時獲得的上清加 50g/ml FN （ Fibronectin ），具體可查閱相關(guān)文獻(xiàn)

8、；本文檔下載后根據(jù)實(shí)際情況可編輯修改使用（ 5）細(xì)胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；（ 6）固定染色擦洗時動作小心，避免擦去膜底面的細(xì)胞。但一定要充分擦凈膜表面上未遷移的細(xì)胞，以免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細(xì)牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；（ 7） Chamber 和膜上都無法標(biāo)記，操作時應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對照組；（ 8）充分晾干，避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（cell invasion assay）實(shí)驗(yàn)材料（ 1） Matrigel (BD 5mg/ml)，-20 保存（ 2）其余材料同遷移實(shí)驗(yàn)操作步驟（ 1） Matrigel 在 4 過夜融化；（

9、 2）用 4 預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋 Matrigel 至終濃度 1mg/ml ，冰上操作；（ 3）在 chamber 上室底部中央垂直加入 100l稀釋后的 Matrigel ，37 溫育 4 5 小時使其干成膠狀；（ 4）后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)（ 1-8 ）。注意事項(xiàng)（ 1） Matrigel 在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提前在 4 預(yù)冷；（ 2）鋪膠時保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡；（ 3）其他注意事項(xiàng)同遷移試驗(yàn)。其他Transwell做腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)的具體步驟(1)基質(zhì)膠準(zhǔn)備：將凍存于 80 度冰箱的 BD matrigel 4 度過夜（ 24h ），

10、變成液態(tài)；（2）取 300ul 無血清培養(yǎng)基，加入 60ul （或 50ug/ 每室） Matrigel ，混勻，（ 4操作，最好在冰浴上） ，加入上室各 100ul （3 個室）；放入 37 培養(yǎng)箱中，孵育 4-5h （>5h ）；此間經(jīng)常觀察，當(dāng)出現(xiàn) “白色層 ”時，說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。本文檔下載后根據(jù)實(shí)際情況可編輯修改使用注釋：無血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按1：5稀釋，每孔加 50ul ，在 37培養(yǎng)箱中 1-2h 。（3）消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗 3次，計(jì)數(shù)，配成細(xì)胞懸液；（4）用無血清培養(yǎng)基洗 Matrigel 洗 1 次；每孔加入 100ul 細(xì)胞懸液；（ 5） 下腔室中加入 500u

11、l 含有 20 FBS 條件培養(yǎng)基；（ 6） 37 培養(yǎng)箱中，孵育 20-24h ；（ 7） 取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍， 5% 戊二醛固定， 4 ；（8）加入結(jié)晶紫（ 0.1% ）染色或 Giemsa染色（ 510min ），室溫0.5h ， PBS 洗2 遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察。遷移實(shí)驗(yàn)transwell在 24 孔板中浸泡 1小時；消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗 2次，計(jì)數(shù)，配成 細(xì)胞懸液，每孔加入100ul細(xì)胞懸液；加藥刺激；下腔室中加入條件培養(yǎng)基或其他刺激因子；37 培養(yǎng)箱中，孵育20-24h； 取出 transwell用PBS洗2 遍，5% 戊二醛固

12、定， 4 ； PBS 洗2 遍，加入結(jié)晶紫（0.1%）染色，室溫0.5h， PBS洗 2遍，用棉球擦去上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)10 照相，記錄。侵襲實(shí)驗(yàn)取 300ul無血清培養(yǎng)基，加入 30ul（或 50ug/ 每室） Matrigel，混勻，（ 4 操作，最好在冰浴上） ，加入上室各 100ul （3 個室）； 放入37 培養(yǎng)箱中，孵育 4-5h（ >5h ）； 消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗3次，計(jì)數(shù)，配成細(xì)胞懸液；用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel洗 1次；每孔加入100ul細(xì)胞懸液；下腔室中加入600ul無血清 條件培養(yǎng)基； 37 培養(yǎng)箱中，孵育 20-24h；取出 transwell用 PBS洗 2遍， 5%戊二醛固定，4 ；PBS洗 2遍，加入結(jié)晶紫（0.1%）染