傳統(tǒng)豆腐干中主要腐敗菌的分離及其系統(tǒng)發(fā)育

1、傳統(tǒng)豆腐干中主要腐敗菌的分離及其系統(tǒng)發(fā)育燈解干址中國的伐筑E貸"其主咚卓料址大畀”富會蛋白質(zhì).不飽和脂肪離.鈣及金族常生素*是我國居民睹徵中憂辰曲物蚩門戰(zhàn)的審硬來濂.除蛋孰懶外.H余必爵總基強(qiáng)的組底與比例同動勒蛋片相徵血H常青咎物缺乏的戟輒酸*同時大豆中還畫有豐奇的確，鐵和鈣等微fit元素”、由于豆廂干中背養(yǎng)豐富*浙以豆腐干非常容域嘴WU而引起豆厲干變威的原n堆卒種蕓樣的，柱不同壞境卜'引起豆腐干變質(zhì)的原閔是仃竝別的總的米說汚I起H干變農(nóng)的T：譽(yù)原因是微生梅引起的.嚴(yán)朮眾響K*冷的品廟，井冒致嚴(yán)市的經(jīng)濟(jì)損供和食帖空全2為此筆希収廊麒的豆廊干為材料進(jìn)行廊敗微住物的令離,羥龍繪發(fā)

2、育分析初步確定其井類地位，從而為控制豆腐干生產(chǎn)過稈中進(jìn)荷澈牛.物沁染控制提供有價值的數(shù)冊券垮I材料與勺法IJ豆揭干料本的采栗康羋腐Kt融化的豆刪干樣品"低溫探R林抉進(jìn)fj微生物的分離檢測1.2孑薦培體展、(:s瓊脂培養(yǎng)韓：酵母件&酪蛋rm%酸2月谷氨酸鈉理.檸It酸三鈉3g.MgSO4-7H2Olg.CaCL-2H：()().5gK(：llgFeCh2-4U;()0.5mgLB瓊脂培養(yǎng)基：蛋門腕10氏酵母粉5gtNuCl10g-肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)菇：蛋白lOg牛肉音粉3g.NuCl5gaTYG培養(yǎng)娃：蛋白腺5g.fi?母青10乩葩荀糖r7H2()lgtC；i(：l：-2HX)(

3、).5gtXaHCO.0決上述培弄基為11而要W成分的雖其中瓊脂使用S：為1Sg.pH被調(diào)戮為7-75。1.3生物的分離無蘭操作條件下移収腐敗溶化的豆腐干組織液100"溶于900|iL滅慚水中.進(jìn)行倍比稀秤分別収100M稀釋蘭液均勻涂布于分離培養(yǎng)驀I：每濃度做兩個平行.37養(yǎng)。1.4倉俅DNA的小量援取哭用Cui抽提法提収微生物總I)、A所仔操作步驟應(yīng)輕柔避免DNA受到損傷而斷裂。1.5 I6SrDNA雖囚的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)堀采用的正反向引物為27F(55GAGTTrGATCCTCGCTCAG-3r)和反向引物1492R(5-(；(；TTACCTT(；TTACGACTT-3'

4、;):引物由上海Sangon公司合成擴(kuò)增體系為50口,.擴(kuò)増片斯大小約1500呦IX：II反應(yīng)條件：95V預(yù)變性4血叭94戲變性lmin.50iU火lmin.72X：延伸2minv3O個循壞；最后72七保持lOmin,凰囚序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)克分析Hi據(jù)序列結(jié)果采用EzTaxonserver2.14I：具比較其lW株的16SrKNA基因與有效命名物種的序列相似性o根據(jù)測序結(jié)果用Blast程序從GcnBank等公共數(shù)現(xiàn)庫中搜索出同源性較高的相關(guān)阿秣的I6SrRNA基因序列.以CIASTAI.X軟件進(jìn)行多序列比對'系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Kimura離型估算用MEGA4.0(MolecularEv

5、olutioiian*GeneticsAnalysis)軟件采用鄰接法(Neighbor-joining)聚類分析并構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化鞫同時霾貝取樣1000次進(jìn)行fl展S(bootstrapvalue)分析來評估系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性S2結(jié)果與分析2.1腐敗徴生揚(yáng)的分爲(wèi)用實(shí)驗設(shè)計的4種分離培養(yǎng)基對腐散的豆膺干進(jìn)fj微生物的分離共分離獲紂26秣茴一從蘭落形態(tài)觀察去電復(fù)挑取4株形態(tài)略(IK異的菌株進(jìn)fJI6SrKNA圳閔序列測定序列長度大約145(葉采用EzTaxonMrncr2.1工八比較其茴株的16SrRNA基因與仔效命名物種的序列相似性.其相似性結(jié)果W.農(nóng)I根據(jù)測序的結(jié)果.軸敗伯上嬰仃2種

6、.l!|lleudimion(tswrupnosafllfineillussubtilis.其對應(yīng)的河株編號為DFG01和DFG02它們分別是Q腐干腐敢的I：要微生物根據(jù)統(tǒng)計以IW株DFG01為代表的腐敗微生物占到64.2%,以蘭株DFG02為代衣的腐敗微生物占到35.8%。農(nóng)丨分肉曲棟與親緣曲株的相似性Tab.1SimilarityrelationtonearestneighborsofstrainsisolatedSlruinSimLrilyWtDFG0IlsrutlttnufnaxrirrugirioA/j99.7DFG02Rtuillusmhlilii99.52.1屆敗傲生物的系統(tǒng)發(fā)育

7、分折對獲得的腐敗微生物2個代表菌株DFG01和DFG02采用EzTaxonserverZ1工具比較其蘭株的I6SrRN.效命名物種的序列郴似性實(shí)驗結(jié)果表明蘭株DFG0I尿FPseudomonas與Pieudomonasaeruginosa具仔最近的親緣關(guān)系.其同源件fii達(dá)99.7%；另一株伯1)E(X)2居于Hacillus.與Bacillussubtil親緣關(guān)系處近達(dá)到99.5%對分離的細(xì)蘭用Bl«t搜索軟ft從GcnBank.EMBL和DDBJ等公共«(據(jù)庫中進(jìn)行相似件捜索.調(diào)出相似性最高的相關(guān)菌株的I6SrRNA基因序列與已知親緣關(guān)系較近的物種采用CLLSTALX軼

8、件逍行序列比對.MEGA軟件進(jìn)行相似性計算進(jìn)化距離矩陣計燈.聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化詢的構(gòu)建等系統(tǒng)發(fā)仔分析結(jié)果見圖1和圖2。系統(tǒng)發(fā)仔農(nóng)明.分離獲得的的株DFG01同親緣關(guān)系最近的物種Pseudomonas以非常髙的門展值聚類在一起形成獨(dú)立的分支單元這與EzTaxonserver2工具比對分析的結(jié)果相一致(見農(nóng)1)。同時菌株DF(X)2同Bacillus屬的物種以極高的自展值聚類在一起J於成-個大的分支單元。這些結(jié)果農(nóng)明了腐敗做生物在基囚遺傳學(xué)上的分類地位為進(jìn)一步從宰因水半上進(jìn)fr防拎提供J很好的參考依100DFOlPseudomonasaexutiosaATCC17588rtP002881)Pseu

9、doojusotibduXCC10330T<T353117)PseudoonasputxUDSIC29176667)PstudononasJaf«a0I2TAT361537)«n»eusDSM228ISB175655)0005ffl1曲棟DFG01同匸知I同激先系牧近荷棟的16SrRNA*因系統(tǒng)發(fā)fi樹Rg.1PhylogenetictreeofthestrainDFG01isolatedandnearneighborscalculatedfrom16SrRNAgenesequencesusingtheneighbour-joningmeftitd76&qu

10、ot;GO2Bcihssub心BAXKR2t«C683835)oBcihssubfissubspxiaquosoramBCSC3A28TU138167)Bcihs24XraJ8318I3)BtciAisnhnssFO-F234850FusaeilussolCC-YMP-6T<EV213011>0005ffl2曲棟DFG02同己知同滋X縈絞近蔭株的16SrRNAUI町系久Fig.2PhylogenetictreeofthestrainDFG02isolatedandnearneighbourscalcubtedfrom16SrRMAgenesequencesusingthe

11、neighbour-joinngmethod(下轉(zhuǎn)第36W)3討論豆腐干是中國大眾普遍消費(fèi)的苕養(yǎng)父品.因其含疔豐富的蛋門頂.脂肪糖類等微生物生長的理想條fllij易彼微生物汚染本尖驗中發(fā)現(xiàn)悲臭假單匏蘭(Iudomofuisaerupifioa)W枯乍芽他H恆(Baciblussubtil)是"I-中1耍的«敗菌在干牛產(chǎn)過程中要注意加強(qiáng)這方面的微生物防控。刃外其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)對于不同的9腐產(chǎn)品K胳敗菌也不盡相同一TuitemwongK°研究豆腐及其潘出液的腐畋恂時發(fā)現(xiàn)融臭假單胞|W(Pteudomonmaeruginosa)片球|WW(Pediococcusp)等是

12、主要的腐畋微生物:Hegeman10研究真空包裝的石育豆腐發(fā)現(xiàn)乳酸細(xì)蘭和腸道蘭屬上要的腐敗倘；李博'研究發(fā)現(xiàn)GDLsJK中堅強(qiáng)芽他HHlfllW腸球蔭是主耍的*$nv王eHi,«息引發(fā)非發(fā)酵性厲制品豆腐腐敗變質(zhì)的上耍細(xì)藺是成團(tuán)腸樸佝、短小芽他桿鑿和巨大芽抱卄菌豆膺制品的微生物來游上嬰為療材料生產(chǎn)環(huán)境、伐品包裝生產(chǎn)過程和操作人員零：岡此在原料.產(chǎn)陽加工貯存零環(huán)卩務(wù)必加強(qiáng)衛(wèi)生管理確保產(chǎn)品品質(zhì)。同時«!定微生物的分類地位fa可根據(jù)其生長Vi性制定相關(guān)防控體系也可以從分子遺傳學(xué)水r上加以控制。參考文獻(xiàn)I乍唐亮蔣止升豆JK類試制與質(zhì)蝕控制技術(shù)的研憲【J安H農(nóng)業(yè)科學(xué).2011.

13、39(13):7718-7720.2鼻Ml.箱保Y.葡備糖酸內(nèi)加”JK生產(chǎn)過用中肚生物的變化及d堀中主經(jīng)席敗佔(zhàn)的鑒定J1.食品科學(xué).2006.27(5):77-823CuiX1.,MaoP,ZrtigM.rlal.Slfr|)tiiiM>n<t4porasalinaprn.nnv.*|knov.anminnnl)rrof(anuly<M*4nliii|>-MMfUfJ|.IniJS)mIEvolMirmliiol.2(X)1(51):357-3634ChunJIxrJ.JungYrlu).Ezlux<m：awrb-baMIlootfortheNlrrifii

14、9;Hlionof|mikMr)<ilr«hasnlon16SiiImimiiiuIRNAgrnrM*qu<ii<<?%J.IntJSylEv<JMmibiol2«)7(57)：22542261由農(nóng)3可知.回0欖型中顯薔項分別為ACJ),AB.ACX：I)%ABCI)2Jl!P值的大小可以nHi響桑熒總黃伺捉取含雖的齊因索人小順序為：提収時何微浚時間微液功率乙醉體枳分?jǐn)?shù)其中微波時何微波功儀提取時何為極"乙醉體積分?jǐn)?shù)為顯醬。12.2兩因素何的交互作用分析Design-Expert的圖形是特定的響應(yīng)面Y對應(yīng)于因素A.B.CJ)值構(gòu)成的一個

15、三推空何在二維乎面上的等高圖可以直觀地反映備因素對響應(yīng)值的妙響.從所紂響應(yīng)面分析圖上可以分析出它們之間的相H作用對響應(yīng)值的形響"。結(jié)栗見圖7比較6組幗可知：提収時間、微波時何微波功華對總黃|*J提収含雖的形響較為顯并.農(nóng)現(xiàn)為曲線牧陡:ifU乙醇休枳分?jǐn)?shù)衣現(xiàn)為Uli線較為平滑.4隨其數(shù)值旳增加或減少響應(yīng)值變化較?。旱囊蛩亟换プ饔糜纱蟮叫?微波時何和微波功半微波時何和乙醇體積分?jǐn)澄⒉〞r何和提収時間做波功率和乙醉體枳分?jǐn)?shù)微波功率和捉収時間乙醉體枳分?jǐn)澈褪侨r何。浸提法捉収桑黃總黃AH捉収匸藝的優(yōu)化巧驗if結(jié)果運(yùn)用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行優(yōu)化分析.以獲紂監(jiān)住的提収條件紿響應(yīng)

16、Ifll分析辰適提取條件為微波時間61.63s微波功率乙醇體枳分68,28%.捉取時何2.1711.此條件卜桑黃中總黃厠提馭倉雖為299()mg/&為了實(shí)繪方便將實(shí)柴條件修改為微波時何62»微波功率550Ww乙醉體積分?jǐn)?shù)70%.提収時何22h實(shí)際測定提取率為29.96ng/g,與理論預(yù)測值壘本吻合說明御到的二次冋H方ft?與實(shí)際惜況擬合較好3結(jié)論木試驗先通過單閑索實(shí)驗確定微波時何微波功率.乙醇體枳分?jǐn)?shù)和提取溫度足影響桑黃總黃AH捉収含址的主耍因素'再通過響應(yīng)血分析和等高線圖得出嚴(yán)佳工藝條件為：微波時何62趴微波功率55OW、乙醇體積分?jǐn)?shù)68%、捉収時間2.1711該條

17、件卜的桑黃總黃伺提収含圮為2996mg/g巧模型預(yù)測值29.90ing/g相左較小農(nóng)明將響應(yīng)而及計引用到集黃總黃IW提JU匚藝中是可行結(jié)果可靠。參考文獻(xiàn)1:劉存卿隊誥銀林躍血藥用典濟(jì)桑黃的研究進(jìn)展J.苗物研究20322.53-59.(2江»WIX學(xué)降沖藥大詞典M1.1:海:I:溝科學(xué)技術(shù)岀tttt.19953：周“山馬初樂集曲及莫藥珊作用研究邊展Jtr用曲20052?(2)：50-51.4：31克陳勁聲紆.桑貢"種抗癌藥物活性比ttiJJ.W休人7學(xué)瓠(只學(xué)版200228(3)：247-249.5：劉艷芳楊點(diǎn).肝愷等舛用鹿徹微黃總黃制測定方法研學(xué)報,2006.13(2):45-48.6張玉香.JBB