實(shí)驗(yàn)：豬胰蛋白酶的分離純化

1、實(shí)驗(yàn)：豬胰蛋白酶的分離純化主要內(nèi)容n實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容n實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膎實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理n實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法n實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果n實(shí)驗(yàn)報(bào)告格式實(shí)驗(yàn)報(bào)告格式實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容n一、豬胰蛋白酶的分離純化一、豬胰蛋白酶的分離純化 n二、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定二、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定n三、酶活力的測(cè)定三、酶活力的測(cè)定n四、純化效果檢測(cè)四、純化效果檢測(cè) SDS-PAGE電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?n1、掌握鹽析沉淀法、透析法及離子交換層析的原、掌握鹽析沉淀法、透析法及離子交換層析的原理和操作過(guò)程；理和操作過(guò)程；n2、熟悉胰蛋白酶分離純化的一般過(guò)程；、熟悉胰蛋白酶分離純化的一般過(guò)程；n3、掌握胰蛋白酶活力測(cè)定方法及

2、、掌握胰蛋白酶活力測(cè)定方法及SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)。胺凝膠電泳技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理n一、胰蛋白酶的基本特性一、胰蛋白酶的基本特性n二、本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化方法的原理二、本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化方法的原理n1. 沉淀法沉淀法n2. 透析法透析法n3. 離子交換層析技術(shù)離子交換層析技術(shù)n三、胰蛋白酶活性測(cè)定原理三、胰蛋白酶活性測(cè)定原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理一、胰蛋白酶的基本特性一、胰蛋白酶的基本特性n胰蛋白酶是以無(wú)活性的酶原形式存在于動(dòng)物胰臟中，在胰蛋白酶是以無(wú)活性的酶原形式存在于動(dòng)物胰臟中，在Ca2+的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激

3、活，從肽鏈從肽鏈N端賴氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開，失端賴氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開，失去一段六肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)槿ヒ欢瘟?，分子?gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘挠谢钚缘囊鹊鞍酌敢鹊鞍酌?。n豬胰蛋白酶的分子量約為豬胰蛋白酶的分子量約為23.4 kDa，其等電點(diǎn)約為，其等電點(diǎn)約為pI=10.8，最適最適pH7.68.0， 胰蛋白酶在胰蛋白酶在pH=3左右較穩(wěn)定，左右較穩(wěn)定，Ca2+離子離子對(duì)胰蛋白酶有穩(wěn)定作用，在低溫條件下貯存數(shù)周內(nèi)酶的活性對(duì)胰蛋白酶有穩(wěn)定作用，在低溫條件下貯存數(shù)周內(nèi)酶的活性不發(fā)生明顯的改變。不發(fā)生明顯的改變。LysValAspAspAspAspGlyIl

4、eLysValAspAspAspAspValHisSerGlyIleValHisSerEnteropeptidase腸激酶腸激酶Trypsin胰蛋白酶胰蛋白酶Active siteThe process of trypsinogen activation胰蛋白酶原激活過(guò)程胰蛋白酶原激活過(guò)程實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理二、本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化方法的原理二、本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化方法的原理n鹽析沉淀法：用硫酸銨鹽析法將目的蛋鹽析沉淀法：用硫酸銨鹽析法將目的蛋白從粗提液中沉淀出來(lái)，使其得到濃縮，白從粗提液中沉淀出來(lái)，使其得到濃縮，并除去部分雜質(zhì)（核酸、雜蛋白等）。并除去部分雜質(zhì)（核酸、雜蛋白等）。1. 沉淀法沉淀

5、法實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理二、本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化方法的原理二、本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化方法的原理n由于膜兩側(cè)的溶質(zhì)濃度不同，在濃度差由于膜兩側(cè)的溶質(zhì)濃度不同，在濃度差的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液）的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液）中的小分子溶質(zhì)（如無(wú)機(jī)鹽）透向透析中的小分子溶質(zhì)（如無(wú)機(jī)鹽）透向透析液一側(cè)，同時(shí)透析液中的緩沖液滲入蛋液一側(cè)，同時(shí)透析液中的緩沖液滲入蛋白溶液一側(cè)，經(jīng)過(guò)透析液反復(fù)換液后，白溶液一側(cè)，經(jīng)過(guò)透析液反復(fù)換液后，即可達(dá)到脫鹽和置換緩沖液的目的。即可達(dá)到脫鹽和置換緩沖液的目的。1. 透析法透析法實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理二、本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化方法的原理二、本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化方法的原理n同類

6、型的帶電離子間可自由地相互交換和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。同類型的帶電離子間可自由地相互交換和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。n蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)以下（蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)以下（pHpI），帶負(fù)電荷，可被陰離子交換樹），帶負(fù)電荷，可被陰離子交換樹脂所吸附。脂所吸附。n本實(shí)驗(yàn)中的豬胰蛋白酶等電點(diǎn)為本實(shí)驗(yàn)中的豬胰蛋白酶等電點(diǎn)為pI=10.8，在，在pH=5.0的緩沖液中豬胰蛋白酶帶正電的緩沖液中豬胰蛋白酶帶正電荷，可被陽(yáng)離子交換樹脂所吸附（本實(shí)驗(yàn)采用荷，可被陽(yáng)離子交換樹脂所吸附（本實(shí)驗(yàn)采用CM-纖維素離子交換樹脂）；而帶纖維素離子交換樹脂）；而帶負(fù)電荷的雜蛋白不被吸附而除去，帶正電荷的雜蛋白也被吸附，但不同蛋白與樹負(fù)電荷的雜蛋白不被吸附而除

7、去，帶正電荷的雜蛋白也被吸附，但不同蛋白與樹脂的吸附能力不同，通過(guò)增加緩沖液中的離子強(qiáng)度及提高脂的吸附能力不同，通過(guò)增加緩沖液中的離子強(qiáng)度及提高pH，可將蛋白從樹脂上，可將蛋白從樹脂上洗脫下來(lái)。洗脫下來(lái)。n在不同的離子強(qiáng)度下，可將不同的蛋白分別洗脫（結(jié)合力弱的蛋白最先洗脫，結(jié)在不同的離子強(qiáng)度下，可將不同的蛋白分別洗脫（結(jié)合力弱的蛋白最先洗脫，結(jié)合力強(qiáng)的蛋白最后洗脫）。合力強(qiáng)的蛋白最后洗脫）。n通過(guò)以上離子交換層析法，即可將目的蛋白和雜蛋白分開，從而通過(guò)以上離子交換層析法，即可將目的蛋白和雜蛋白分開，從而得到純化。得到純化。3. 離子交換層析法離子交換層析法實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理三、胰蛋白酶活性測(cè)定原

8、理三、胰蛋白酶活性測(cè)定原理n胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基酸（如精氨酸、對(duì)于由堿性氨基酸（如精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所組成的肽鍵具有專一性。賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所組成的肽鍵具有專一性。特別表現(xiàn)在對(duì)堿性氨基酸羧基一側(cè)的選擇性。特別表現(xiàn)在對(duì)堿性氨基酸羧基一側(cè)的選擇性。 n本實(shí)驗(yàn)以酪蛋白為底物的方法來(lái)測(cè)定胰蛋白酶活力，其主本實(shí)驗(yàn)以酪蛋白為底物的方法來(lái)測(cè)定胰蛋白酶活力，其主要用于測(cè)定胰蛋白酶粗制品的活力。要用于測(cè)定胰蛋白酶粗制品的活力。n胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的小分子肽以胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙

9、酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定濃度范圍內(nèi)酶的水解濾液在波長(zhǎng)及氨基酸。在一定濃度范圍內(nèi)酶的水解濾液在波長(zhǎng)280nm處光吸收處光吸收的增值與胰蛋白酶的活力單位成正比的增值與胰蛋白酶的活力單位成正比。n活力單位的定義：在一定條件下每分鐘酶水解底物活力單位的定義：在一定條件下每分鐘酶水解底物酪蛋白形成的溶液在酪蛋白形成的溶液在280nm處吸處吸光度光度A280增加一個(gè)單位的酶量為一個(gè)蛋白酶活力單位（增加一個(gè)單位的酶量為一個(gè)蛋白酶活力單位（U）。）。實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 n一、豬胰蛋白酶的分離純化一、豬胰蛋白酶的分離純化 n二、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定二、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定n三、酶活力的測(cè)定三、酶活力的測(cè)定n四、

10、純化效果測(cè)定四、純化效果測(cè)定 SDS-PAGE電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法一、一、豬胰蛋白酶的分離純化豬胰蛋白酶的分離純化 n（1）粗豬胰蛋白酶的提取粗豬胰蛋白酶的提取 n（2）透析）透析n（3）離子交換層析法純化豬胰蛋白酶）離子交換層析法純化豬胰蛋白酶 n實(shí)驗(yàn)具體操作參見實(shí)驗(yàn)具體操作參見實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法一、一、豬胰蛋白酶的分離純化豬胰蛋白酶的分離純化n豬胰臟去脂肪和結(jié)締組織，切碎，稱重約豬胰臟去脂肪和結(jié)締組織，切碎，稱重約50 g50 g 加入加入5 5倍體積預(yù)冷的倍體積預(yù)冷的pH2.5pH2.5乙酸酸化水乙酸酸化水n組織搗碎組織搗碎n提取、過(guò)濾（四層紗布）、離心（提取、

11、過(guò)濾（四層紗布）、離心（44下，下，10000 rpm10000 rpm，離心，離心15 min 15 min ）取上清（記錄取上清（記錄體積，收集約體積，收集約1.5 mL1.5 mL，作為留樣，作為留樣1 1，測(cè)蛋白含量，及時(shí)，測(cè)蛋白含量，及時(shí)SDSSDS化）化）n加入固體無(wú)水氯化鈣粉末加入固體無(wú)水氯化鈣粉末n為豬胰蛋白酶原的激活提供為豬胰蛋白酶原的激活提供CaCa2+2+（含有（含有0.1 mol/L CaCl0.1 mol/L CaCl2 2 ）需計(jì)算需計(jì)算CaClCaCl2 2的用量。的用量。n加入極少量豬胰蛋白酶（約加入極少量豬胰蛋白酶（約2-5mg2-5mg）n 調(diào)調(diào)pHpH為為

12、 8.0 8.0 、于、于2525下活化下活化4646小時(shí)，（小時(shí)，（1 1小時(shí)取樣一次，并用小時(shí)取樣一次，并用0.001mol/L HCl0.001mol/L HCl稀釋），測(cè)定酶活性增加的情況；稀釋），測(cè)定酶活性增加的情況；n比活約比活約3500350040004000單位時(shí)，活化完成。單位時(shí)，活化完成。n用用2.5 mol/L H2SO42.5 mol/L H2SO4調(diào)調(diào)pHpH至至2.52.53.0(3.0(收集約收集約1.5 mL1.5 mL，作為留樣，作為留樣2 2，測(cè)蛋白含量，及時(shí)，測(cè)蛋白含量，及時(shí)SDSSDS化化 ) )n硫酸銨鹽析沉淀（硫酸銨鹽析沉淀（75%75%飽和度）飽和

13、度） 計(jì)算硫酸銨用量時(shí)需扣除形成硫酸鈣的量。計(jì)算硫酸銨用量時(shí)需扣除形成硫酸鈣的量。 （于（于44靜置靜置過(guò)夜）過(guò)夜）n離心（離心離心（離心10000 rpm10000 rpm，15 min15 min）取沉淀（為粗胰蛋白酶取沉淀（為粗胰蛋白酶 ）（1） 粗豬胰蛋白酶的提取粗豬胰蛋白酶的提取 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法一、一、豬胰蛋白酶的分離純化豬胰蛋白酶的分離純化n將粗胰蛋白酶溶于適量預(yù)冷的將粗胰蛋白酶溶于適量預(yù)冷的0.001 mol/L HCl溶液中（用溶液中（用2 mol/L HCl調(diào)蒸調(diào)蒸餾水餾水pH至至3即可！）。即可！）。n在在4下對(duì)下對(duì)0.001 mol/L HCl溶液透析溶液透析3小時(shí)左右

14、（小時(shí)左右（每小時(shí)換液每小時(shí)換液1次次 ?。﹏而后改用而后改用0.01 mol/L , pH5.0檸檬酸鈉緩沖液透析（檸檬酸鈉緩沖液透析（至少換液至少換液3次，第一次次，第一次1小時(shí)后換液，第二次是小時(shí)后換液，第二次是2小時(shí)后換液，第三次是小時(shí)后換液，第三次是3小時(shí)后換液，然后過(guò)小時(shí)后換液，然后過(guò)夜透析夜透析 ！） （記錄樣品體積，收集約（記錄樣品體積，收集約1.5 mL，作為留樣，作為留樣3，測(cè)蛋白含量，及時(shí)，測(cè)蛋白含量，及時(shí)SDS化）化）（2）透析）透析恒流泵恒流泵部分收集器部分收集器離子交換柱離子交換柱離子交換流程簡(jiǎn)圖離子交換流程簡(jiǎn)圖實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法一、豬胰蛋白酶的分離純化一、豬胰蛋白酶

15、的分離純化（3）離子交換層析法純化豬胰蛋白酶）離子交換層析法純化豬胰蛋白酶 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法一、一、豬胰蛋白酶的分離純化豬胰蛋白酶的分離純化n柱的平衡：用柱的平衡：用0.01 mol/L , pH5.0檸檬酸鈉緩沖液平衡檸檬酸鈉緩沖液平衡CM-纖維素離纖維素離子交換柱子交換柱n樣品吸附：用恒流泵樣品吸附：用恒流泵直接上樣于直接上樣于CM-纖維素離子交換柱纖維素離子交換柱n洗滌：以洗滌：以0.01 mol/L , pH5.0檸檬酸鈉緩沖液充分洗凈未吸附檸檬酸鈉緩沖液充分洗凈未吸附蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)n洗脫洗脫1：用：用0.05 mol/L , pH5.0，檸檬酸鈉緩沖液洗脫，并分部，檸檬酸鈉緩沖液洗脫，

16、并分部收集樣品，測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白含量，做層析曲線，將出現(xiàn)一收集樣品，測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白含量，做層析曲線，將出現(xiàn)一個(gè)蛋白峰（收集樣品為留樣個(gè)蛋白峰（收集樣品為留樣4），此峰為豬胰凝乳蛋白酶。），此峰為豬胰凝乳蛋白酶。n洗脫洗脫2：待胰凝乳蛋白酶峰過(guò)后，改用：待胰凝乳蛋白酶峰過(guò)后，改用0.1 mol/L , pH6.0，檸檬酸鈉，檸檬酸鈉緩沖液洗脫，并分部收集樣品，測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白含量，做層析曲緩沖液洗脫，并分部收集樣品，測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白含量，做層析曲線，將出現(xiàn)一個(gè)蛋白峰（收集樣品為留樣線，將出現(xiàn)一個(gè)蛋白峰（收集樣品為留樣5），此峰為豬胰蛋白酶。），此峰為豬胰蛋白酶。n柱的再生柱的再生（4）

17、離子交換層析法純化豬胰蛋白酶）離子交換層析法純化豬胰蛋白酶 裝柱裝柱 平衡平衡 沿壁倒下沿壁倒下均勻均勻無(wú)氣泡、裂紋無(wú)氣泡、裂紋裝柱裝柱平衡平衡離子交換樹脂離子交換樹脂1 ml/min0.01 mol/L , pH5.0檸檸檬酸鈉緩沖液檬酸鈉緩沖液 3cm3cm0.01 mol/L , pH5.0檸檬酸鈉緩沖液檸檬酸鈉緩沖液恒流泵恒流泵上樣上樣用用0.01 mol/L , pH5.0檸檬酸鈉緩沖液透析后的檸檬酸鈉緩沖液透析后的粗酶液粗酶液注：需將未吸附樣注：需將未吸附樣品（流穿）進(jìn)行品（流穿）進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)！檢測(cè)！恒流泵恒流泵洗滌洗滌0.01 mol/L , pH5.0檸檬酸鈉檸檬酸

18、鈉緩沖液緩沖液恒流泵恒流泵洗脫洗脫1 10.05 mol/L , pH5.0，檸檬酸鈉緩沖液檸檬酸鈉緩沖液離子交換柱離子交換柱部分收集器部分收集器恒流泵恒流泵洗脫洗脫2 20.1 mol/L , pH6.0，檸檬酸，檸檬酸鈉緩沖液鈉緩沖液離子交換柱離子交換柱部分收集器部分收集器實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法二、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定二、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定n方法：紫外吸收法方法：紫外吸收法n所測(cè)樣品：所測(cè)樣品：n豬胰蛋白酶純化過(guò)程中的預(yù)留樣品豬胰蛋白酶純化過(guò)程中的預(yù)留樣品1樣品樣品5，用來(lái)計(jì)算，用來(lái)計(jì)算比活和純化倍數(shù)；比活和純化倍數(shù)；n離子交換層析過(guò)程中的分部收集樣品，用來(lái)作層析曲線離子交換層析過(guò)程中的分部收集樣品，

19、用來(lái)作層析曲線（以樣品管號(hào)為橫坐標(biāo)，以（以樣品管號(hào)為橫坐標(biāo)，以A280A280為縱坐標(biāo)作曲線）為縱坐標(biāo)作曲線）實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法三、酶活力的測(cè)定三、酶活力的測(cè)定n取取3支試管按支試管按13編號(hào)：編號(hào)： 1為樣品管、為樣品管、 2 為對(duì)照管、為對(duì)照管、 3為空白管為空白管n1為樣品管為樣品管n稀釋酶液（根據(jù)蛋白含量測(cè)定結(jié)果，用稀釋酶液（根據(jù)蛋白含量測(cè)定結(jié)果，用0.1mol/L Tris-HCl、pH 8.0緩沖液稀釋至緩沖液稀釋至1080g/mL ）后，取）后，取 1 ml；n精確加入精確加入1mL 37 預(yù)熱的預(yù)熱的10 mg/mL酪蛋白溶液；酪蛋白溶液；n混勻，立即置于混勻，立即置于37水浴中

20、，準(zhǔn)確反應(yīng)水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)10min；n加入加入3 mL 8三氯乙酸三氯乙酸 ，迅速搖勻，終止反應(yīng)；，迅速搖勻，終止反應(yīng)；n離心（離心（ 3000 r/min,5min）取上清；取上清；n測(cè)測(cè)A280 1. 測(cè)定方法測(cè)定方法n2 為對(duì)照管為對(duì)照管n精確加入精確加入37 1ml預(yù)熱的預(yù)熱的10 mg/mL酪蛋白溶液；酪蛋白溶液；n加入加入3 mL 8三氯乙酸三氯乙酸 ，迅速搖勻；，迅速搖勻；n加加1 mL稀釋酶液（與樣品管相同）；稀釋酶液（與樣品管相同）；n混勻，立即置于混勻，立即置于37水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)10min；n離心（離心（ 3000 r/min,5min）取上清取上清n測(cè)

21、測(cè)A280 n3為空白管為空白管n分別加入分別加入 3 mL 8三氯乙酸和三氯乙酸和2 mL 0.1 mol/L Tris-HCl、pH 8.0 緩沖液，緩沖液， n離心（離心（ 3000 r/min,5min）取上清取上清n用該樣品作為空白，用來(lái)測(cè)定樣品管（用該樣品作為空白，用來(lái)測(cè)定樣品管（1 ）和對(duì)照）和對(duì)照管（管（ 2 ）的）的A280。實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法三、酶活力的測(cè)定三、酶活力的測(cè)定n胰蛋白酶活力單位數(shù)胰蛋白酶活力單位數(shù)= A280/tn式中，式中， A280樣品管樣品管A280-對(duì)照管對(duì)照管A280n t反應(yīng)時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間（min）n比活力比活力=酶活力單位酶活力單位/毫克蛋白質(zhì)毫克

22、蛋白質(zhì)=A280/CVtn式中，式中， A280樣品管樣品管A280-對(duì)照管對(duì)照管A280 C每個(gè)樣品管中酶液的濃度（每個(gè)樣品管中酶液的濃度（mg/mL） V每個(gè)樣品管中酶液體積（每個(gè)樣品管中酶液體積（mL) t反應(yīng)時(shí)間（反應(yīng)時(shí)間（min）2. 胰蛋白酶活力的計(jì)算胰蛋白酶活力的計(jì)算 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法三、酶活力的測(cè)定三、酶活力的測(cè)定n豬胰蛋白酶純化過(guò)程中的預(yù)留樣品豬胰蛋白酶純化過(guò)程中的預(yù)留樣品1樣品樣品5，用來(lái)計(jì)算，用來(lái)計(jì)算比活和純化倍數(shù)；比活和純化倍數(shù)；n離子交換層析過(guò)程中的分部收集樣品中，蛋白峰離子交換層析過(guò)程中的分部收集樣品中，蛋白峰附近的樣品。附近的樣品。3. 需測(cè)樣品需測(cè)樣品實(shí)驗(yàn)方法實(shí)

23、驗(yàn)方法四、純化效果檢測(cè)四、純化效果檢測(cè)n用用12 的的SDSPAGE檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。染色。n粗酶液留樣粗酶液留樣1，n胰酶激活后樣品留樣胰酶激活后樣品留樣2，n透析后的樣品透析后的樣品3（上柱前樣品）（上柱前樣品）n未吸附樣品（流穿）未吸附樣品（流穿）n離子交換層析后洗脫離子交換層析后洗脫1（留樣（留樣4 ）n離子交換層析后洗脫離子交換層析后洗脫2中活力較高樣品（留樣中活力較高樣品（留樣5）實(shí)驗(yàn)結(jié)果n1離子交換層析后收集各管樣品的蛋白含量及活離子交換層析后收集各管樣品的蛋白含量及活性。性。n2. 以管數(shù)為橫坐標(biāo)、以以管數(shù)為橫坐標(biāo)、以A280及活性為縱坐標(biāo)，制及活性為縱坐標(biāo)，制作雙坐標(biāo)圖的作雙坐標(biāo)圖的離子交換層析曲線離子交換層析曲線。n3測(cè)定粗酶液、胰酶激活后樣品、離子交換層析測(cè)定粗酶液、胰酶激活后樣品、離子交換層析收集管中樣品液的體積及酶活力，完成收集管中樣品液的體積及酶活力，完成純化表格純化表格。n4S