實驗三細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及革蘭染色

1、實驗三細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及革蘭染色實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?掌握細(xì)菌的基本形態(tài)及特殊結(jié)構(gòu) 2 掌握革蘭染色的原理、方法、結(jié)果3 掌握油鏡的使用原理及使用方法實驗原理實驗原理 G染色原理：等電點學(xué)說 化學(xué)學(xué)說 通透性學(xué)說實驗用品實驗用品1、菌種 培養(yǎng)24h的葡萄球菌、大腸桿菌。2、染液革蘭氏染液 草酸銨結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、稀釋石炭酸復(fù)紅染液。3、其他物品 接種環(huán)、吸水紙、酒精燈、載玻片、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙、細(xì)菌標(biāo)本片等。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容細(xì)菌的基本形態(tài)、特殊結(jié)構(gòu)（示教）細(xì)菌的G染色（操作，6人/組）病原生物學(xué)實驗室守則病原生物學(xué)實驗室守則1 1、學(xué)生進(jìn)實驗室應(yīng)穿好實驗室專用隔離衣；與實驗

2、無關(guān)物品不、學(xué)生進(jìn)實驗室應(yīng)穿好實驗室專用隔離衣；與實驗無關(guān)物品不準(zhǔn)帶入實驗室，所有實驗材料嚴(yán)禁帶出實驗室。準(zhǔn)帶入實驗室，所有實驗材料嚴(yán)禁帶出實驗室。2 2、實驗室內(nèi)禁止吸煙及飲食。、實驗室內(nèi)禁止吸煙及飲食。3 3、嚴(yán)格操作規(guī)程，杜絕生物安全事故。污染標(biāo)本及使用過的有菌器材、嚴(yán)格操作規(guī)程，杜絕生物安全事故。污染標(biāo)本及使用過的有菌器材放于指定的消毒缸內(nèi)，統(tǒng)一進(jìn)行消毒處理。需要培養(yǎng)的物品做好放于指定的消毒缸內(nèi)，統(tǒng)一進(jìn)行消毒處理。需要培養(yǎng)的物品做好標(biāo)記，放于指定培養(yǎng)箱內(nèi)。標(biāo)記，放于指定培養(yǎng)箱內(nèi)。4 4、如在實驗過程中發(fā)生有菌材料濺出、污染環(huán)境或化學(xué)藥品灼傷等意外、如在實驗過程中發(fā)生有菌材料濺出、污染環(huán)

3、境或化學(xué)藥品灼傷等意外情況，應(yīng)立即報告老師，以便及時處理。情況，應(yīng)立即報告老師，以便及時處理。 5 5、愛護(hù)儀器設(shè)備，不經(jīng)老師批準(zhǔn)，不準(zhǔn)自行接通、斷開電源或拆、愛護(hù)儀器設(shè)備，不經(jīng)老師批準(zhǔn)，不準(zhǔn)自行接通、斷開電源或拆卸儀器。對儀器設(shè)備造成人為損壞的，要酌情賠償。實驗結(jié)束卸儀器。對儀器設(shè)備造成人為損壞的，要酌情賠償。實驗結(jié)束后，儀器設(shè)備狀態(tài)復(fù)原。后，儀器設(shè)備狀態(tài)復(fù)原。6 6、實驗結(jié)束后，清潔臺面、所有循環(huán)使用器材復(fù)原；安排值日生打掃、實驗結(jié)束后，清潔臺面、所有循環(huán)使用器材復(fù)原；安排值日生打掃衛(wèi)生；檢查水、電、門、窗等設(shè)施，并經(jīng)實驗室負(fù)責(zé)人檢查認(rèn)可。衛(wèi)生；檢查水、電、門、窗等設(shè)施，并經(jīng)實驗室負(fù)責(zé)人檢

4、查認(rèn)可。7 7、用肥皂或消毒液洗手、脫隔離衣后方可離開實驗室。、用肥皂或消毒液洗手、脫隔離衣后方可離開實驗室。一、一、細(xì)菌基本形態(tài)、特殊結(jié)構(gòu)觀察細(xì)菌基本形態(tài)、特殊結(jié)構(gòu)觀察（一）、細(xì)菌基本形態(tài)觀察（一）、細(xì)菌基本形態(tài)觀察1. 球菌：球菌：G+：葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌：葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌 G-：淋球菌：淋球菌2. 桿菌：大腸桿菌桿菌：大腸桿菌（G-） 3. 螺形菌：霍亂弧菌（螺形菌：霍亂弧菌（G-）葡萄球菌鏈球菌肺炎球菌 痰液中的肺炎鏈球菌痰液中的肺炎鏈球菌（革蘭染色，（革蘭染色，10001000）肺炎鏈球菌電鏡圖 淋球菌淋球菌大腸埃希菌霍亂弧菌（二）、細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)觀察（二）、細(xì)菌特殊

5、結(jié)構(gòu)觀察 莢膜：肺炎球菌莢膜：肺炎球菌 鞭毛：變形桿菌（周鞭毛）、霍亂弧菌（單鞭毛）鞭毛：變形桿菌（周鞭毛）、霍亂弧菌（單鞭毛） 芽胞：破傷風(fēng)桿菌（頂端）、炭疽桿菌（中部）芽胞：破傷風(fēng)桿菌（頂端）、炭疽桿菌（中部）v概念概念:某些細(xì)菌在其細(xì)胞壁外包繞一層粘液性物質(zhì)v生物學(xué)意義生物學(xué)意義: 1.保護(hù)細(xì)菌，與細(xì)菌致病性致病性有關(guān) 2.用于細(xì)菌的鑒別與分型鑒別與分型肺炎鏈球菌莢膜肺炎鏈球菌莢膜莢膜莢膜肺炎鏈球菌v概念：概念：許多細(xì)菌在菌體上附有細(xì)長并呈波狀彎曲的絲狀物v生物學(xué)意義生物學(xué)意義 1.鞭毛是運動器官運動器官。有鞭毛的細(xì)菌能主動運動，可通過動力試驗進(jìn)行細(xì)菌鑒定。 2.有的細(xì)菌其鞭毛與致病性有

6、關(guān)與致病性有關(guān)。 3.可作為細(xì)菌分類、分型的依據(jù)分類、分型的依據(jù)。變形桿菌（周鞭毛）變形桿菌（周鞭毛）鞭毛鞭毛霍亂弧菌（單鞭毛）霍亂弧菌（單鞭毛）v概念概念:某些細(xì)菌在一定的環(huán)境條件下，能在菌體內(nèi)部形成一個圓形或卵圓形小體，是細(xì)菌的休眠形式。v生物學(xué)意義生物學(xué)意義 1.芽胞抵抗力強(qiáng)，故應(yīng)以殺滅芽胞作為可靠的滅菌指標(biāo)滅菌指標(biāo)。高壓蒸汽滅菌法是殺滅芽孢最有效的方法。 2.芽胞的抵抗力強(qiáng)，可在自然界中存在多年，是重要的傳染源重要的傳染源。但芽胞并不直接引起疾病，只有發(fā)芽成為繁殖體發(fā)芽成為繁殖體后，才能迅速大量繁殖而致病。 3. 鑒別細(xì)菌鑒別細(xì)菌 每種細(xì)菌形成一種類型芽胞芽胞的大小、形狀、位置等隨菌種

7、而異，有重要的鑒別意芽胞的大小、形狀、位置等隨菌種而異，有重要的鑒別意義義炭疽芽胞桿菌炭疽芽胞桿菌肉毒梭菌肉毒梭菌破傷風(fēng)桿菌破傷風(fēng)桿菌 二、革蘭染色法二、革蘭染色法v革蘭染色法是細(xì)菌學(xué)中最廣泛使用的一種鑒別染色法。由丹麥醫(yī)師Christian Gram創(chuàng)立。v方法是先將細(xì)菌用結(jié)晶紫染色，加媒染劑（增加染料和細(xì)胞的親和力）媒染后，用脫色劑（乙醇）脫色，再用復(fù)染劑染色。G G+ +菌菌G G- -菌菌一 一 半 半結(jié)晶紫結(jié)晶紫盧戈氏碘液盧戈氏碘液95%95%乙醇乙醇石碳酸復(fù)紅石碳酸復(fù)紅初染 媒染 脫色 復(fù)染（一）、革蘭染色原理（一）、革蘭染色原理等電點學(xué)說等電點學(xué)說PI 23PI 45帶負(fù)電荷多帶

8、負(fù)電荷多帶負(fù)電荷少帶負(fù)電荷少化學(xué)學(xué)說化學(xué)學(xué)說含核糖核酸鎂鹽多含核糖核酸鎂鹽多含核糖核酸鎂鹽少含核糖核酸鎂鹽少通透性學(xué)說通透性學(xué)說低低高高肽聚糖多，脂質(zhì)少肽聚糖多，脂質(zhì)少肽聚糖少，脂質(zhì)多肽聚糖少，脂質(zhì)多酒精不易進(jìn)入酒精不易進(jìn)入酒精易進(jìn)入酒精易進(jìn)入（二）、（二）、 G G染色步驟與方法染色步驟與方法 1、涂片制備、涂片制備 涂片 干燥 固定 2、染色、染色 初染（結(jié)晶紫） 1min 媒染（盧戈氏碘液） 1min 脫色（95%乙醇） 30s 復(fù)染（石碳酸復(fù)紅） 30s 吸水紙吸干 3、鏡檢、鏡檢（油鏡下觀察）每次染色后都要進(jìn)行沖洗 時間：一、一、半、半葡萄球菌大腸桿菌（三）、（三）、G G染色結(jié)果染

9、色結(jié)果 革蘭氏陽性革蘭氏陽性 革蘭氏陰性革蘭氏陰性（四）、革蘭染色注意事項（四）、革蘭染色注意事項v涂片要均勻，不可太厚v干燥時切勿在火焰上直烤v染色時脫色最關(guān)鍵v細(xì)流水沖洗，不要直沖涂膜v涂片上積水不能太多，以免稀釋染液（五）、革蘭染色的意義（五）、革蘭染色的意義1 1、鑒別細(xì)菌、鑒別細(xì)菌 通過染色將細(xì)菌分為G+、G-兩大類細(xì)菌2 2、研究與致病性的關(guān)系、研究與致病性的關(guān)系 G+菌致病一般為外毒素 G-菌致病一般為內(nèi)毒素3 3、指導(dǎo)臨床用藥、指導(dǎo)臨床用藥 G+菌對青霉素、紅霉素、頭孢菌素敏感 G-菌對上述藥物不敏感，對鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素等敏感（一）油鏡工作原理（一）油鏡工作原

10、理v油鏡的透鏡非常小。在不加油的情況下，由于空氣和玻璃對光線的折射率不同，因此光線透過載玻片經(jīng)過空氣時發(fā)生散射，很少能夠進(jìn)入油鏡，造成物像不清。香柏油（n=1.515）的折光率與玻璃（n=1.52）相近，由于光線透入時不會因折射而減弱，因此視野明亮，物像清晰。三、顯微鏡油鏡的使用三、顯微鏡油鏡的使用目鏡目鏡物鏡物鏡載物臺載物臺集光器集光器光源光源鏡臂鏡臂粗螺旋粗螺旋細(xì)螺旋細(xì)螺旋（二）油鏡使用方法（二）油鏡使用方法1對光對光 接通電源，打開顯微鏡上的電源開關(guān)，內(nèi)置光源燈亮，并可調(diào)節(jié)亮度。使用油鏡時，接通電源，打開顯微鏡上的電源開關(guān)，內(nèi)置光源燈亮，并可調(diào)節(jié)亮度。使用油鏡時，應(yīng)將燈光調(diào)至最亮，聚光器

11、升至最高，光柵完全打開。應(yīng)將燈光調(diào)至最亮，聚光器升至最高，光柵完全打開。2標(biāo)本加油標(biāo)本加油 在細(xì)菌染色片的菌膜上滴加在細(xì)菌染色片的菌膜上滴加1滴香柏油，注意勿使載物臺傾斜，以免滴香柏油，注意勿使載物臺傾斜，以免鏡油流淌。鏡油流淌。3識別并轉(zhuǎn)換油鏡頭識別并轉(zhuǎn)換油鏡頭 油鏡有三種標(biāo)志：油鏡有三種標(biāo)志：放大倍數(shù)放大倍數(shù)100；鏡頭下緣有一圈白；鏡頭下緣有一圈白線；英文標(biāo)識線；英文標(biāo)識“oil”。找到油鏡，旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器（勿用手直接掰動鏡頭）使油鏡頭。找到油鏡，旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器（勿用手直接掰動鏡頭）使油鏡頭轉(zhuǎn)至載物臺中央。轉(zhuǎn)至載物臺中央。4調(diào)焦、觀察標(biāo)本調(diào)焦、觀察標(biāo)本 從側(cè)面觀察并緩慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋，使載

12、物臺上升至油鏡頭浸入從側(cè)面觀察并緩慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋，使載物臺上升至油鏡頭浸入油中并幾乎與玻片接觸（注意勿使兩者相碰）時為止；眼睛轉(zhuǎn)向目鏡觀察視野，并油中并幾乎與玻片接觸（注意勿使兩者相碰）時為止；眼睛轉(zhuǎn)向目鏡觀察視野，并往相反方向轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋緩慢下降載物臺，至視野中閃現(xiàn)標(biāo)本輪廓時為止；再轉(zhuǎn)換往相反方向轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋緩慢下降載物臺，至視野中閃現(xiàn)標(biāo)本輪廓時為止；再轉(zhuǎn)換細(xì)調(diào)螺旋調(diào)節(jié)至物像清晰。若直至油鏡頭脫離油滴仍未看到物象，可重復(fù)以上操作。細(xì)調(diào)螺旋調(diào)節(jié)至物像清晰。若直至油鏡頭脫離油滴仍未看到物象，可重復(fù)以上操作。（三）油鏡使用注意事項（三）油鏡使用注意事項v顯微鏡屬于精密儀器，使用時需仔細(xì)小心、避免震動。v調(diào)焦時切忌用力過猛、一味往一個方向調(diào)節(jié)，否則易損壞鏡頭或壓碎標(biāo)本片。v油鏡頭用后應(yīng)下降載物臺，取下標(biāo)本，立即用擦鏡紙順一個方向擦凈鏡頭上的油。若油已干，可在擦鏡紙上滴少許二甲苯擦