醋酸薄膜電泳

1、實(shí)驗(yàn)三 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳（Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins）1、掌握電泳法分離蛋白質(zhì)的原理2、熟悉醋酸纖維素薄膜電泳的操作、注意事項(xiàng)3、熟悉測(cè)定血清中各種蛋白質(zhì)相對(duì)百分含量 的方法4、了解AG的臨床意義 實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆蛛x蛋白質(zhì)的方法分離蛋白質(zhì)的方法分離方法分離方法沉淀法沉淀法鹽析法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法層析法層析法電學(xué)法電學(xué)法電泳法電泳法等電聚焦等電聚焦超速離心法超速離心法離子交換層析離子交換層析吸附層析吸附層析凝膠過(guò)濾（分子篩）凝膠過(guò)濾（分子篩）親和層析親和層析電泳 依據(jù)分子或顆粒所帶

2、電荷、形狀、大小等不同，因而在電場(chǎng)介質(zhì)中移動(dòng)速度不同，從而達(dá)到分離的技術(shù)。 一、電泳一、電泳PrCOO-NH2PrCOO-NH3+PrCOOHNH3+HOHHOHpHpI pH=pI pHpI 陰離子，向正極移動(dòng)陽(yáng)離子，向負(fù)極移動(dòng)電泳速度電泳速度: :帶電粒子在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)時(shí)，單帶電粒子在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)時(shí)，單位電場(chǎng)強(qiáng)度內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，以位電場(chǎng)強(qiáng)度內(nèi)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，以u(píng) u表示，表示，即即 V粒子運(yùn)動(dòng)的速度 X電場(chǎng)強(qiáng)度Q粒子所帶電荷 r粒子的半徑介質(zhì)的粘度VQu=X6r二、電泳的影響因素二、電泳的影響因素u 分離樣品的性質(zhì)分離樣品的性質(zhì)u 電泳介質(zhì)的電泳介質(zhì)的pHu 緩沖液的離子強(qiáng)度緩沖液的離子強(qiáng)度

3、u 電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度u 電滲作用電滲作用電滲作用電滲作用 在電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng).如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動(dòng)的速度加快；如果樣品原本是移向負(fù)極的，則泳動(dòng)的速度加快；如果樣品原本是如果樣品原本是移向正極的，則泳動(dòng)的速度減慢。移向正極的，則泳動(dòng)的速度減慢。 負(fù)極負(fù)極正極正極 表面帶負(fù)電荷表面帶負(fù)電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動(dòng)帶正電荷的水層攜帶粒子向負(fù)極移動(dòng) 三、電泳的分類三、電泳的分類支持介質(zhì)支持介質(zhì)不同紙電泳（Paper electrophorisis）醋酸纖維薄膜電泳（Cellulose Acetate electrophoresis）瓊脂凝膠電泳（Agar Gel e

4、lectrophoresis）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）支持介質(zhì)裝置形式支持介質(zhì)裝置形式不同： 平板式電泳 ； 垂直板式電泳 ； 垂直柱式電泳pH pH 的連續(xù)性的連續(xù)性不同： 連續(xù)pH 電泳 非連續(xù)pH 電泳血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳Cellulose acetate membrane electrophoresis of serum proteins 本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維膜為電泳支持物，分離各種血清蛋白。 醋酸纖維膜是由醋酸纖維加工制成的一種細(xì)密且薄的微孔膜。廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床中各種生物分子的分離分析中。實(shí)驗(yàn)原理醋酸纖維素較紙電泳的優(yōu)點(diǎn)n電滲作用影響

5、小n醋酸纖維素膜對(duì)蛋白的吸附小，幾乎無(wú)“拖尾”。n由于醋酸纖維素親水性小，所容納的緩沖液也較少，電流大部分是由樣品傳導(dǎo)，所以分離速度快。醋酸纖維素是纖維素（紙）的醋酸酯醋酸纖維素是纖維素（紙）的醋酸酯血清蛋白質(zhì)血清蛋白質(zhì)n 清蛋白和球蛋白n 清蛋白和1、2、-球蛋白電泳電泳 血清蛋白的等電點(diǎn)pI大多在7.5以下，在pH為8.6的巴比妥緩沖液中以負(fù)離子形式存在，并且蛋白質(zhì)的分子量、立體構(gòu)象、等電點(diǎn)及形狀也有差異，在電場(chǎng)中遷移速率不同，可以在醋酸纖維素薄膜上分離成清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、r球蛋白五個(gè)區(qū)帶 。預(yù)測(cè)電泳譜是預(yù)測(cè)電泳譜是什么樣？什么樣？血清蛋白電泳的正常組分 醋酸纖維膜電泳蛋

6、白組分變化的臨床意義（醋酸纖維膜電泳蛋白組分變化的臨床意義（A/GA/G） 可能相關(guān)疾病可能相關(guān)疾病清蛋清蛋白白1 1球蛋球蛋白白2 2球蛋球蛋白白球蛋球蛋白白球蛋球蛋白白骨髓瘤* *腎病綜合癥* * *腎炎* *肝硬化* *急性肝壞死 * *傳染性肝炎* * *急性感染初期* * * *慢性炎癥/感染后期* *低球蛋白血癥* * 實(shí)驗(yàn)步驟一、準(zhǔn)備與點(diǎn)樣一、準(zhǔn)備與點(diǎn)樣1、濾紙橋； 2、電泳槽； 3、醋酸纖維素薄膜；4、電泳槽膜支架； 5、電極室中央隔板 鑷子取出鑷子取出膜條膜條取一條取一條2.52.58cm8cm的膜條的膜條充分浸透在充分浸透在巴比妥緩沖巴比妥緩沖液中液中濾紙吸去濾紙吸去多余的

7、緩多余的緩沖液沖液無(wú)光面距一無(wú)光面距一端端1.5cm1.5cm（大（大拇指寬）處拇指寬）處作點(diǎn)樣線作點(diǎn)樣線點(diǎn)樣器下端點(diǎn)樣器下端粘上薄層血粘上薄層血清清垂直垂直點(diǎn)樣點(diǎn)樣 加樣時(shí)一定要呈直線，垂直分布均勻，這樣泳動(dòng)的區(qū)帶整齊不歪。加樣時(shí)一定要呈直線，垂直分布均勻，這樣泳動(dòng)的區(qū)帶整齊不歪。放置放置膜條膜條平衡平衡5分鐘分鐘通通電電關(guān)閉關(guān)閉電源電源點(diǎn)樣面點(diǎn)樣面向下向下點(diǎn)樣端點(diǎn)樣端置于置于陰極陰極膜條貼膜條貼緊濾紙，緊濾紙，拉直膜條拉直膜條電壓：電壓：120v/160v時(shí)間：時(shí)間：10min/50 min二、電泳二、電泳點(diǎn)樣線勿與濾紙橋接觸點(diǎn)樣線勿與濾紙橋接觸 通電后，不要用手或鑷子接觸電泳槽，通電后，

8、不要用手或鑷子接觸電泳槽，通電完畢，先切斷電源，以防觸電。通電完畢，先切斷電源，以防觸電。通電通電完畢完畢浸于染色液浸于染色液（氨基黑（氨基黑10B10B）中）中取出取出膜條膜條三、染色、脫色三、染色、脫色取出取出膜條膜條3min依次浸于依次浸于漂洗液漂洗液、濾紙吸濾紙吸干薄膜干薄膜各各5min直至直至漂凈漂凈白蛋白白蛋白1球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 2球蛋白球蛋白點(diǎn)樣線點(diǎn)樣線 球蛋白球蛋白取試管取試管6支，編號(hào)如下支，編號(hào)如下四、定量四、定量 ( (兩人的膜條共用兩人的膜條共用) ) 試管編號(hào)試管編號(hào)A1 12 200.4mol/LNaOH 6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3

9、.0ml蛋白條帶蛋白條帶 清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白無(wú)蛋白區(qū)無(wú)蛋白區(qū)充分振蕩、脫凈染料充分振蕩、脫凈染料比比 色色650nm、定、定 量量15min 原始數(shù)據(jù)：清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白A 表表1 1 血清各蛋白質(zhì)吸光值血清各蛋白質(zhì)吸光值儀器型號(hào)：儀器型號(hào)： 吸收波長(zhǎng)：吸收波長(zhǎng)： 實(shí)驗(yàn)時(shí)間：實(shí)驗(yàn)時(shí)間：實(shí)驗(yàn)結(jié)果1計(jì)算出各部分蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。清蛋白（2A / T）1001球蛋白（ 1 / T）1002球蛋白（ 2 / T）100球蛋白（/ T）100球蛋白（/ T）100光密度總和T2A+12 2

10、計(jì)算出清蛋白與球蛋白之比值（A/G）G=12注意事項(xiàng)1.點(diǎn)樣面為不光滑面，勿用手觸摸感知；2.點(diǎn)樣量適中，垂直點(diǎn)樣；3.點(diǎn)樣端接電泳儀負(fù)極；4.膜條與濾紙需貼緊，拉直；5.謹(jǐn)防觸電。1、電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的正極還是負(fù)極？為什么？2、電泳后，泳動(dòng)在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種成分？請(qǐng)分析原因。3、電泳圖譜清晰的關(guān)鍵是什么？如何正確操作？實(shí)驗(yàn)思考討論1.蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)？2.蛋白質(zhì)的鹽析？3.蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)有哪些？4.分離蛋白質(zhì)的方法有哪些？5.層析技術(shù)的分類及各自的原理。6.透析的原理？實(shí)驗(yàn)四 血清-球蛋白的提純待分離大分子的性質(zhì)待分離大分子的性質(zhì) 所帶的電荷、分子大小和形狀。分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。 pH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大。pH過(guò)高或過(guò)低會(huì)引起蛋白質(zhì)變性。電泳介質(zhì)的電泳介質(zhì)的pHpH緩沖液的離子強(qiáng)度緩沖液的離子強(qiáng)度u 離子強(qiáng)度過(guò)低，則緩沖能力差，不易維 持PH恒定；u 離子強(qiáng)度過(guò)高，在待分離分子周圍形成 較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離 子氛），降低了蛋白質(zhì)的帶電量