基因工程及其在食品的科學(xué)中應(yīng)用

1、基因工程及其在食品的科學(xué)中應(yīng)用1、質(zhì)粒載體、質(zhì)粒載體(1) 質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的生物學(xué)特性 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid) ：是指細(xì)菌等生物細(xì)胞內(nèi)一類獨(dú)立于染色體外而能：是指細(xì)菌等生物細(xì)胞內(nèi)一類獨(dú)立于染色體外而能自我復(fù)制的遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的遺傳物質(zhì) ，一般為，一般為(double strand，ds)的共價閉合環(huán)狀的共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circularDNA，cccDNA). 質(zhì)粒依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，是宿主的共生物質(zhì)粒依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，是宿主的共生物 pBR322的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 噬菌體顆粒的外殼是蛋白質(zhì)，內(nèi)部噬菌體

2、顆粒的外殼是蛋白質(zhì)，內(nèi)部是核酸是核酸 噬菌體的感染效率極高噬菌體的感染效率極高。 烈性噬菌體的生活周期烈性噬菌體的生活周期裂解循環(huán)裂解循環(huán)溶源態(tài)溶源態(tài)溫和噬菌體的生活周期溫和噬菌體的生活周期噬菌體的侵染循環(huán)噬菌體的侵染循環(huán)噬菌體是大腸桿菌的噬菌噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和體，它由外殼蛋白和DNA組成，組成，噬菌體顆粒由頭與噬菌體顆粒由頭與尾兩部分組成。頭部裝載了尾兩部分組成。頭部裝載了其整個基因組其整個基因組DNA。DNA為一長度約為一長度約48.5kb的的線狀雙鏈線狀雙鏈DNA分子，可以分子，可以分為三個區(qū)段：左臂、中央分為三個區(qū)段：左臂、中央?yún)^(qū)和右臂。在左臂和右臂的區(qū)和右臂。在

3、左臂和右臂的5處各有一處各有一12個堿基長的互個堿基長的互補(bǔ)單鏈補(bǔ)單鏈(從而構(gòu)成黏性末端從而構(gòu)成黏性末端)。DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)插入型載體插入型載體(insertion vector)，是指在基因組的非必要基因區(qū)內(nèi)有一種或不止一種限制酶的單一酶切位點(diǎn)可供外源DNA插入，而不缺失其本身任何片段的噬菌體載體 置換型置換型(取代型取代型)載體載體(replacement vector)，是指在基因組的非必要基因區(qū)內(nèi)兩個或兩個以上的限制酶切位點(diǎn)間的DNA區(qū)段可被插人的外源DNA片段所置換的噬菌體載體 M13噬菌體的侵染循環(huán)M13噬菌體的侵噬菌體的侵染循環(huán)染循環(huán)Cos質(zhì)粒質(zhì)粒pJB8u 核酸探針的類型和稱

4、謂常有以下幾種：核酸探針的類型和稱謂常有以下幾種： 基因組基因組DNA探針探針 核酸探針核酸探針 cDNA探針探針 (來源來源) RNA探針探針 化學(xué)合成的寡核苷酸探針化學(xué)合成的寡核苷酸探針 放射性標(biāo)記探針放射性標(biāo)記探針 32P、35S、3H、125I等標(biāo)記探針等標(biāo)記探針探針標(biāo)記探針標(biāo)記(標(biāo)記物種類標(biāo)記物種類) 非放射性標(biāo)記探針非放射性標(biāo)記探針 生物素、地高辛配體、熒光素生物素、地高辛配體、熒光素 體內(nèi)標(biāo)記法體內(nèi)標(biāo)記法 探針標(biāo)記法探針標(biāo)記法 化學(xué)標(biāo)記法化學(xué)標(biāo)記法 (方式方式) 體外標(biāo)記法體外標(biāo)記法 酶促標(biāo)記法酶促標(biāo)記法u 體內(nèi)標(biāo)記法：體內(nèi)標(biāo)記法：將經(jīng)放射性同位素標(biāo)記的化合物作為底物引入活細(xì)胞，

5、將經(jīng)放射性同位素標(biāo)記的化合物作為底物引入活細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞代謝處理而將生物大分子等加以標(biāo)記的方法經(jīng)細(xì)胞代謝處理而將生物大分子等加以標(biāo)記的方法 u 化學(xué)標(biāo)記法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針分子上的基團(tuán)發(fā)生化學(xué)標(biāo)記法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針分子上的基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而將標(biāo)記物接到探針分子上的方法化學(xué)反應(yīng)而將標(biāo)記物接到探針分子上的方法 u 酶促標(biāo)記法：是指將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸上，然后利用酶促方法將核苷酸酶促標(biāo)記法：是指將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸上，然后利用酶促方法將核苷酸摻入到探針分子中，或?qū)⒑塑账嵘系臉?biāo)記基團(tuán)交換到探針分子上的方法摻入到探針分子中，或?qū)⒑塑账嵘系臉?biāo)記基團(tuán)交換到探針分子上的

6、方法 根據(jù)酶促反應(yīng)的條件，又可將酶促標(biāo)記法分為根據(jù)酶促反應(yīng)的條件，又可將酶促標(biāo)記法分為： 切刻平移法切刻平移法 酶促標(biāo)記法酶促標(biāo)記法 隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法 末端標(biāo)記法末端標(biāo)記法 1、切刻平移法（、切刻平移法（nick translation）（1）原理）原理 利用利用DNaseI內(nèi)切酶活性、內(nèi)切酶活性、DNA聚合酶聚合酶I的的5 3 聚合酶活性和聚合酶活性和5 3外切酶活性。產(chǎn)生均勻標(biāo)記的探針。外切酶活性。產(chǎn)生均勻標(biāo)記的探針。 （2）流程）流程 在在Mg2+的存在下，利用的存在下，利用DNaseI的內(nèi)切核酸酶活性在待標(biāo)記的的內(nèi)切核酸酶活性在待標(biāo)記的DNA雙鏈上隨機(jī)形成單鏈切刻雙鏈上隨機(jī)形成單鏈

7、切刻利用大腸桿菌利用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的5 3核酸外切酶活性在切刻處將舊鏈從核酸外切酶活性在切刻處將舊鏈從5逐步切除逐步切除以互補(bǔ)的以互補(bǔ)的DNA單鏈單鏈為模板，利用大腸桿菌為模板，利用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的5 3聚合酶活性將聚合酶活性將dNTP(其其中一種或幾種經(jīng)過標(biāo)記中一種或幾種經(jīng)過標(biāo)記)順序連接到切刻順序連接到切刻3端的一端的一OH上，延伸合成上，延伸合成新的新的DNA單鏈，從而形成標(biāo)記的單鏈，從而形成標(biāo)記的DNA探針。探針。（3）特點(diǎn)）特點(diǎn) 適用于各種雙鏈適用于各種雙鏈DNA的標(biāo)記，不適用于單鏈的標(biāo)記，不適用于單鏈DNA和和RNA的標(biāo)記的標(biāo)記 5 33 5DNas

8、eI 5 33 5逐步切逐步切除除大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I5 3核酸外切酶活性核酸外切酶活性3 5 5 3大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I5 3聚合酶活性聚合酶活性 5 33 5單鏈探單鏈探針針標(biāo)記物來標(biāo)記物來自自DNTP切刻平移法制備探針的示意圖切刻平移法制備探針的示意圖53355335533553355335* * * * *(a)(b)(c)(d)(e)(a)雙鏈的DNA分子(b)帶有3-OH末端的單鏈缺口(c) pol從5-P移去一個核苷酸(d) pol將32P標(biāo)記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e)重復(fù)(c)(d)的步驟，缺口沿5-3方向移動，形成32P標(biāo)記的核苷酸合成的DNA鏈該法可從大量細(xì)菌中篩選含特異的DNA序列及基因工程重組體。帶有帶有DNA片段的凝膠片段的凝膠DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上上轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜雜交、顯影雜交、顯影凝膠凝膠濾膜濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有吸附有D