流式常用試劑配制

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上一、流式細胞術(shù)常用試劑1、10NaN3：將10gNaN3溶解于100ml蒸餾水中，室溫保存；活體實驗或在辣根過氧化酶反應(yīng)中可不使用NaN3。2、3BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10的NaN3。3、500mmol/L EDTA：將186g EDTANa22H2O溶解于400ml蒸餾水中，用NaOH將PH調(diào)至8.0，補充蒸餾水至500ml，分裝，高壓滅菌，室溫保存。4、4多聚甲醛：在磁力攪拌下，將4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入數(shù)滴NaOH，在通風柜中于60度加熱，使其溶解，調(diào)整PH至7.4，使用前新鮮配制。5、

2、消化液：0.25胰蛋白酶（用培養(yǎng)液或PBS配制）或0.25胰蛋白酶與0.02 EDTA的混合液。6、紅細胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA2Na 0.02g，溶于100ml水中，調(diào)PH至7.2，補充蒸餾水至500ml，4度儲存，使用時需恢復(fù)至室溫。7、流式細胞抗體稀釋劑：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）1BSA0.1Na2N3。8、常用細胞破膜劑：PBS液（PH 7.4）1FBS（或BSA）0.1NaN30.1saponin（Sigma的效果不錯）。9、流式細胞染色洗滌液：含2的BSA、0.1NaN3的PBS（PH 7.4）。10、PI染液（保存液，1

3、0×，用于細胞周期和凋亡檢測）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg無DNA酶的RNA酶，4度保存?zhèn)溆谩?yīng)用時，10倍稀釋，每管加0.3ml0.5ml PI染液。11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培養(yǎng)液、稀釋劑和細胞清洗液，不能單獨作為細胞、組織培養(yǎng)液）原液ANaCl 160gMgSO47H2O 2gKCl 8gMgCl6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml雙蒸水原液B1）Na2HPO412H2O 3.04gKH2PO4 1.2g葡萄糖 20.0g溶于800ml雙蒸水2）0.4酚紅溶液：取酚紅0.4g置玻璃研缽中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完

4、全溶解，約加入0.1N NaOH 10ml。將溶解的酚紅吸入100ml量瓶中，用雙蒸水洗下研缽中殘留的酚紅液，并入量瓶中，最后補加雙蒸水至100ml。將1）液和2）液混合，補加雙蒸水至1000ml即為原液B。應(yīng)用液： 原液A 1份原液B 1份雙蒸水 18份混合后，分裝于200ml小瓶中，高壓滅菌。臨用前用無菌的5.6NaHCO3調(diào)PH至7.27.6。 12、磷酸鹽緩沖液的配制（PB）A液（0.2mol/L NaH2PO4水溶液）：NaH2PO4H2O 27.6g，溶于蒸餾水中，稀釋至1000ml。B液（0.2mol/L Na2HPO4水溶液）： Na2HPO47H2O 53.6g 加蒸餾水溶解

5、，加水至1000ml。不同PH值PB的配制：A液xml（參照下表）中，加入B液yml，為0.2mol/L的PB。若再加蒸餾水至200ml，則成0.1mol/L PB。PH x/ml y/ml5.7 93.5 6.55.8 92.0 8.05.9 90.0 10.06.0 87.7 12.36.1 85.0 15.06.2 81.5 18.56.3 77.5 22.56.4 73.5 26.56.5 68.5 31.56.6 62.5 37.56.7 56.5 43.56.8 51.0 49.06.9 45.0 55.07.0 39.0 61.07.1 33.0 67.07.2 28.0 72.

6、07.3 23.0 77.07.4 19.0 81.07.5 16.0 84.07.6 13.0 87.07.7 10.0 90.07.8 8.50 91.07.9 7.00 93.08.0 5.30 94.7 13、PBS的配制配制PBS，只要在相應(yīng)的PB基液中加入8.5g/L NaCl即可。 二、常用激活劑1、激活劑PMA：用DMSO配制成0.1mg/ml，分裝20ul/管，20度保存。勿反復(fù)融凍。實驗時用無菌、無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲存液，終濃度為20ng/ml。2、激活劑離子霉素：用乙醇配制成濃度為0.5mg/ml的儲存液，20度保存。實驗時用無菌、無疊氮鈉PBS 1：10稀釋

7、儲存液，終濃度為1ug/ml。3、Staphylococcal enterotoxin B(SEB) ：用無菌無疊氮鈉PBS調(diào)節(jié)濃度0.5mg/mL，4儲存，SEB終濃度10ug/mL。4、CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑存在下活化未稀釋的血液細胞。5、CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應(yīng)，濃度一般為10ug/ml。6、阻斷劑Bregeldin A：用DMSO配制成濃度為5mg/ml的儲存液，分裝20ul/管，20度保存。勿反復(fù)融凍。實驗時用無菌、無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液，在激活過程最后45小時使用BFA，終濃度為10ug/ml。7、阻斷劑莫能菌素：用D

8、MSO配制成濃度為1mg/ml的儲存液，4儲存至少4個月，實驗時用無菌、無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液，終濃度為2umol/L。三、常用抗體標記熒光染料的特性及其應(yīng)用1、FITC：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長525nm。1）其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；2）在流式細胞儀的FL1通道檢測；3）可用于熒光顯微鏡技術(shù)4）熒光強度易受PH值影響，PH值降低時其熒光強度減弱。2、Alexa Fluor 488：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長519nm。1）其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；2）在流式細胞儀的FL1通道檢測；3）具有超乎

9、尋常的光穩(wěn)定性，非常適用于熒光顯微鏡技術(shù)；4）在較寬的PH值范圍內(nèi)保持穩(wěn)定（PH410）。3、Cy3：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長570nm。1）其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；2）在流式細胞儀的FL2通道檢測；3）適用于熒光顯微鏡技術(shù)；4）為小分子染料，非常適合需小分子染料的流式細胞術(shù)，熒光強度低于PE。4、Cy5：激發(fā)波長633/635nm，最大發(fā)射波長670nm。1）其標記的抗體適用于所有配備633nm氬離子激光器的流式細胞儀；2）在流式細胞儀的FL4通道檢測；3）適用于熒光顯微鏡技術(shù)；4）同樣為小分子染料，非常適合需小分子染料的流式細胞術(shù)，熒光強度低于

10、APC。5）與單核和粒細胞非特異性結(jié)合多，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 5、PE：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長575nm。1）其標記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細胞儀；2）在流式細胞儀的FL2通道檢測；3）其熒光泯滅性強，不適用于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術(shù)，但適用于激光共聚焦顯微鏡技術(shù)。6、PE-TR：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長615nm。1）在Beckman Coulter流式細胞儀的FL3通道檢測；2）可適用于小功率激光器的流式細胞儀，也可使用于大功率激光器的大流式細胞儀。7、PE-Alexa Fluor 610：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長628nm。1）在Beckma

11、n Coulter流式細胞儀的FL3通道檢測；2）熒光強度高；3）可適用于小功率激光器的流式細胞儀，也可使用于大功率激光器的大流式細胞儀。8、PE-Alexa Fluor 647：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長668nm。1）在Beckman Coulter流式細胞儀的FL4通道檢測，BD細胞儀FL3通道檢測；2）不易湮滅；3)可適用于小功率激光器的流式細胞儀，也可使用于大功率激光器的大流式細胞儀。9、PE-Cy5：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長670nm。1）在Beckman Coulter流式細胞儀的FL4通道檢測，BD細胞儀FL3通道檢測；2)可適用于大、小功率的流式細胞儀； 3）淬

12、滅性強，不適用于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術(shù)；4)可與FITC、PE搭配，熒光干擾小、補償小，但不宜與APC搭配。5）與單核細胞和粒細胞非特異性結(jié)合多。10、PE-Cy5.5：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長694nm。1）在Beckman Coulter流式細胞儀的FL4通道檢測，BD細胞儀FL3通道檢測；2)可適用于大、小功率的流式細胞儀； 3）淬滅性強，不適用于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術(shù)；4)可與FITC、PE、APC搭配，熒光干擾小、補償小，是APC比較理想的搭配。11、PE-Alexa Fluor 700：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長723nm。1）在Beckman Coulter流式細胞儀的

13、FL4通道檢測，BD細胞儀FL3通道檢測；2）光淬滅性很強，要絕對避光。12、PE-Cy7：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長767nm。1）在Beckman Coulter流式細胞儀的FL4通道檢測，BD細胞儀FL3通道檢測；2)可適用于大、小功率的流式細胞儀； 3）光淬滅性很強，要絕對避光；4）可與FITC、PE搭配，與FITC無光譜重疊，與APC搭配熒光干擾小，補償小，是比較理想的搭配。13、TR：激發(fā)波長595nm，最大發(fā)射波長615nm。1）其標記的抗體適用于配備Texas Red激光器的流式細胞儀；2）熒光不易淬滅，可用于熒光顯微鏡。14、APC：激發(fā)波長633/635nm，最大發(fā)射波長660nm。1）其標記的抗體適用于所有配備氦氖激光器的流式細胞儀；2）在BD細胞儀的FL4通道檢測，在Beckman Coulter細胞儀只有配備雙激光器的FC500才能檢測到。15、APC-Cy5.