第七章-納豆-新版

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第七章 納豆7.1 概述納豆 (Natto) 是日本的一種傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，由納豆菌 (Bacillus natto) 在一定溫度、濕度下發(fā)酵蒸煮大豆而成，作為日本人的主要佐餐食品已有兩千多年的歷史，在民間一直藥食兼用。成熟的納豆色澤金黃，表面覆有一層粘性物質(zhì)，挑起時(shí)有長長的拉絲狀物質(zhì)，如圖7-1 所示。納豆風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，具有多種保健功能，被譽(yù)為“超級(jí)健康食品”，深受日本人民的喜愛。目前，納豆已成為盛行于日本、加拿大、美國和歐洲一些國家的一種保健食品，我國也有企業(yè)開始生產(chǎn)和銷售。納豆在發(fā)酵過程中，納豆菌產(chǎn)生一種絲氨酸蛋白酶 (納豆激酶Nattokinase)，該

2、酶最早于1987年由日本宮崎醫(yī)科大學(xué)的須見洋行等發(fā)現(xiàn)。研究表明，納豆激酶具有纖溶活性，可以治療和預(yù)防血栓疾病。目前，關(guān)于納豆菌的研究和應(yīng)用主要集中在納豆激酶的作用上。但是，作為保健食品的納豆還具有多種保健功能，如溶血栓、抗腫瘤、降血壓、抗菌等作用，可預(yù)防骨質(zhì)疏松、提高蛋白質(zhì)的消化率、抗氧化等。圖7-1 納豆的形態(tài)7.2 納豆菌傳統(tǒng)制作納豆的方法是采用稻草作為發(fā)酵菌劑的來源，將煮熟的黃豆冷卻后用稻草包裹后于溫、濕度比較高的地方自然發(fā)酵12 d，待到黃豆表面出現(xiàn)一種白色的黏液狀物質(zhì)即可。目前在日本，納豆食品生產(chǎn)基本實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化、連續(xù)化和商品化。Sawamura是第一個(gè)將納豆中篩選出的桿菌命名納豆桿

3、菌的研究學(xué)者，Muto后來研究發(fā)現(xiàn)納豆桿菌屬于枯草芽孢桿菌屬，為需氧型革蘭氏陽性菌。自從1934年北海道大學(xué)農(nóng)學(xué)部半詢教授首次成功地將分離的純種納豆菌（Bacillus natto No.1）使用于納豆的工業(yè)化生產(chǎn)后，至今已知與納豆生產(chǎn)相關(guān)的主要純菌種有：BacillussubtilsIFO3007、BacillusnattoSawamura06、Bacillus natto Sawamura IFO 3339等?？莶菅挎邔俚闹匾攸c(diǎn)是能夠分泌各種胞外酶，包括蛋白酶、淀粉酶、谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶（GTP）、脂肪酶、果聚糖蔗糖酶和植酸酶，納豆菌分泌的酶比其它枯草芽孢桿菌分泌同樣活性的酶高幾十倍。納豆菌帶

4、有芽孢，因而能耐鹽和耐堿、耐高溫（100）及耐擠壓，在酸性胃環(huán)境中均能保持高度的穩(wěn)定性，在腸胃道中不增殖，只在腸道上段迅速發(fā)育轉(zhuǎn)變成具有新陳代謝作用的營養(yǎng)型細(xì)胞。納豆菌對(duì)營養(yǎng)要求不高，可以在人體腸道中定殖，對(duì)人體腸道中微生態(tài)的平衡具有很重要的作用。圖7-2 為納豆菌的生物學(xué)的形態(tài)。圖7-2 納豆菌的生物學(xué)形態(tài)7.2.1 納豆菌的主要保健作用納豆是大豆煮熟后經(jīng)接菌發(fā)酵而制成的功能食品，它除了保持原料大豆的營養(yǎng)外， 有些成分的含量比煮熟的大豆還要高，如蛋白質(zhì)、纖維、鈣、鐵、鉀、維生素B2、維生素B12等,特別是纖維、鈣、鐵、鉀的含量甚至超過了雞蛋。由于納豆發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種酶類，如淀粉酶、蛋白酶、

5、脂肪酶、纖維酶、溶菌酶和-谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶等，酶的作用使蛋白質(zhì)及其它營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生分解，因此，納豆的消化率（85）比煮熟大豆（68）的高，營養(yǎng)更容易被吸收。同時(shí)，納豆在發(fā)酵過程中還產(chǎn)生或增加許多對(duì)人體有益的活性物質(zhì)，如納豆激酶、異黃酮、超氧化物歧化酶（SOD）、皂甙素、生育酚、吡啶二羧酸、VK2等，納豆的營養(yǎng)與活性物質(zhì)使納豆在食用中體現(xiàn)了多種醫(yī)療保健功能。 1溶解血栓 須見洋行研究發(fā)現(xiàn)，納豆及納豆的生理鹽水浸提物能夠直接溶解纖維蛋白，是一種具有溶栓活性的酶制劑。該酶能強(qiáng)烈溶解血栓，定名為納豆激酶(natto kinase)。它由275個(gè)氨基酸殘基組成，不含二硫鍵，分子量依測定方法不同在2730035

6、000 道爾頓不等，根據(jù)氨基酸序列計(jì)算準(zhǔn)確的分子量為27728，無毒、無副作用，是一種中性絲氨酸蛋白酶。隨后，須見洋行又將納豆激酶用于健康人群的體內(nèi)研究，證明它除有顯著溶栓作用外，還有促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活劑能力，從而間接表現(xiàn)其溶栓活性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，每日食用納豆可以起到預(yù)防血栓類疾病的作用，特別是在晚飯時(shí)食用效果較佳。其原因是血栓類疾病如心肌梗死等往往是在上午發(fā)作，納豆激酶在進(jìn)入人體28 h內(nèi)血栓溶解的速率比較高，所以晚飯時(shí)食用有助于預(yù)防次日上午心肌梗死的發(fā)作。據(jù)報(bào)道，有心肌梗死危險(xiǎn)的患者，一次需投入尿激酶30萬單位，而50 g納豆中含有80萬單位尿激酶溶解血栓的作用。納豆激酶除具有

7、直接的溶栓作用外，還能將纖維蛋白溶酶原、尿激酶原激活，從而表現(xiàn)出間接的溶栓效果。由于此酶作用時(shí)間長，因此有利于臨床應(yīng)用。2抗腫瘤 納豆還具有防治癌癥的功效。許多研究證實(shí)，大豆作為納豆的原料含有多種抗癌物質(zhì)，除酚類和黃酮類之外，還富含膳食纖維以及硒，可預(yù)防乳腺癌、前列腺癌、皮膚癌、腎癌、尿道癌、大腸癌等。納豆除含有多種抗癌成分外，納豆菌本身也可有效地破壞或殺死癌細(xì)胞，刺激免疫系統(tǒng)誘發(fā)產(chǎn)生干擾素，起到抑制癌癥的功效。1967年，金澤大學(xué)藥學(xué)院的龜田報(bào)告了納豆抗癌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，他將Ehrlich肉瘤移植到鼠的左右足皮下，23 h后，在右足部注入納豆菌，11天后觀察，右足沒有癌細(xì)胞生成，而左足有癌細(xì)

8、胞生長。證實(shí)納豆菌能抑制癌細(xì)胞生長。龜田教授將有這種抗癌效果的納豆命名為KMD1126，但具體的抗癌活性物質(zhì)是什么當(dāng)時(shí)并不清楚。1995年高橋等通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，揭示了納豆中含有的抗癌活性物質(zhì)是一種含3032個(gè)碳的直鏈飽和烴，其中三十一碳烴在納豆中含量最多，活性也最高。目前研究證實(shí)，納豆中含有的5，7，4 三羥異黃酮(genistein)，是納豆中起抗癌作用的主要物質(zhì)，其含量是豆腐和豆奶中的5倍。此外，納豆中還含有胰蛋白酶抑制劑，其抗癌功效已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。納豆中含有染料木素（Genistein）和染料木苷（Genistin），類似枯草溶血素的脂肽，還含有豐富的植物雌激素和一種叫In

9、brafin的類黃酮色素形成成分，這些物質(zhì)有強(qiáng)烈的裂解功能，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。3降血壓 日本前帝國大學(xué)林右市等對(duì)納豆預(yù)防高血壓的效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。研究表明，納豆中含有降血壓作用的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，這種物質(zhì)存在于納豆中，但以納豆表面的黏稠物質(zhì)中含量更多。此抑制劑分水溶性和醇溶性兩種，其中水溶性抑制劑為高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，IC50為12 mg/mL；醇溶性抑制劑為低分子質(zhì)量物質(zhì)，具有兩種形態(tài)，抑制作用強(qiáng)于水溶性抑制劑，IC50分別為0.53 mg/mL和0.95 mg/mL，pH和溫度穩(wěn)定性好。這兩種形態(tài)的醇溶性抑制劑的抑制模型是不同的，一種是競爭性抑制，一種為非競爭性抑制。這種血管緊張肽

10、轉(zhuǎn)化酶抑制劑在不同的pH和溫度范圍內(nèi)均保持很好的穩(wěn)定性。因而，納豆具有預(yù)防和治療高血壓的作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使有遺傳性高血壓的老鼠每天攝入納豆，與攝入等量大豆的老鼠作為對(duì)照，結(jié)果食用納豆的鼠血壓波動(dòng)低于對(duì)照組。4抗氧化性、延緩衰老 從納豆和未經(jīng)發(fā)酵的大豆的對(duì)比實(shí)驗(yàn)可見，納豆顯示了比未經(jīng)發(fā)酵的大豆制品高得多的抗氧化性，它可抑制脂肪氧化達(dá)91，而后者只能抑制13，這可能與納豆中含有的抗氧化物質(zhì)，如異黃酮和-生育酚(維生素E)有關(guān)。經(jīng)常食用納豆可有效降低血脂、膽固醇及清除腦組織細(xì)胞中過氧化脂質(zhì)色素，調(diào)節(jié)皮膚細(xì)胞表水和脂肪平衡，促進(jìn)血液循環(huán)，改善皮膚彈性，使皮膚光潔柔軟，達(dá)到延緩衰老的功效。納豆中含有

11、大量的抗氧化物質(zhì)，如卵磷脂、異黃酮(isoflavones)、-生育酚（維生素E）、超氧化物歧化酶，還含有大量的皂甙素。另外，納豆對(duì)由過氧化物所引起的細(xì)胞傷害也有療效。最新報(bào)道，納豆中水溶性低分子質(zhì)量粘性物質(zhì)可防止動(dòng)脈硬化，降低脂類過氧化反應(yīng)，加強(qiáng)脂類代謝。5防治骨質(zhì)疏松 納豆中維生素K分為維生素K1 和維生素K2 兩種，其中維生素K1 包含在納豆內(nèi)，不溶于水；維生素K2 存在于納豆外面的黏性物質(zhì)中，溶于水，100 g納豆中約含1000 µg維生素K2 。維生素K2 可促進(jìn)生成骨蛋白質(zhì)（Osteocalcin），這種蛋白質(zhì)可與鈣共同生成骨質(zhì)，增加骨的密度，從而防治骨質(zhì)疏松癥。在日本調(diào)

12、查發(fā)現(xiàn)，消費(fèi)納豆較多的地區(qū)，骨折發(fā)生率顯著降低。食用納豆的東京女性血液中維生素K2的含量比不食用納豆的倫敦女性高15倍。須見洋行等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，進(jìn)食100 g納豆，4 h后血液中維生素K2的濃度最高可達(dá)原來的54倍。1995年，東京大學(xué)醫(yī)學(xué)部曾對(duì)6000例60歲以上的骨質(zhì)疏松患者進(jìn)行了調(diào)查研究，結(jié)果表明，服用維生素K2不僅可以減緩腰痛，而且骨骼的重量也增加了。易患骨折人的血液中的維生素K2的濃度僅是健康人的50左右，常吃納豆可以預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。每天食用10 g納豆就可為機(jī)體提供足夠的維生素K2。 6抗菌消炎 早在第二次世界大戰(zhàn)期間，納豆菌對(duì)于霍亂、傷寒菌和赤痢菌的抗菌效果就有過報(bào)道。研究表明

13、，納豆菌可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如桿菌肽、多黏菌素、2,6-吡啶二羧酸，對(duì)細(xì)菌、酵母和霉菌均具有一定的抗菌活性，具有抑制沙門菌、傷寒菌、痢疾菌及O-157、H7大腸桿菌等致病菌的作用，還可滅活葡萄球菌腸毒素。在抗生素使用前，日本民間長期用納豆治療痢疾、傷寒等消化道疾病，常食納豆可起到壯體防病作用。通過接種納豆菌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納豆可以提高機(jī)體的抵抗力，還可以誘發(fā)機(jī)體干擾素的生成，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。納豆也正由于具有這些抗菌物質(zhì)，才會(huì)在充分發(fā)酵后不易腐爛。 7提高蛋白質(zhì)消化率 納豆菌不產(chǎn)生毒素，是人體無病原性的安全菌球。它能分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶和脲酶等多種酶類。這些生物酶作為消化酶能夠

14、有效地發(fā)揮作用，有助于消化吸收，使納豆不僅保持了大豆幾乎不含膽固醇及脂肪酶含量高，營養(yǎng)均衡的優(yōu)點(diǎn)，且大大提高大豆的消化率，使大豆蛋白質(zhì)消化率由原來的50提高到85以上。這是由于有5060的大豆蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為肽和氨基酸，其中10是氨基酸。8調(diào)整腸功能 大豆中約有10碳水化合物，其中2/3是半纖維、纖維素和木質(zhì)素等食物纖維，可防止便秘，預(yù)防大腸癌和直腸癌，還有降脂減肥等功效。食用納豆后，納豆菌在腸中發(fā)芽增殖，作為營養(yǎng)物質(zhì)能在腸內(nèi)生活幾周，分泌各種酶和維生素，促進(jìn)小腸黏膜細(xì)胞的增殖。同時(shí)，納豆中的纖維素類物質(zhì)可以與寡糖偶合，從而促進(jìn)雙岐桿菌等益生菌的增殖，抑制致病菌的繁殖，對(duì)腸道菌群的微生態(tài)平衡起重要

15、作用，保證腸功能的正常。9降低膽固醇 納豆脂質(zhì)中亞油酸占全脂質(zhì)的50，有報(bào)道亞油酸能降低血漿中的膽固醇含量，有預(yù)防動(dòng)脈硬化、心臟病和高血壓的功效，故納豆具有降低膽固醇的作用。10其它功能 納豆中因含有多種維生素、卵磷脂、麻酸等，因此具有抗衰老、提高記憶力、防止酒醉、美容等保健功能。納豆中含有大量的黏性物質(zhì)，其主要成分是高聚谷氨酸，因其具有強(qiáng)烈的保濕性能和增稠等效果，被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)和農(nóng)業(yè)中。納豆菌產(chǎn)生的吡啶二羥酸結(jié)合金屬的能力很強(qiáng)，能夠清除體內(nèi)的放射性元素，常吃納豆可減少患白血病的幾率。納豆在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的菌絲黏液物質(zhì)，其成分為類果聚糖的混合物；果糖和-多聚谷氨酸，它被覆在黏膜的表層上，

16、可保護(hù)腸胃，防止醉酒。有些研究還認(rèn)為，大豆制品中的某些蛋白質(zhì)可促進(jìn)甲狀腺激素分泌，從而促進(jìn)糖和脂肪的分解代謝，提高和保持精力。7.2.2 納豆產(chǎn)品的開發(fā)納豆作為一種功能性食品在日本方興未艾。據(jù)日本納豆學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)，日本有2048家工廠生產(chǎn)納豆以供應(yīng)市場需要。在韓國，納豆也受到歡迎；在我國香港也有納豆上市，并得到許多人的喜愛；在美國，一種與納豆相類似的印尼豆食品日益成為美國人歡迎的健康食品。在我國，越來越多的人開始注重生活質(zhì)量，飲食營養(yǎng)與身體健康成為當(dāng)前人們的追求。據(jù)中國疾病控制中心的調(diào)查指出，今后的一段時(shí)間我國將處于老齡化高峰期，血栓疾病將呈現(xiàn)上升趨勢。對(duì)此，作為營養(yǎng)豐富的保健食品，納豆必將成為人

17、們的熱衷食物，其市場需求將會(huì)十分龐大。近年來，隨著一些科研單位和企業(yè)研制成功納豆食品，并投放到市場上后，已得到一些人的認(rèn)可。如燕京啤酒集團(tuán)引進(jìn)日本先進(jìn)的技術(shù)推出一系列納豆保健食品，成為目前國內(nèi)生產(chǎn)納豆的知名企業(yè)。投資設(shè)立的北京燕京中發(fā)生物技術(shù)有限公司，進(jìn)行年產(chǎn)1000噸納豆和30噸納豆素膠囊的研究和生產(chǎn)。天津市百德生物工程有限公司投入近千萬元，與中國農(nóng)業(yè)大學(xué)等科研院所合作，經(jīng)過多年的科研開發(fā)，采用獨(dú)特發(fā)酵工藝及有機(jī)大豆自行培育出優(yōu)良納豆菌種, 該公司生產(chǎn)出的納豆咀嚼片已投入市場，得到一些消費(fèi)者的喜愛。 納豆有一種特殊的味道,對(duì)于無法接受日本傳統(tǒng)納豆風(fēng)味,又希望獲得納豆功能性的消費(fèi)者，企業(yè)開發(fā)出

18、了另一種形態(tài)的納豆保健食品，將納豆的功能性成分提取出，并調(diào)制成不同風(fēng)味，生產(chǎn)功能性納豆保健品。目前，一些科研單位和企業(yè)在納豆保健功能開發(fā)上更多的是研究納豆激酶，通過液體發(fā)酵方法生產(chǎn)納豆激酶；或者提取發(fā)酵納豆的粘液成分做成納豆口服溶栓藥物和保健食品。如上?？的晟锟萍加邢薰?、河南洛陽華以生物工程有限公司、北京納百恩食品有限公司等都是與日本的研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)合作開發(fā)出了納豆激酶系列產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。食用納豆已有千年的歷史，但納豆的許多功能并沒有完全開發(fā)出來，特別是作為天然防腐劑的工業(yè)化產(chǎn)品還沒有，還須更多的科研單位和企業(yè)加入深入研究納豆的功能，將納豆及其延伸物的市場做大、做強(qiáng)。7.2.3 納

19、豆菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的種類納豆菌可產(chǎn)生許多抗菌素，如桿菌肽，多粘菌素和2，6吡啶二羧酸，這些物質(zhì)對(duì)痢疾桿菌、原發(fā)性大腸桿菌O-157、O-111、O-144、傷寒菌、沙門氏菌等，都有強(qiáng)烈的抑制作用，因此,納豆菌具有強(qiáng)烈的抗菌活性。有研究者通過混合培養(yǎng)試驗(yàn)，確認(rèn)了納豆菌和納豆成分對(duì)于病原性大腸桿菌O-157具有很強(qiáng)的抑制生長繁殖的效果，同時(shí)認(rèn)為2，6-吡啶羧酸是具有耐熱性的物質(zhì)。在過去的幾十年內(nèi)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)700多種肽類抗生素。這些肽類物質(zhì)被分為兩類，一類是非核糖體合成的肽類抗生素，另一類是由核糖體合成的天然肽類抗生素。桿菌肽和多粘菌素屬于非核糖體合成的肽類抗生素。非核糖體合成的肽類抗生素是由細(xì)菌、真

20、菌和鏈霉菌等分泌的具有抗菌活性的肽類物質(zhì)。納豆菌分泌的具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物為桿菌肽和多粘菌素。7.2.4 納豆菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的生理活性和抗菌機(jī)理 抗菌物質(zhì)的生理活性納豆菌生產(chǎn)的多粘菌素、桿菌肽和2，6-吡啶羧酸，它們有各自的抗菌活性和抗菌機(jī)理。多粘菌素包括多粘菌素B（polymyxin B）及多粘菌素E（polymyxin E；粘菌素，colistin），它們是多肽類抗生素，二者具有相似的藥理作用。對(duì)多數(shù)革蘭氏陰性桿菌有殺滅作用。多粘菌素E 的抗菌譜與多粘菌素B 相仿，但抗菌活性較比多粘菌素B 略差。多粘菌素的主要敏感菌有大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、布魯氏菌、弧菌、痢疾桿菌、

21、綠膿桿菌等，尤其對(duì)綠膿桿菌具有強(qiáng)大的殺菌作用。桿菌肽主要作用于革蘭氏陽性菌。桿菌肽對(duì)耐藥的金黃色葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌有效，對(duì)螺旋體和放線菌也有效，但對(duì)革蘭氏陰性菌無效。2,6-吡啶二羧酸在1936年由日本學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)納豆菌的芽孢中存在著2，6- 吡啶羧酸（納豆粘液中）。它是由于納豆菌發(fā)酵大豆才生成的，有一定的抗菌作用，且熱穩(wěn)定性好。 抗菌機(jī)理多肽類抗生素具有表面活性，含有帶陽電荷的游離氨基，能與革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的磷脂中帶陰電荷的磷酸根結(jié)合，使細(xì)菌細(xì)胞膜面積擴(kuò)大，通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的磷酸鹽、核苷酸等成份外漏，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。多粘菌素是通過破壞細(xì)菌胞膜，改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性而起

22、到殺菌作用的。桿菌肽是通過抑制革蘭氏陽性菌胞漿內(nèi)的肽聚糖前體轉(zhuǎn)變?yōu)榻沽姿彷拼?，從而起到抑菌作用的?，6- 吡啶羧酸對(duì)各類細(xì)菌廣泛具有抗菌作用的特性已經(jīng)得到了證明，但其抗菌作用機(jī)理還未完全弄清，目前國內(nèi)外均沒有報(bào)道。7.3 納豆菌的培養(yǎng)和抗菌性試驗(yàn)7.3.1 納豆菌的培養(yǎng)和抗菌粗提液的制備 納豆菌的培養(yǎng)菌種為日本高橋祐藏研究所保藏的高橋納豆菌(Bacillus natto.Takahashi)；培養(yǎng)基為：蛋白胨1.5 g/100mL%，葡萄糖1.5 g/100mL，KH2PO40.2 g/100mL，K2HPO40.4 g/100mL，MgSO4 0.05 g/100mL，pH7

23、.07.4。從斜面上挑取幾環(huán)菌種接入裝有70 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于37、100 r/min搖床振蕩培養(yǎng)1624 h得種子菌懸液。將種子菌懸液以3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，以同上的條件培養(yǎng)。定期取樣測定pH、OD600及抑菌活性，結(jié)果如圖7-3所示。圖7-3 納豆菌的發(fā)酵曲線從圖中可知，納豆菌生成迅速，發(fā)酵24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；整個(gè)發(fā)酵過程中pH值緩慢下降，最后穩(wěn)定在pH6.0。從抗菌活性看，培養(yǎng)6 h時(shí)，未發(fā)現(xiàn)抗菌活性，至12 h時(shí)有較強(qiáng)抗菌作用，在進(jìn)入穩(wěn)定期后抗菌活性最大，48 h后抗菌活性緩慢下降。 納豆菌抗菌粗提液的制備1發(fā)酵液中提取抗菌物質(zhì) 發(fā)酵液4下3500

24、 r/min 離心15 min去菌體,得到去細(xì)胞液, 6 mol/L的HCl調(diào)pH至2.0, 4 靜置過夜；次日, 4、10000 r/min離心15 min收集沉淀,用20 mL甲醇將其溶解, 1 mol/L NaOH調(diào)pH到7.0，即得粗提液,用濾紙片法檢測其抑菌效果。2發(fā)酵納豆中提取抗菌物質(zhì) 稱取新鮮納豆60 g, 加適量蒸餾水充分研磨, 紗布過濾。殘?jiān)屑铀俳醿纱? 濾液合并后濃縮至60 mL。該液于121高壓滅菌18分鐘, 放入4冰箱保存?zhèn)溆?。用濾紙片法檢測其抗菌效果。3指示菌懸液的制備 從斜面上分別挑取少量菌接種于液體培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)1824 h。酵母菌懸液和霉菌孢子懸液均以

25、生理鹽水配制。7.3.2 抗菌實(shí)驗(yàn) 納豆菌的抗菌試驗(yàn)取106107 CFU/mL 的指示菌0.1 mL涂平板。分別將樣品點(diǎn)樣于濾紙片上（直徑5.5 mm的雙層濾紙，點(diǎn)樣10 µL），待晾干后放于已涂布指示圈的平板上，細(xì)菌37培養(yǎng)24 h、酵母菌30培養(yǎng)48 h、霉菌28培養(yǎng)48 h后測抑菌圈直徑。表7-1 納豆菌的抗菌作用微生物納豆菌發(fā)酵提取液抑菌圈直徑 (mm)納豆提取液抑菌圈直徑 (mm)志賀氏菌26.023.5大腸桿菌11.013.5沙門氏菌9.07.5普通變形桿菌7.08.0金黃色葡萄球菌20.018.5金黃色微球菌13.011.5巨大芽胞桿菌8.57.0李氏特

26、菌9.58.0枯草芽胞桿菌-蠟狀芽胞桿菌-異常漢遜酵母20.021.0啤酒酵母15.512.5產(chǎn)朊假絲酵母16.517.5拮青霉9.510.5尖鐮孢9.08.5擴(kuò)展青霉9.59.0鐮刀霉8.58.0黑根霉8.04.0黃曲霉7.02.0表7-1為抑菌試驗(yàn)結(jié)果，可以看出，納豆菌具有廣譜的抗菌作用，發(fā)酵生產(chǎn)納豆菌提取液和納豆提取液均對(duì)格蘭氏陽性菌、格蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌均有一定的拮抗作用，特別是對(duì)志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和異常漢遜酵母具有較強(qiáng)的抑菌作用。納豆菌提取液的抑菌較納豆提取液的抑菌作用強(qiáng)，這說明其含有較多質(zhì)量的抑菌成分。圖7-4為納豆菌抑制大腸桿菌的抑菌效果圖，從圖中能明顯看到光亮的抑菌

27、圈。圖7-4 納豆菌的抑菌(大腸桿菌)效果圖 納豆菌抗菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性將納豆菌抗菌粗提液分別調(diào)pH值至pH3pH11，然后分裝樣品分別進(jìn)行如下處理:4，24 h；37，60 min；65，30 min；80，20 min；l00，15 min。處理后冷卻樣品，將pH值調(diào)至pH7，進(jìn)行抗菌物活性測定，結(jié)果如圖7-5。可以看出，納豆菌抗菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，當(dāng)溫度不超過80時(shí)，在pH值在3pH11范圍內(nèi)均比較穩(wěn)定；100處理時(shí)，在pH值為59的范圍內(nèi)穩(wěn)定。 酶對(duì)納豆菌抗菌物質(zhì)的影響將表7-2中的各種酶制劑分別與納豆菌提取液混合在一起(酶的終濃度為0.5

28、 mg/mL)，37處理l h后，100煮沸5 min 使酶失活，冷卻后分別測定抗菌活性，結(jié)果見表7-2。由表7-2所示，除中性蛋白酶外，蛋白酶處理lh后，抗菌活性下降明顯，特別是對(duì)蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶敏感，淀粉酶對(duì)抗菌活性無影響。圖7-5 納豆菌抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性表7-2酶對(duì)納豆菌抗菌活性的影響試驗(yàn)酶的種類抑菌圈直徑（）胃蛋白酶12.0胰蛋白酶10.5胰凝乳蛋白酶9.0蛋白酶K8.5木瓜蛋白酶12.5中性蛋白酶17.0淀粉酶18.5對(duì)照19.07.3.3 納豆菌生產(chǎn)2，6-吡啶二羧酸(dipicolinic acid:DAP) 納豆菌能產(chǎn)生具有生理活性物質(zhì)DAP ，它能有效殺滅、抑

29、制腸道內(nèi)的有害菌和病毒，使腸內(nèi)菌群達(dá)到一個(gè)有利健康的動(dòng)態(tài)平衡，增強(qiáng)人體消化機(jī)能。不同的納豆菌種生成DAP的量不同。圖7-6為以大豆粉為培養(yǎng)基兩種納豆菌生成DAP的情況。 兩種納豆菌Bacillus subtilis var. natto為高橋菌和宮城菌。將大豆粉配制成0.5%和2%濃度的液態(tài)培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)液以3%的接種量接種于液態(tài)培養(yǎng)基中，37，搖床轉(zhuǎn)速100 r/min震蕩培養(yǎng)或靜止培養(yǎng)，96 h。采用熒光測定法進(jìn)行DAP含量分析，其原理是利用DAP 與Tb(terbium)離子形成螯合物，這種螯合物形成的熒光作為指標(biāo)來測定DAP的含量。圖7-7 納豆菌生產(chǎn)DAP的芽孢率 圖7-6表示兩種

30、菌發(fā)酵生成DAP的結(jié)果。高橋菌在0.5%大豆粉培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)中生成2.1g/ml的DAP，在靜置培養(yǎng)時(shí)生成了1.47g/ml的DAP。同樣的高橋菌接種于2%大豆粉培養(yǎng)液，無論靜置還是震蕩培養(yǎng)，只生成少量的DAP。宮城菌接種于0.5%大豆煮汁粉培地，震蕩培養(yǎng)生成了1.85g/ml的DAP。與高橋菌相似，宮城菌接種于2%大豆粉培養(yǎng)液，靜置、振蕩兩種方式培養(yǎng)，只生成少量的DAP。這一結(jié)果說明DAP的產(chǎn)率與菌種和培養(yǎng)基的濃度以及培養(yǎng)方式有關(guān)。在貧營養(yǎng)及震蕩狀態(tài)，芽孢繁殖加速，生產(chǎn)出多量的DAP。這可以由圖7-7來解釋。該圖表示培養(yǎng)后的芽孢對(duì)全細(xì)胞的比例（芽孢率），兩種菌接種于0.5%大豆粉培養(yǎng)液，都有

31、很高的芽孢率。但是接種于2%大豆粉培養(yǎng)液時(shí)，芽孢率低，相反高營養(yǎng)物濃度會(huì)抑制菌體增殖。可以說，在DAP生產(chǎn)中較貧營養(yǎng)的培養(yǎng)液，有較高的芽孢率，能生產(chǎn)出較多的DAP。7.4 納豆菌抗菌作用的研發(fā)現(xiàn)狀7.4.1 國外的研究現(xiàn)狀納豆的抗菌作用早已為人們了解，第二次世界大戰(zhàn)期間，人們用納豆來預(yù)防和治療霍亂、傷寒和痢疾。Ozawa K. 等人研究證實(shí)了納豆菌對(duì)白假絲酵母具有抑制作用。Osawa R. 等研究發(fā)現(xiàn)納豆菌產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶可降解金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)。而且，該酶對(duì)其它的金黃色葡萄球菌腸毒素亦有作用。1996 年日本發(fā)生的O- 157 大腸桿菌中毒事件中，人們發(fā)現(xiàn)納豆菌分泌的一些代

32、謝產(chǎn)物能對(duì)一些重要腸道致病菌起殺滅或抑制作用。將納豆加進(jìn)O- 157 大腸桿菌4 d 后，大腸桿菌全部被抑制而死亡。Ozawa K研究認(rèn)為，納豆菌的芽孢對(duì)病原性大腸桿菌(如O- 111，O- 144) 及沙門氏菌具有抗菌作用，還能殺死腸道出血性大腸桿菌O- 157。Fujida S.等采用納豆菌防治仔豬腹瀉取得了良好效果。7.4.2 國內(nèi)研究現(xiàn)狀國內(nèi)對(duì)納豆菌的抗菌作用的研究的報(bào)道較少。江西中德聯(lián)合研究院的鐘青萍等人研究了納豆菌對(duì)常見的污染食品微生物的拮抗作用，結(jié)果表明納豆菌具有廣譜抗菌作用，對(duì)各種細(xì)菌包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌都有拮抗作用。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)的黃占旺等人研究了不同溫

33、度、pH值、培養(yǎng)時(shí)間、接種量、鹽濃度因素對(duì)納豆菌生長的影響,試驗(yàn)結(jié)果表明,納豆菌生長適宜條件為：溫度3045，pH值7.0，培養(yǎng)時(shí)間24 h;接種量2%5%。納豆菌耐鹽性較強(qiáng)，在含鹽量8%的條件下仍能較好生長。天津科技大學(xué)的陳野等人將納豆菌接種于大豆的豆渣，在豆渣的發(fā)酵過程中添加一定的碳源，使其完全發(fā)酵，可以獲得具有抑菌性的產(chǎn)物。通過抑菌實(shí)驗(yàn)可知，豆渣發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的抑菌效果。鐘青萍等還研究了納豆菌抗菌蛋白的抗菌作用方式以及穩(wěn)定性，并將其運(yùn)用于食品防腐中。結(jié)果表明：納豆菌抗菌蛋白對(duì)敏感菌起到了殺菌作用。掃描電鏡觀察表明，抗菌蛋白可以改變細(xì)胞形態(tài)，使細(xì)胞表面粗糙，有凹陷、顆粒和發(fā)皰，形狀不規(guī)則

34、。電鏡觀察進(jìn)一步顯示，抗菌蛋白引起細(xì)胞損傷，并進(jìn)而使整個(gè)細(xì)胞受到破壞，起到殺菌作用。納豆菌抗菌蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。17的NaC1可促進(jìn)抗菌蛋白的抗菌作用，而二價(jià)金屬離子(Ca+2、Zn+2、Mg+2) 和三價(jià)金屬離子(Fe+3) 有一定的抑制作用。EDTA可促進(jìn)抗菌蛋白的抗菌作用， 山梨酸鉀和SE一15亦有增效作用，而卵磷脂和CMC可降低抗菌蛋白的抗菌活性。鐘青萍等研究了納豆菌抗菌蛋自在鮮牛奶和新鮮瘦豬肉中的防腐效果。研究表明，納豆菌抗菌蛋自在消毒牛奶的保藏中具有顯著的防腐效果，樣品4 保存2個(gè)月后，細(xì)菌總數(shù)仍低于100 CFU/mL；而對(duì)照樣品14天時(shí)微生物總數(shù)超標(biāo)；37 貯

35、存時(shí)亦有較好的防腐效果。在新鮮豬肉的保存中，0.06抗菌蛋白粗品的防腐效果與0.02 尼薩普林的相近。抗菌蛋白與乳酸鈉、山梨酸鉀和甘氨酸有一定的協(xié)同作用?？梢姡{豆菌抗菌蛋白適于在食品中應(yīng)用，且其可與NaC1、EDTA 和食品防腐劑如山梨酸鉀等復(fù)配，提高抗菌效果。目前只報(bào)道過對(duì)納豆菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)還沒有人將其分離純化出來，需要進(jìn)一步探討、研究。現(xiàn)在對(duì)納豆菌抗菌作用的研究主要集中在培養(yǎng)基的選擇、液體發(fā)酵條件及對(duì)致病微生物的抑制作用效果等，但沒有具體細(xì)化到是什么產(chǎn)物具有抑菌功能。由于納豆菌能夠分泌的多種抗菌物質(zhì)，它們的作用模式是協(xié)同還是其它或單獨(dú)成分，其機(jī)理的研

36、究還有待進(jìn)一步深入。7.4.3 納豆菌研發(fā)過程中存在的問題目前，國內(nèi)關(guān)于納豆菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的作用機(jī)理、抗菌譜和應(yīng)用的范圍等的研究并不多，也未分離出純品進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)。這是進(jìn)一步急需探討的問題。另外，納豆菌發(fā)酵液中存在著一種特殊的味道，不易被大家所接受，如何去除這種異味而又不影響它的抗菌活性，也是需要解決問題。7.4.4 納豆菌生產(chǎn)抑菌物質(zhì)的前景不少微生物在其代謝過程中都能產(chǎn)生抑菌物質(zhì),但作為食品防腐劑必須符合：生物殺菌素本身對(duì)人體完全無害；在消化道內(nèi)降解為食物的正常成分；對(duì)食品進(jìn)行熱處理降解為無害成分；不影響消化道菌群；不影響藥用抗菌素的使用等要求。納豆在日本已經(jīng)被食用了2000多年,其特性

37、適合于作為天然防腐劑在食品中應(yīng)用。納豆菌抗菌物質(zhì)抗菌譜較廣,具有較強(qiáng)的抗菌作用和良好的穩(wěn)定性,將其應(yīng)用于牛奶和豬肉的防腐試驗(yàn)證明,納豆菌作為食品防腐劑具有良好的防腐效果,0.06%抗菌蛋白的防腐效果與0.02%Nisin的效果相近,與乳酸鈉等化學(xué)防腐劑配合使用效果更好。目前在食品中應(yīng)用較多的生物防腐劑尼辛、溶菌霉和納他霉素等,這其中有些產(chǎn)品國內(nèi)還沒有工業(yè)化生產(chǎn),這給食品工業(yè)生產(chǎn)中的批量應(yīng)用帶來一定的不便,如果從國外進(jìn)口,價(jià)格昂貴。以天然農(nóng)產(chǎn)品為原料,用發(fā)酵等生物技術(shù)而制備,具有高效、無毒、適用性廣、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),成為食品防腐劑研究、應(yīng)用、發(fā)展的一個(gè)重要方面。納豆菌抗菌物質(zhì)的發(fā)酵周期短,投資小

38、,成本低,對(duì)環(huán)境無污染,可同時(shí)生產(chǎn)其他一些有用的副產(chǎn)物,因此,納豆菌發(fā)酵作為新型高效的天然食品防腐劑的開發(fā)具有廣闊的開發(fā)潛力和市場前景。微生物防腐劑抑菌物質(zhì)的鑒定,抗菌譜的確立,食品毒理學(xué)分析等將成為研究的重點(diǎn)。另外,通過生物工程技術(shù)對(duì)抑菌物質(zhì)的遺傳調(diào)控進(jìn)行研究,具有一定的理論意義及廣泛的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1.http:www/2.高金燕. 豆渣的營養(yǎng)與藥用價(jià)值J. 營養(yǎng)保健, 2003, 23 (11) : 49- 50.3. 須見洋行. 納豆的機(jī)能性J. 日本釀造協(xié)會(huì)志, 1990, 85 (8) : 518- 524.4. 須見洋行, 大杉忠則. 納豆及納豆菌中的抗菌成分J. 日本農(nóng)藝化學(xué)志, 1999, 73 (6) : 1289- 1291.5. 郭軍, 孫玉萍, 蘇玉枝. 納豆的制作及保健功能J. 中藥材,