酶分子的化學(xué)修飾

1、一、概述一、概述二、原理、方法及修飾劑二、原理、方法及修飾劑三、研究進(jìn)展三、研究進(jìn)展四、應(yīng)用四、應(yīng)用一、概述1 1、酶化學(xué)修飾（、酶化學(xué)修飾（ chemical modification chemical modification ）：）： 通過通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價(jià)化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，是在酶分子一級結(jié)構(gòu)水平上結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，是在酶分子一級結(jié)構(gòu)水平上的的改造。改造。 酶選擇性酶選擇性化學(xué)修飾：化學(xué)修飾： 描述肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專一性地修飾。描述肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專一性地修飾。一、概述2 2、酶分子化學(xué)修飾的目的、酶分子化學(xué)修飾的目的 1 1）提

2、高酶的生物活性（酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。 2 2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。衰期）。 3 3）降低或消除抗原性（針對特異性反應(yīng)）降低或消除抗原性（針對特異性反應(yīng)降低生物識別能力）。降低生物識別能力）。 4 4）產(chǎn)生新的催化能力。）產(chǎn)生新的催化能力。二、原理、修飾劑及反應(yīng)1 1、化學(xué)修飾原理、化學(xué)修飾原理1 1）增強(qiáng)）增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。2 2）保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑）保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑部部 大分子修飾劑與酶

3、結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。3 3）維持）維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶 酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：a. 大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。b. 酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。4 4）消除）消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境a. 酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。 破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除 “遮蓋”了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合b. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分

4、子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對穩(wěn)定。2. 2. 修飾劑及修飾反應(yīng)修飾劑及修飾反應(yīng)修飾劑：聚修飾劑：聚乙二醇（乙二醇（PEGPEG）、右旋糖酐（）、右旋糖酐（dextrandextran）、肝）、肝素（素（heparinheparin）、蔗糖聚合物（）、蔗糖聚合物（FicollFicoll）等。）等。 幾種幾種重要的修飾反應(yīng)：重要的修飾反應(yīng)：烷基化反應(yīng)酰化反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)烷基化反應(yīng)?；磻?yīng) 連四硫酸鹽氧化巰基，連四硫酸鹽氧化巰基，DTTDTT還原逆回，用于保護(hù)巰基。還原逆回，用于保護(hù)巰基。氧化還原反應(yīng) 試劑試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。：鹵

5、（碘）化，硝化試劑。 碘代：碘代： I2 + HI 硝化：硝化：(NO2)4C + +(NO2)3CH （四硝基甲烷）（四硝基甲烷）芳香環(huán)取代反應(yīng)三、研究進(jìn)展三、研究進(jìn)展1 1、交聯(lián)技術(shù)交聯(lián)技術(shù) 酶的人工交聯(lián)可在一條多肽鏈內(nèi)形成，是一種作用于分子間或分子內(nèi)部的交聯(lián)方式，能提高酶的穩(wěn)定性，防止酶在不良環(huán)境中失活。Fernandez 等提出了一種新穎的分子內(nèi)交聯(lián)方式。實(shí)驗(yàn)表明這種方式在酶主要的氨基基團(tuán)上，戊二醛（GLU）對其進(jìn)行了交聯(lián)修飾（修飾度45% 55%），然后把修飾酶在pH 9 和20C 的條件下老化30 min。在這段時(shí)間內(nèi)酶的活性雖然有所損失，但是穩(wěn)定性提高了3 倍。2 2、定點(diǎn)突變和

6、化學(xué)修飾結(jié)合技術(shù)、定點(diǎn)突變和化學(xué)修飾結(jié)合技術(shù) 利用定點(diǎn)突變法來改變酶的底物專一性，開發(fā)出了新型的酶制劑。將定點(diǎn)突變所得酶進(jìn)行化學(xué)修飾，得到一些新穎的酶制劑。利用定點(diǎn)突變技術(shù)在酶的關(guān)鍵活性位點(diǎn)引入一個(gè)氨基酸殘基，然后利用化學(xué)修飾法對突變的氨基酸殘基進(jìn)行修飾，引入一個(gè)小分子化合物，得到一種化學(xué)修飾突變酶?？莶輻U菌蛋白酶化學(xué)修飾突變過程3 3、小、小分子分子修飾修飾 蛋白質(zhì)表面的一半基團(tuán)由非極性氨基酸利用小分子化合物對酶的活性部位或活性部位之外的側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，對酶的表面進(jìn)行改造改善酶的分散性；提高酶的表面活性；使酶的表面產(chǎn)生新的物理、化學(xué)、機(jī)械性能及新功能；改善酶與其它物質(zhì)的相容性。4 4、

7、單、單功能聚合物功能聚合物化學(xué)修飾化學(xué)修飾最近研究發(fā)現(xiàn)，一種比PEG 更好的修飾劑非離子型兩性聚氧乙烯十二烷基醚（Brij35）5 5、輔因子引入、輔因子引入 Sinha等采用固相合成技術(shù)對核糖核酸酶S 的C-肽的殘基Phe8，用一種人工合成的氨基酸進(jìn)行取代，其中吡哆胺磷酸作為輔因子。這種輔因子導(dǎo)入的方法比通常的修飾反應(yīng)速度提高了70%。酶化學(xué)修飾的應(yīng)用酶化學(xué)修飾的應(yīng)用 脂肪酶的化學(xué)修飾脂肪酶的化學(xué)修飾 脂肪酶脂肪酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，為了提高脂廣泛存在于動物、植物和微生物中，為了提高脂肪酶在有機(jī)相中的催化活性、穩(wěn)定性、溶解性及反應(yīng)肪酶在有機(jī)相中的催化活性、穩(wěn)定性、溶解性及反應(yīng)選擇

8、性等，人們采用多種方法對脂肪酶的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)選擇性等，人們采用多種方法對脂肪酶的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造，其中化學(xué)修飾是提高和改善酶催化性能的行了改造，其中化學(xué)修飾是提高和改善酶催化性能的有效方法之一。有效方法之一。 酶酶修飾的機(jī)制：修飾的機(jī)制：脂肪酶分子中的賴氨酸殘基末端的脂肪酶分子中的賴氨酸殘基末端的- -NH2NH2，由于具有較強(qiáng)的親核性，使得，由于具有較強(qiáng)的親核性，使得-NH2-NH2成為化學(xué)修成為化學(xué)修飾的首選官能團(tuán)飾的首選官能團(tuán). . 鄰苯二甲酸酐鄰苯二甲酸酐(PA)(PA)作為作為LysLys的專一性的專一性修飾劑修飾劑, ,對脂肪酶側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾對脂肪酶側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾, ,可引起副

9、鍵的改可引起副鍵的改變，使酶分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而引起酶的變，使酶分子空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而引起酶的特性和功能的改變。特性和功能的改變。屬于化學(xué)修飾方法中的酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的修飾屬于化學(xué)修飾方法中的酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的修飾實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：脂肪酶脂肪酶PPLPPL的的PAPA修飾修飾PA.PPLPA.PPL修飾度修飾度的測定的測定脂肪酶水解活性的測定脂肪酶水解活性的測定酶的酶的pHpH穩(wěn)定穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性測定性和熱穩(wěn)定性測定細(xì)節(jié)注意：細(xì)節(jié)注意：1.1.修飾度測定采用三硝基苯磺酸分光修飾度測定采用三硝基苯磺酸分光光度法測定（確定酶已修飾）光度法測定（確定酶已修飾） 2.2.酶活采用橄欖油

10、乳化液法測酶活采用橄欖油乳化液法測定在定在4040、pH 7.0pH 7.0的條件下，將每分鐘從橄的條件下，將每分鐘從橄欖油中釋放欖油中釋放1 umol1 umol脂肪酸的酶量定義為脂肪酸的酶量定義為一個(gè)酶一個(gè)酶活性單位活性單位(U(U）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：反應(yīng)反應(yīng)pHpH對對PA-PPLPA-PPL活性的影響活性的影響 修飾酶修飾酶PA-PPLPA-PPL的水解活性明顯高于原酶的水解活性明顯高于原酶PPLPPL，且且PPLPPL在修飾前后，最適在修飾前后，最適pHpH范圍未發(fā)生明顯變范圍未發(fā)生明顯變化，均為化，均為7.0-8.07.0-8.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：反應(yīng)溫度

11、對反應(yīng)溫度對PA-PPLPA-PPL活性的影響活性的影響 在在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，修飾酶試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，修飾酶PA-PPLPA-PPL的水解活性明顯高的水解活性明顯高于原酶于原酶PPLPPL，但二者的最適反應(yīng)溫度相同，都為，但二者的最適反應(yīng)溫度相同，都為40 40 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：PA-PPLPA-PPL的的pHpH穩(wěn)定性穩(wěn)定性 在在pH 5pH 50 0或或6 60 0的條件下放置的條件下放置1 h1 h，原酶，原酶PPLPPL基本上失基本上失去了活性，而修飾酶去了活性，而修飾酶PA-PPL|PA-PPL|失去了大部分活性，緩沖失去了大部分活性，緩沖液液pHpH為為7.07.0和和8

12、.08.0時(shí)，時(shí)，PPL PPL 和和PA-PPLPA-PPL的活性隨時(shí)間變化的活性隨時(shí)間變化非常小，這說明它們的最佳存放非常小，這說明它們的最佳存放pHpH是是7.0-8.07.0-8.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：PA-PPLPA-PPL的熱穩(wěn)定性的熱穩(wěn)定性 原原酶酶PPLPPL和修飾酶和修飾酶PA-PPLPA-PPL在在20 20 下存放時(shí)，酶活性的變化很小，下存放時(shí)，酶活性的變化很小，而在而在30 30 下存放時(shí)酶活性明顯降低，在下存放時(shí)酶活性明顯降低，在4040和和5050下存放時(shí)，下存放時(shí)，酶活性迅速降低酶活性迅速降低40 40 時(shí)時(shí)PA-PPLPA-PPL的半哀期為的半哀期為9

13、5min95min，較，較PPLPPL的半的半衰期延長了衰期延長了20min20min；50 PA-PPL50 PA-PPL的半衰期為的半衰期為48 min48 min，較，較PPLPPL的半的半衰期延長了衰期延長了1 1倍可見原酶倍可見原酶PPLPPL經(jīng)經(jīng)PAPA修飾后熱穩(wěn)定性也明顯提高修飾后熱穩(wěn)定性也明顯提高結(jié)論結(jié)論 脂肪酶脂肪酶經(jīng)經(jīng)PAPA修飾前后，酶催化水解的最適反應(yīng)修飾前后，酶催化水解的最適反應(yīng)pHpH和最適反應(yīng)溫度均未發(fā)生改變，說明小分子和最適反應(yīng)溫度均未發(fā)生改變，說明小分子化學(xué)修飾反應(yīng)溫和，對酶分子活性區(qū)域的構(gòu)象化學(xué)修飾反應(yīng)溫和，對酶分子活性區(qū)域的構(gòu)象影響不嚴(yán)重。影響不嚴(yán)重。 采

14、用采用PAPA修飾脂肪酶修飾脂肪酶PPLPPL能有效提高酶的水解活能有效提高酶的水解活性、酸堿穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性。性、酸堿穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性。附：參考文獻(xiàn)附：參考文獻(xiàn)王穎達(dá)，郭麗，錢世鈞等；多聚唾液酸對王穎達(dá)，郭麗，錢世鈞等；多聚唾液酸對L-L-天冬酰胺酶的修飾及修飾酶特性天冬酰胺酶的修飾及修飾酶特性研究研究J J ；生物工程學(xué)報(bào)；生物工程學(xué)報(bào)；2000-07,16(4)2000-07,16(4)：517-520.517-520.武忠亮武忠亮, , 郭亞利郭亞利, ,唐云明唐云明; ; 煙草葉片蔗糖酶的化學(xué)修飾煙草葉片蔗糖酶的化學(xué)修飾J;J;西南師范大學(xué)學(xué)西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)報(bào)( (自然科學(xué)版自然科學(xué)

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