實(shí)驗(yàn)四 DNA濃度測(cè)定及酶切

1、實(shí)驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)三、DNA濃度測(cè)定及酶切濃度測(cè)定及酶切1、學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法測(cè)定DNA溶液濃度和純度的原理和方法2、學(xué)習(xí)利用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定DNA濃度的方法3、學(xué)習(xí)利用限制性?xún)?nèi)切酶切割DNA的方法，并通過(guò)電泳檢測(cè)酶切的效果，為以后的連接作準(zhǔn)備。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康膌 DNA的吸收光譜峰在260 nm處，測(cè)定此波長(zhǎng)下DNA溶液的OD值，當(dāng)OD260=1時(shí)，雙鏈DNA含量約為50 g/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液中DNA含量。由于蛋白質(zhì)的吸收峰在280 nm處，在測(cè)定DNA含量時(shí)，還常計(jì)算OD260/OD280之值，如該值為1.8-2.0時(shí)，認(rèn)為已達(dá)到較高的純度，如低于此值，表明其內(nèi)

2、含雜質(zhì)較多，可能影響酶切反應(yīng)。l 目前已發(fā)現(xiàn)I型、II型和III三類(lèi)不同的限制性?xún)?nèi)切酶，其中II型能專(zhuān)一識(shí)別堿基順序，并在該處切斷雙鏈DNA，因而在基因工程中得到廣泛應(yīng)用。DNA經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶作用產(chǎn)生兩種斷裂狀態(tài)：粘性末端或平末端。限制性?xún)?nèi)切酶Hind III識(shí)別的堿基序列為：l 酶切反應(yīng)需Mg2+及其它一些輔助離子和一定的鹽離子濃度，不同內(nèi)切酶對(duì)鹽離子有不同的要求，如鹽離子濃度使用不當(dāng)或甘油含量過(guò)高(5%)，會(huì)使酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，產(chǎn)生星活性(star activity)。絕大多數(shù)酶的反應(yīng)溫度37，也有個(gè)別要求在50 65。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理不同核酸樣品在不同核酸樣品在OD260=1

3、時(shí)的濃度時(shí)的濃度1、OD260：估算核算濃度：估算核算濃度2、 OD280：估算核算濃度：估算核算濃度3、 OD260：估算核算濃度：估算核算濃度4、 OD260：估算核算濃度：估算核算濃度OD（optical density，光密度）：表示被測(cè)物吸掉的光密度。不同核酸樣品在不同核酸樣品在OD260=1時(shí)的濃度時(shí)的濃度1、ds DNA = 50 g/ml (ng/ l )2、 ss DNA = 37 g/ml3、 RNA = 40 g/ml4、 oligo = 30 g/mlOD（optical density，光密度）：表示被測(cè)物吸掉的光密度。三、實(shí)驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)材料材料（上次實(shí)驗(yàn)提取的質(zhì)粒上次

4、實(shí)驗(yàn)提取的質(zhì)粒 pSK和和MP3MP3）四、儀器設(shè)備四、儀器設(shè)備五、實(shí)驗(yàn)用具五、實(shí)驗(yàn)用具Eppendorf分光光度檢測(cè)儀NanoDrop分光光度檢測(cè)儀電泳儀 微型電泳槽 BioRad凝膠成像儀 紫外透射檢測(cè)儀 恒溫培養(yǎng)箱 冰盒 微量離心管 移液移液器器微量離心管（1.5 ml1） 吸管頭若干 點(diǎn)樣板NanoDrop分光光度檢測(cè)儀分光光度檢測(cè)儀NanoDrop測(cè)定結(jié)果測(cè)定結(jié)果DNA樣品樣品純度好純度好DNA樣品樣品純度差純度差DNA樣品樣品純度差純度差比色皿比色皿Eppendorf分光光度檢測(cè)儀分光光度檢測(cè)儀六、試劑六、試劑瓊脂糖5TBE電泳緩沖液 10 載樣緩沖液 （loading buffe

5、r） GoldView I型核酸染色劑 （10000 ） DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA marker）：Marker III已知系列濃度的DNA（線(xiàn)性DNA分子，長(zhǎng)約50 kb） (10、20、50、100 ng/ l )七、實(shí)驗(yàn)步驟七、實(shí)驗(yàn)步驟（一（一）分光光度計(jì)法測(cè)定）分光光度計(jì)法測(cè)定DNA的濃度和純度的濃度和純度（二（二）瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA濃度（濃度（1 % agarose gel）（三（三）質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量酶切的小量酶切（四）酶切質(zhì)粒（四）酶切質(zhì)粒DNA的電泳（的電泳（1.5% agarose gel）（五）（五）MP3質(zhì)粒的大量酶切質(zhì)粒的大量酶切1、Epp

6、endorf分光光度檢測(cè)儀：取質(zhì)粒DNA 2 l （約100-200 ng）至一干凈的離心管，加入198 l蒸餾水稀釋?zhuān)浞只靹?。先?00 l 蒸餾水至比色杯，進(jìn)行紫外光空白測(cè)定，然后倒掉蒸餾水，加入200 l已稀釋的DNA溶液，測(cè)定260 nm及280 nm的光吸收值（OD260及OD280），計(jì)算DNA濃度、OD260/OD280（估計(jì)核酸純度）及OD260/OD230 （估計(jì)去鹽程度）比值。（自配溶液提取的質(zhì)粒（自配溶液提取的質(zhì)粒DNA）2、 NanoDrop分光光度檢測(cè)儀：先加1 l 蒸餾水進(jìn)行紫外光空白測(cè)定，然后用濾紙吸掉蒸餾水，加入1 l Elute溶液，測(cè)定上述數(shù)值。（制劑盒提

7、取的質(zhì)粒（制劑盒提取的質(zhì)粒DNA）（一（一）分光光度計(jì)法測(cè)定分光光度計(jì)法測(cè)定DNA的濃度和純度的濃度和純度 1、利用ddH2O將質(zhì)粒DNA稀釋到濃度為10-100 ng/ l之間，然后分別取稀釋的DNA樣品和已知濃度的DNA各1 l于點(diǎn)樣板小孔中，再加入8 l TE和1 l的載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔，藍(lán)色樣品混合物將沉入點(diǎn)樣孔下部。同時(shí)點(diǎn)5 l Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。2、打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5 V/cm，可見(jiàn)到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，約半個(gè)小時(shí)后即可觀察。3、將電泳好的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，戴上防護(hù)觀察罩，打開(kāi)紫外燈，可見(jiàn)到綠色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細(xì)和熒光強(qiáng)度，

8、對(duì)比已知濃度的DNA條帶的粗細(xì)和熒光強(qiáng)度，可粗略估計(jì)該樣品DNA的濃度。同時(shí)根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA，通過(guò)線(xiàn)性DNA條帶的相對(duì)位置初步估計(jì)樣品的分子量。（二）（二）瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA濃度（濃度（1 % agarose gel） （三）（三）質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量酶切的小量酶切20 l反應(yīng)體系（反應(yīng)體系（1.5 ml離心管）：離心管）： 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA（pSK、MP3） 35 l（0.5-1 g） 酶切酶切Buffer 2.0 l Hind III酶酶 1.0 l 滅菌滅菌ddH2O to 20 l加樣順序：加樣順序：水、水、buffer、DNA、酶、酶 37恒溫箱恒

9、溫箱中放置數(shù)小時(shí)或者酶切過(guò)夜中放置數(shù)小時(shí)或者酶切過(guò)夜 1、配制、配制1.5%的瓊脂糖凝膠的瓊脂糖凝膠2、酶切的、酶切的DNA中加入中加入2 l的的10loading buffer，混勻后取，混勻后取20 l上樣，同時(shí)點(diǎn)未酶切質(zhì)粒上樣，同時(shí)點(diǎn)未酶切質(zhì)粒DNA（50-100 ng）進(jìn)行遷移率對(duì)）進(jìn)行遷移率對(duì)比，取比，取5 l Marker點(diǎn)樣點(diǎn)樣作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。3、電泳結(jié)束后分析酶切后質(zhì)粒條帶的變化、遷移率和不同條、電泳結(jié)束后分析酶切后質(zhì)粒條帶的變化、遷移率和不同條帶之間的亮度差異；帶之間的亮度差異；同時(shí)根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA，通，通過(guò)線(xiàn)性過(guò)線(xiàn)性DNA條

10、帶的相對(duì)位置初步估計(jì)樣品的分子量。條帶的相對(duì)位置初步估計(jì)樣品的分子量。（三）酶切質(zhì)粒（三）酶切質(zhì)粒DNA的電泳的電泳（四）（四） MP3質(zhì)粒的大量酶切質(zhì)粒的大量酶切100 l反應(yīng)體系（反應(yīng)體系（1.5 ml離心管）：離心管）： MP3質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 2-4 g（試劑盒抽提）（試劑盒抽提） 酶切酶切Buffer 10 l Hind III酶酶 2-4 l 滅菌滅菌ddH2O up to 100 l加樣順序：加樣順序：水、水、buffer、DNA、酶、酶 37恒溫箱恒溫箱酶切過(guò)夜酶切過(guò)夜 MP3和和pSK（+）質(zhì)粒）質(zhì)粒DNA的的Hind III酶切結(jié)果酶切結(jié)果MP3和和pSK（+）質(zhì)粒）質(zhì)粒DN

11、A的的Hind III酶切結(jié)果酶切結(jié)果2， 完成檢測(cè)后合上滑蓋，關(guān)閉電源。完成檢測(cè)后合上滑蓋，關(guān)閉電源。 分光光度計(jì)法測(cè)定大腸桿菌液體培養(yǎng)物的分光光度計(jì)法測(cè)定大腸桿菌液體培養(yǎng)物的OD600值值細(xì)菌細(xì)菌OD的測(cè)定原理是細(xì)菌顆粒的遮光，可以用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，而通過(guò)數(shù)量能反映的測(cè)定原理是細(xì)菌顆粒的遮光，可以用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量，而通過(guò)數(shù)量能反映出細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)。菌液濃度太高，用培養(yǎng)基稀釋可以降低出細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)。菌液濃度太高，用培養(yǎng)基稀釋可以降低OD值，但是太高濃度值，但是太高濃度OD值的菌液可能細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)不符合要求，比如死的菌體會(huì)比較多等。值的菌液可能細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)不符合要求，比如死的菌體會(huì)比較多

12、等。1、在使用分光光度計(jì)時(shí)，測(cè)得的、在使用分光光度計(jì)時(shí)，測(cè)得的OD值在值在0 .1-0.4這個(gè)區(qū)間內(nèi)最可靠，最好不要超過(guò)這個(gè)區(qū)間內(nèi)最可靠，最好不要超過(guò)1.0。因此。因此OD盡量控制在盡量控制在0.1-1之間，最多不要超過(guò)之間，最多不要超過(guò)2.0。取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，。取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)重復(fù)3次的數(shù)最好。次的數(shù)最好。2、空白用不接種的培養(yǎng)基，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng)，以求條件一、空白用不接種的培養(yǎng)基，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng)，以求條件一致。致。3、OD與體積或者說(shuō)稀釋倍數(shù)不一定成正比，如果與體積或者說(shuō)稀釋倍數(shù)不一定成正比，如果OD大于大于2.0，一般要稀釋后再測(cè)

13、，一般要稀釋后再測(cè)，而不能根據(jù)之前的檢測(cè)結(jié)果稀釋?zhuān)驗(yàn)槎荒芨鶕?jù)之前的檢測(cè)結(jié)果稀釋?zhuān)驗(yàn)镺D太大了就會(huì)超過(guò)檢測(cè)范圍，靈敏度顯著太大了就會(huì)超過(guò)檢測(cè)范圍，靈敏度顯著降低。降低。4、OD值是透光率，跟體積沒(méi)關(guān)系，只跟菌濃度有關(guān)系，而且只有在一定的吸光值范值是透光率，跟體積沒(méi)關(guān)系，只跟菌濃度有關(guān)系，而且只有在一定的吸光值范圍內(nèi)成線(xiàn)性關(guān)系，一般在圍內(nèi)成線(xiàn)性關(guān)系，一般在0.1-1.0范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。雙酶切時(shí)不要選擇識(shí)別位點(diǎn)有部分重疊雙酶切時(shí)不要選擇識(shí)別位點(diǎn)有部分重疊或者太靠近的酶！或者太靠近的酶！M13F：5- gTAAAACgACggCCAgTg-3M13R：5-ggAAACAgCTATgACCATg-

14、3載體單酶切：載體單酶切：酶切后需要進(jìn)行脫磷，防止載體自連，而且連接后外源片段插入的方向不能固定，只能通過(guò)酶切檢測(cè)或者測(cè)序判斷。載體雙酶切：載體雙酶切：外源片段插入的方向是固定的，由目的片段兩側(cè)的酶切位點(diǎn)（往往通過(guò)PCR引物加入的酶切位點(diǎn)所確定，但要注意選擇的兩種酶在多克隆位點(diǎn)里有一定的距離，最好識(shí)別位點(diǎn)不要相互重疊，否則會(huì)造成酶切困難。載體單酶切和雙酶切的注意事項(xiàng)載體單酶切和雙酶切的注意事項(xiàng)Not I：GCGGCCGC Xba I：TCTAGA Spe I：ACTAGT CGCCGGCG AGATCT TGATCANot I：GCGGCCGC Xba I：TCTAGA Spe I：ACTAG

15、T CGCCGGCG AGATCT TGATCACleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector)Base Pairs from End refers to the number of double-stranded base pairs between the recognition site and the terminus of the fragment; this number does not include the single-stranded overhang from the initial cut.外

16、源片段克隆到載體里的策略和步驟外源片段克隆到載體里的策略和步驟1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的載體；2、分析外源目的片段的酶切位點(diǎn)（找absent site，分析軟件：如DNAstar；網(wǎng)上分析程序： 如http:/www.bio- ），選擇載體多克隆位點(diǎn)有而目的片段沒(méi)有的酶切位點(diǎn)添加在PCR引物5末端；3、PCR引物添加的酶切位點(diǎn)的5端應(yīng)該添加足夠的添加保護(hù)堿基；4、載體酶切后一定要切膠回收；目的片段PCR擴(kuò)增后切膠回收，然后酶切，酶切產(chǎn)物可以切膠回收，也可以直接乙醇沉淀或者利用試劑盒進(jìn)行過(guò)柱純化回收。Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)1、用紫外分光光度法測(cè)DNA含量時(shí)，對(duì)純度不高的DNA測(cè)定結(jié)果往往不準(zhǔn)確（偏高），且測(cè)定所用DNA量較多。用瓊脂糖凝膠法電泳（與已知濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)系列對(duì)照）定量更為可靠。2、酶切的DNA應(yīng)具備一定的純度，其中不能含跡量的酚、氯仿、SDS等。3、反應(yīng)總體積中甘油的濃度要小于5，即內(nèi)切酶的體積應(yīng)小于10%反應(yīng)總體積（購(gòu)來(lái)的酶含50甘油）。4、內(nèi)切酶從-20冰箱取出后，應(yīng)放入冰浴中，在其它試劑加完后最后加。每次取酶必須使用新的