聚合酶鏈反應(yīng)原理

1、職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)專業(yè)教學(xué)資源庫聚合酶鏈反應(yīng)的原理聚合酶鏈反應(yīng)的原理 滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 劉玉枝劉玉枝 聚合酶鏈反應(yīng)這個詞由聚合酶鏈反應(yīng)這個詞由Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction三三個英文單詞翻譯而來，其英文縮寫為個英文單詞翻譯而來，其英文縮寫為PCRPCR。 聚合酶鏈反應(yīng)：是一個在體外特異地復(fù)制一段已知序列聚合酶鏈反應(yīng)：是一個在體外特異地復(fù)制一段已知序列的的DNADNA片段的過程，這個過程很類似于體內(nèi)的復(fù)制過程。片段的過程，這個過程很類似于體內(nèi)的復(fù)制過程。 通過這項技術(shù)人們能很快地在體外獲得大量拷貝的特

2、異通過這項技術(shù)人們能很快地在體外獲得大量拷貝的特異核酸片段。核酸片段。聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理 （一）（一）PCRPCR技術(shù)的原理和反應(yīng)過程技術(shù)的原理和反應(yīng)過程 PCR PCR技術(shù)以待擴(kuò)增的核酸片段為模板，以可與模板末端技術(shù)以待擴(kuò)增的核酸片段為模板，以可與模板末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，利用互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，利用DNADNA聚合酶的作用，按聚合酶的作用，按照半保留復(fù)制的原理及堿基配對原則，使模板鏈延伸達(dá)照半保留復(fù)制的原理及堿基配對原則，使模板鏈延伸達(dá)到合成到合成DNADNA的目的。的目的。聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理PCR反應(yīng)過程主要由變性、退火和延伸三個基本步驟構(gòu)成。反

3、應(yīng)過程主要由變性、退火和延伸三個基本步驟構(gòu)成。聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理變性（變性（denaturation） 退火（退火（annealing） 延伸（延伸（extension） 聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理PCR前前4個循環(huán)：個循環(huán)： 聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理PCR完整循環(huán)：完整循環(huán)： 聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理（二）（二）PCRPCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 通常通常PCRPCR反應(yīng)體系包括：反應(yīng)體系包括：（1 1）MgMg2+2+的反應(yīng)緩沖液。的反應(yīng)緩沖液。（2 2）模板）模板DNADNA。（3 3）dNTPdNTP。（4 4）耐熱）耐熱DNADN

4、A聚合酶。聚合酶。（5 5）寡核苷酸引物五部分。）寡核苷酸引物五部分。Mg2+dCTPdGTPdUTPdATP DNA polymerasePrimer 1Primer 2K+Template聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理（二）（二）PCRPCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理 聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理（二）（二）PCRPCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 PCRPCR反應(yīng)條件：主要溫度、時間及循環(huán)次數(shù)。反應(yīng)條件：主要溫度、時間及循環(huán)次數(shù)。 均是均是PCRPCR基因擴(kuò)增儀的重要設(shè)置參數(shù)。基因擴(kuò)增儀的重要設(shè)置參數(shù)。 94 C 5min9

5、4 C 60s55 C 30s72 C 60s72 C 7min30 cycles聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理二、二、PCRPCR基因擴(kuò)增儀的工作原理基因擴(kuò)增儀的工作原理 從從PCRPCR技術(shù)原理和反應(yīng)過程中可以看出，準(zhǔn)確控制溫度，技術(shù)原理和反應(yīng)過程中可以看出，準(zhǔn)確控制溫度，迅速升降溫對于迅速升降溫對于PCRPCR反應(yīng)來說至關(guān)重要。反應(yīng)來說至關(guān)重要。聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理PCRPCR儀溫度儀溫度控制控制水浴鍋控溫水浴鍋控溫 壓縮機(jī)控溫壓縮機(jī)控溫 半導(dǎo)體控溫半導(dǎo)體控溫 離心式空氣離心式空氣加熱控溫加熱控溫 控溫方式有：控溫方式有：聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理1.1.水浴鍋控溫水

6、浴鍋控溫F以不同溫度的以不同溫度的水浴鍋水浴鍋串聯(lián)成一個控溫體系。串聯(lián)成一個控溫體系。F優(yōu)點：樣品與水直接無縫接觸，控溫準(zhǔn)確，溫度均優(yōu)點：樣品與水直接無縫接觸，控溫準(zhǔn)確，溫度均一性好，無邊緣效應(yīng)。一性好，無邊緣效應(yīng)。F缺點：體積大，自動化程度不高，需人為干預(yù)，更缺點：體積大，自動化程度不高，需人為干預(yù)，更換水浴鍋時控溫不穩(wěn)定。換水浴鍋時控溫不穩(wěn)定。 聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理2.2.壓縮機(jī)控溫壓縮機(jī)控溫F由由壓縮機(jī)壓縮機(jī)自動控溫，金屬導(dǎo)熱。自動控溫，金屬導(dǎo)熱。F優(yōu)點：控溫較水浴鍋方便，一臺機(jī)器便可完成整個優(yōu)點：控溫較水浴鍋方便，一臺機(jī)器便可完成整個PCRPCR流程。流程。F缺點：壓縮機(jī)故

7、障率高，邊緣效應(yīng)及溫度缺點：壓縮機(jī)故障率高，邊緣效應(yīng)及溫度overshootingovershooting現(xiàn)象現(xiàn)象嚴(yán)重。嚴(yán)重。聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理3.3.半導(dǎo)體控溫半導(dǎo)體控溫F由由半導(dǎo)體半導(dǎo)體自動控溫，金屬導(dǎo)熱。自動控溫，金屬導(dǎo)熱。F優(yōu)點：控溫方便，體積小，相對穩(wěn)定性好。優(yōu)點：控溫方便，體積小，相對穩(wěn)定性好。F缺點：仍有邊緣效應(yīng)，溫度均一性尚有欠缺，各孔擴(kuò)增效缺點：仍有邊緣效應(yīng)，溫度均一性尚有欠缺，各孔擴(kuò)增效率可能不一致，并且仍存在溫度率可能不一致，并且仍存在溫度overshootingovershooting現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 聚合酶鏈反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)原理4.4.離心式空氣加熱控溫離心式空氣加熱控溫F由金屬線圈加熱，采用由金屬線圈加熱，采用空氣空氣作為導(dǎo)熱媒介。作為導(dǎo)熱媒介。F優(yōu)點：溫