質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定

1、質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取及濃度檢測的提取及濃度檢測1.目的與要求 通過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測定，學(xué)習(xí)用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，了解用分光光度計測定DNA含量的方法。2. 相關(guān)知識及原理質(zhì)粒質(zhì)粒(Plasmid) (Plasmid) ：獨立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳獨立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子。分子。存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。DNA超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒: 細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的

2、質(zhì)粒類細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從群，其大小從1Kb-200Kb，它們復(fù)，它們復(fù)制時利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身基因組制時利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身基因組DNA的同一組酶系。的同一組酶系。 嚴(yán)謹(jǐn)型：嚴(yán)謹(jǐn)型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，制之下的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝；往往在一個細(xì)胞中只有一份或幾份拷貝； 松馳型：松馳型：這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個細(xì)胞中含有控制之下的，每個細(xì)胞中含有10-200份拷貝，份拷貝，如果用一定的藥物

3、處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會使質(zhì)粒拷貝數(shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒才會使質(zhì)粒拷貝數(shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。質(zhì)粒類型：質(zhì)粒類型：載體載體(Vector)(Vector)：用于攜帶重組用于攜帶重組DNADNA，并且能夠使外源，并且能夠使外源DNADNA一起復(fù)制一起復(fù)制與表達(dá)的質(zhì)粒與表達(dá)的質(zhì)粒( (運載工具運載工具) )。具備的條件：具備的條件： 易于鑒定；易于鑒定； 在受體細(xì)胞中可以獨立復(fù)制；在受體細(xì)胞中可以獨立復(fù)制； 易于篩選；易于篩選；

4、易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。1.1.抗性基因（抗性基因（Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene, Kanamycine resistance gene)resistance gene)2.2.啟始復(fù)制子（啟始復(fù)制子（oriori, Origin of , Origin of replication)replication)；3.3.多克隆位點多克隆位點(MS

5、C, Multiple cloning (MSC, Multiple cloning site or polylinker)site or polylinker)；4.4.標(biāo)記基因標(biāo)記基因(Marker gene, such as (Marker gene, such as LacZ gene)LacZ gene)。載體的結(jié)構(gòu)：載體的結(jié)構(gòu)：InsertEcoRIXhoI1.9kbDNA DNA 是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會導(dǎo)致境會導(dǎo)致DNADNA的變性，如加熱、極端的變性，如加熱、極端pHpH值、值、有機溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)有機溶劑、尿

6、素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使境又可以使DNADNA復(fù)性。復(fù)性。原理：原理：SDSSDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDSSDS處理細(xì)菌細(xì)胞后，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的處理細(xì)菌細(xì)胞后，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒破裂，從而使質(zhì)粒DNADNA以及基因組以及基因組DNADNA從細(xì)胞從細(xì)胞中同時釋放出來。釋放出來的中同時釋放出來。釋放出來的DNADNA遇到強堿遇到強堿性（性（NaOHNaOH）環(huán)境，就會變性。然后，用酸性）環(huán)境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中

7、性，質(zhì)粒乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNADNA將迅速復(fù)性，而基因組將迅速復(fù)性，而基因組DNADNA，由于分子巨，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNADNA將在上清將在上清中，而基因組中，而基因組DNADNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNADNA從細(xì)菌中提取出來。從細(xì)菌中提取出來。細(xì)菌裂解的方法： 堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于質(zhì)粒大量提取。測定測定DNADNA濃度的方法主要有兩種，即利

8、用分濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計法測定光光度計法測定DNADNA的紫外光吸收值；第二的紫外光吸收值；第二種方法是測定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光的種方法是測定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光的強度來計算核酸的含量。另外還有一種用于強度來計算核酸的含量。另外還有一種用于粗略檢測粗略檢測DNADNA濃度的方法是通過凝膠電泳，濃度的方法是通過凝膠電泳，與標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較。與標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較。DNADNA濃度的測定：濃度的測定：紫外光吸收法：紫外光吸收法：因為組成核酸的堿基因為組成核酸的堿基(G,A,T,C(G,A,T,C）在）在260nm260nm處處具有強吸收峰，所以通過測定具有強吸收峰，所以通過測

9、定260nm260nm的吸收的吸收峰即可對峰即可對DNADNA進(jìn)行定量。但有時也會因為所進(jìn)行定量。但有時也會因為所處溶液的處溶液的pHpH值不同而導(dǎo)致吸光系數(shù)的不同。值不同而導(dǎo)致吸光系數(shù)的不同。因此，一般在中性因此，一般在中性pHpH值左右的環(huán)境中進(jìn)行值左右的環(huán)境中進(jìn)行測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。3. 材料與試劑材料與試劑材料材料:含有質(zhì)粒含有質(zhì)粒pCMV-Myc-T10的大腸桿菌的大腸桿菌DH5。pCMV-MycpCMV-Myc是一種哺乳細(xì)胞表達(dá)載體，它含有一個是一種哺乳細(xì)胞表達(dá)載體，它含有一個N N端端c-c-Myc Myc 尾，常用于免疫反

10、應(yīng)的檢測和蛋白純化以及作為誘尾，常用于免疫反應(yīng)的檢測和蛋白純化以及作為誘餌蛋白檢測酵母雙雜交結(jié)果。餌蛋白檢測酵母雙雜交結(jié)果。Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains.Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts.E. coli replication origin: pUCCopy number: 500 InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T1

11、04. 步驟A.質(zhì)粒DNA的提取 堿裂解法堿裂解法溶液溶液1GET緩沖液：緩沖液： 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。溶液溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液溶液3乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5mL H2OTE緩沖液或水（緩沖液或水（+ 20m mg/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，乙醇，70乙醇乙醇注意：注意： 用移液器操作時，每一步

12、都要格用移液器操作時，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液外小心，特別是在加入溶液II II 和和IIIIII后，一定不要劇烈振蕩，以免后，一定不要劇烈振蕩，以免切碎切碎DNA(DNA(包括質(zhì)粒包括質(zhì)粒DNADNA和基因組和基因組DNA)DNA)！1. 培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)培養(yǎng)1216小時小時;2. 取液體培養(yǎng)液取液體培養(yǎng)液1.5-3ml于于Eppendorf管中，管中，10000r/min離心離心1min，去掉上清液，加入，去掉上清液，加入100m ml溶液溶液1

13、(GET) ，充分混勻放置，充分混勻放置3-5分鐘分鐘;3. 加入加入200m ml新配制的新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（變性液），加蓋顛倒（變性液），加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上次使之混勻，冰上放置放置5min;質(zhì)粒小量提取的方法（手工提?。嘿|(zhì)粒小量提取的方法（手工提?。?. 加入加入150 m m l乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(溶液溶液II)，加蓋后顛倒，加蓋后顛倒6-7次混勻，次混勻，冰上放置5min;5. 用臺式高速離心機，用臺式高速離心機，10000r/min離心離心7min，上，上清移入另一干凈離心管，并加清移入另一干凈離心管，并加1ml 100乙醇混乙醇混勻，勻，

14、12000r/min離心離心5min，棄去上清液，棄去上清液;6. 沉淀用沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次，乙醇清洗一次， 12000r/min離心離心5min，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥，除盡乙醇，室溫自然干燥;7. 加入加入30-50m ml含有含有20m mg/ml RNase的滅菌蒸餾水的滅菌蒸餾水或或TE 緩沖液溶解提取物，室溫放置緩沖液溶解提取物，室溫放置15-30min，使，使DNA充分溶解充分溶解(有時需要酚有時需要酚:氯仿抽提氯仿抽提);8. 將分離出的質(zhì)粒將分離出的質(zhì)粒DNA置于置于-20保存?zhèn)溆谩１４鎮(zhèn)溆?。Bi

15、odevBiodev（博大泰克）質(zhì)?？焖伲ú┐筇┛耍┵|(zhì)粒快速提取試劑盒（提取試劑盒（plasmid rapid plasmid rapid isolation kitisolation kit） 堿裂解法；離心柱結(jié)構(gòu)；特殊硅基質(zhì)吸附材料。堿裂解法；離心柱結(jié)構(gòu)；特殊硅基質(zhì)吸附材料。使用前按說明再溶液使用前按說明再溶液I中加入中加入RNase；向洗脫液；向洗脫液中按中按1:3的比例加入無水乙醇。的比例加入無水乙醇。操作步驟操作步驟1.1.收集收集1.51.53ml3ml菌液沉淀于菌液沉淀于1.5ml1.5ml離心管中。離心管中。加入加入100100m ml溶液溶液1 1，振蕩至徹底懸浮。，振蕩至徹

16、底懸浮。為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNADNA，培養(yǎng)細(xì)菌的時，培養(yǎng)細(xì)菌的時間不宜過長，一般為間不宜過長，一般為1212小時；小時；細(xì)菌沉淀中加入溶液細(xì)菌沉淀中加入溶液1 1后，一定要徹底懸浮，后，一定要徹底懸浮，否則抽提質(zhì)粒否則抽提質(zhì)粒DNADNA的純度及得率會大大降低的純度及得率會大大降低2.2.加入加入150150m ml溶液溶液2 2，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。隨后將離心管隨后將離心管冰上冰上放置放置1 12 2分鐘分鐘（時間勿（時間勿超）。超）。3.3. 加入加入150150

17、m ml溶液溶液3 3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置室溫放置5 5分鐘。分鐘。12000rpm12000rpm離心離心1212分鐘。分鐘。要獲得更好得質(zhì)粒提取效果，請于步驟要獲得更好得質(zhì)粒提取效果，請于步驟2 2和步和步驟驟3 3后，冰上放置。后，冰上放置。4.4. 將將420420m ml結(jié)合緩沖液結(jié)合緩沖液加入加入離心柱離心柱中。然后將中。然后將步驟步驟3 3的上清的上清加入離心加入離心吸附柱中吸附柱中（盡量去除雜質(zhì)），（盡量去除雜質(zhì)），混勻?；靹颉?2000rpm12000rpm離心離心3030秒鐘。倒掉廢液收集管秒鐘。倒掉廢液收集管中得溶液。中得溶液。5.5

18、. 加入加入750750m ml洗滌緩沖液洗滌緩沖液于離心吸附柱中，于離心吸附柱中，12000rpm12000rpm離心離心1 1分鐘。分鐘。濃縮漂洗液配置成工作濃度時，一定要使用無濃縮漂洗液配置成工作濃度時，一定要使用無水乙醇，否則，吸附于硅基質(zhì)材料上的水乙醇，否則，吸附于硅基質(zhì)材料上的DNADNA可能可能被洗脫下來，影響回收效率。被洗脫下來，影響回收效率。6.6. A.A.重復(fù)步驟重復(fù)步驟5 5一次；一次；B.B.隨后，再次于隨后，再次于12000rpm12000rpm空空管離心管離心2 2分鐘，盡量除去漂洗液。分鐘，盡量除去漂洗液。洗涕時（即步驟洗涕時（即步驟5和和6）一定要盡量除去漂洗

19、液，）一定要盡量除去漂洗液，否則，漂洗液中得乙醇會抑制后續(xù)得各種酶促否則，漂洗液中得乙醇會抑制后續(xù)得各種酶促反應(yīng)。必要時，可適當(dāng)延長離心時間或者用反應(yīng)。必要時，可適當(dāng)延長離心時間或者用Tip頭吸凈。頭吸凈。如果含有較多得蛋白、鹽類等雜質(zhì)，可多洗如果含有較多得蛋白、鹽類等雜質(zhì)，可多洗滌幾次。滌幾次。7. 小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的1.5ml離心管中。加入離心管中。加入50m ml洗脫緩沖液洗脫緩沖液，室溫，室溫放置放置5分鐘后，分鐘后，12000rpm離心離心1分鐘。分鐘。洗脫緩沖液一定要加入離心吸附柱中硅基質(zhì)洗脫緩沖液一定要加入離心吸附柱中硅基

20、質(zhì)材料得正中，以確保被吸附在硅基質(zhì)材料中材料得正中，以確保被吸附在硅基質(zhì)材料中得得DNA都能被洗脫下來。為提高回收效率，都能被洗脫下來。為提高回收效率，可適當(dāng)加大洗脫液體積及洗脫次數(shù)。可適當(dāng)加大洗脫液體積及洗脫次數(shù)。 為了充分除盡為了充分除盡RNARNA的污染，可在提取的質(zhì)粒中的污染，可在提取的質(zhì)粒中加入加入0.50.5m ml lRNaseARNaseA（10mg/ml10mg/ml）。這并不影響其）。這并不影響其他后續(xù)實驗，所提取的質(zhì)粒的純度足以用來作他后續(xù)實驗，所提取的質(zhì)粒的純度足以用來作為測序模板和其他酶促反應(yīng)。為測序模板和其他酶促反應(yīng)。 若提取的質(zhì)粒大于若提取的質(zhì)粒大于10Kb10K

21、b，在加入洗脫緩沖液后，在加入洗脫緩沖液后，可在可在7070水浴中放置水浴中放置3 35 5分鐘，以確保質(zhì)粒分鐘，以確保質(zhì)粒DNADNA的完全洗脫。的完全洗脫。B. 用分光光度計法定量用分光光度計法定量DNA1. 取取2m ml提取的質(zhì)粒提取的質(zhì)粒DNA，加入，加入98m ml蒸蒸餾水對待測餾水對待測DNA樣品做樣品做1:50(或更高或更高倍數(shù)的稀釋倍數(shù)的稀釋);2. 蒸餾水作為空白蒸餾水作為空白,在波長在波長260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計讀數(shù)處調(diào)節(jié)紫外分光光度計讀數(shù)至零。至零。3.加入加入DNA稀釋液，測定稀釋液，測定260nm 及及280nm的吸收值。的吸收值。260nm 讀數(shù)用于計算樣品中讀數(shù)用于計算樣品中核酸的濃度，核酸的濃度，OD260值為值為1相當(dāng)于約相當(dāng)于約50m mg /ml雙鏈雙鏈DNA，33m mg /ml單鏈?？筛鶕?jù)在單鏈?？筛鶕?jù)在260nm以及在以及在280nm的讀數(shù)的比值的讀數(shù)的比值（OD260/OD280）估計核酸的純度。一般）估計核酸的純度。一般DNA的純品，其比值為的純品，其比值為1.8，低于此值說，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它