質(zhì)粒DNA的提取及濃度判定

1、質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取及濃度檢測的提取及濃度檢測1.目的與要求 通過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測定，學習用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，了解用分光光度計測定DNA含量的方法。2. 相關(guān)知識及原理質(zhì)粒質(zhì)粒(Plasmid) (Plasmid) ：獨立于染色體外的，能自主復制且穩(wěn)定遺傳獨立于染色體外的，能自主復制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈DNADNA分子。分子。存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。細胞中，在細菌細胞中最多。DNA超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)細菌質(zhì)粒細菌質(zhì)粒: 細菌質(zhì)粒是用的最多的

2、質(zhì)粒類細菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從群，其大小從1Kb-200Kb，它們復，它們復制時利用宿主細胞復制自身基因組制時利用宿主細胞復制自身基因組DNA的同一組酶系。的同一組酶系。 嚴謹型：嚴謹型：這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞嚴格控這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞嚴格控制之下的，與寄主細胞的復制偶聯(lián)同步。所以，制之下的，與寄主細胞的復制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個細胞中只有一份或幾份拷貝；往往在一個細胞中只有一份或幾份拷貝； 松馳型：松馳型：這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞的松弛這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下的，每個細胞中含有控制之下的，每個細胞中含有10-200份拷貝，份拷貝，如果用一定的藥物

3、處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會使質(zhì)粒拷貝數(shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒才會使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達到更高拷貝數(shù)。才能達到更高拷貝數(shù)。質(zhì)粒類型：質(zhì)粒類型：載體載體(Vector)(Vector)：用于攜帶重組用于攜帶重組DNADNA，并且能夠使外源，并且能夠使外源DNADNA一起復制一起復制與表達的質(zhì)粒與表達的質(zhì)粒( (運載工具運載工具) )。具備的條件：具備的條件： 易于鑒定；易于鑒定； 在受體細胞中可以獨立復制；在受體細胞中可以獨立復制； 易于篩選；易于篩選；

4、易于導入受體細胞。易于導入受體細胞。1.1.抗性基因（抗性基因（Antibiotic resistance Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene, Kanamycine resistance gene)resistance gene)2.2.啟始復制子（啟始復制子（oriori, Origin of , Origin of replication)replication)；3.3.多克隆位點多克隆位點(MS

5、C, Multiple cloning (MSC, Multiple cloning site or polylinker)site or polylinker)；4.4.標記基因標記基因(Marker gene, such as (Marker gene, such as LacZ gene)LacZ gene)。載體的結(jié)構(gòu)：載體的結(jié)構(gòu)：InsertEcoRIXhoI1.9kbDNA DNA 是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會導致境會導致DNADNA的變性，如加熱、極端的變性，如加熱、極端pHpH值、值、有機溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)有機溶劑、尿

6、素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使境又可以使DNADNA復性。復性。原理：原理：SDSSDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以菌細胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDSSDS處理細菌細胞后，會導致細菌細胞壁的處理細菌細胞后，會導致細菌細胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒破裂，從而使質(zhì)粒DNADNA以及基因組以及基因組DNADNA從細胞從細胞中同時釋放出來。釋放出來的中同時釋放出來。釋放出來的DNADNA遇到強堿遇到強堿性（性（NaOHNaOH）環(huán)境，就會變性。然后，用酸性）環(huán)境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中

7、性，質(zhì)粒乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNADNA將迅速復性，而基因組將迅速復性，而基因組DNADNA，由于分子巨，由于分子巨大，難以復性。離心后，質(zhì)粒大，難以復性。離心后，質(zhì)粒DNADNA將在上清將在上清中，而基因組中，而基因組DNADNA則與細胞碎片一起沉淀到則與細胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNADNA從細菌中提取出來。從細菌中提取出來。細菌裂解的方法： 堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于質(zhì)粒大量提取。測定測定DNADNA濃度的方法主要有兩種，即利

8、用分濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計法測定光光度計法測定DNADNA的紫外光吸收值；第二的紫外光吸收值；第二種方法是測定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光的種方法是測定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光的強度來計算核酸的含量。另外還有一種用于強度來計算核酸的含量。另外還有一種用于粗略檢測粗略檢測DNADNA濃度的方法是通過凝膠電泳，濃度的方法是通過凝膠電泳，與標準分子量相比較。與標準分子量相比較。DNADNA濃度的測定：濃度的測定：紫外光吸收法：紫外光吸收法：因為組成核酸的堿基因為組成核酸的堿基(G,A,T,C(G,A,T,C）在）在260nm260nm處處具有強吸收峰，所以通過測定具有強吸收峰，所以通過測

9、定260nm260nm的吸收的吸收峰即可對峰即可對DNADNA進行定量。但有時也會因為所進行定量。但有時也會因為所處溶液的處溶液的pHpH值不同而導致吸光系數(shù)的不同。值不同而導致吸光系數(shù)的不同。因此，一般在中性因此，一般在中性pHpH值左右的環(huán)境中進行值左右的環(huán)境中進行測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。3. 材料與試劑材料與試劑材料材料:含有質(zhì)粒含有質(zhì)粒pCMV-Myc-T10的大腸桿菌的大腸桿菌DH5。pCMV-MycpCMV-Myc是一種哺乳細胞表達載體，它含有一個是一種哺乳細胞表達載體，它含有一個N N端端c-c-Myc Myc 尾，常用于免疫反

10、應的檢測和蛋白純化以及作為誘尾，常用于免疫反應的檢測和蛋白純化以及作為誘餌蛋白檢測酵母雙雜交結(jié)果。餌蛋白檢測酵母雙雜交結(jié)果。Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains.Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts.E. coli replication origin: pUCCopy number: 500 InsertEcoR1Xho11.9kbpCMV-Myc-T1

11、04. 步驟A.質(zhì)粒DNA的提取 堿裂解法堿裂解法溶液溶液1GET緩沖液：緩沖液： 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。溶液溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液溶液3乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，冰醋酸， 28.5mL H2OTE緩沖液或水（緩沖液或水（+ 20m mg/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，乙醇，70乙醇乙醇注意：注意： 用移液器操作時，每一步

12、都要格用移液器操作時，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液外小心，特別是在加入溶液II II 和和IIIIII后，一定不要劇烈振蕩，以免后，一定不要劇烈振蕩，以免切碎切碎DNA(DNA(包括質(zhì)粒包括質(zhì)粒DNADNA和基因組和基因組DNA)DNA)！1. 培養(yǎng)細菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到培養(yǎng)細菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基，含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)培養(yǎng)1216小時小時;2. 取液體培養(yǎng)液取液體培養(yǎng)液1.5-3ml于于Eppendorf管中，管中，10000r/min離心離心1min，去掉上清液，加入，去掉上清液，加入100m ml溶液溶液1

13、(GET) ，充分混勻放置，充分混勻放置3-5分鐘分鐘;3. 加入加入200m ml新配制的新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（變性液），加蓋顛倒（變性液），加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上次使之混勻，冰上放置放置5min;質(zhì)粒小量提取的方法（手工提?。嘿|(zhì)粒小量提取的方法（手工提取）：4. 加入加入150 m m l乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(溶液溶液II)，加蓋后顛倒，加蓋后顛倒6-7次混勻，次混勻，冰上放置5min;5. 用臺式高速離心機，用臺式高速離心機，10000r/min離心離心7min，上，上清移入另一干凈離心管，并加清移入另一干凈離心管，并加1ml 100乙醇混乙醇混勻，勻，

14、12000r/min離心離心5min，棄去上清液，棄去上清液;6. 沉淀用沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次，乙醇清洗一次， 12000r/min離心離心5min，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥，除盡乙醇，室溫自然干燥;7. 加入加入30-50m ml含有含有20m mg/ml RNase的滅菌蒸餾水的滅菌蒸餾水或或TE 緩沖液溶解提取物，室溫放置緩沖液溶解提取物，室溫放置15-30min，使，使DNA充分溶解充分溶解(有時需要酚有時需要酚:氯仿抽提氯仿抽提);8. 將分離出的質(zhì)粒將分離出的質(zhì)粒DNA置于置于-20保存?zhèn)溆谩１４鎮(zhèn)溆?。Bi

15、odevBiodev（博大泰克）質(zhì)?？焖伲ú┐筇┛耍┵|(zhì)粒快速提取試劑盒（提取試劑盒（plasmid rapid plasmid rapid isolation kitisolation kit） 堿裂解法；離心柱結(jié)構(gòu)；特殊硅基質(zhì)吸附材料。堿裂解法；離心柱結(jié)構(gòu)；特殊硅基質(zhì)吸附材料。使用前按說明再溶液使用前按說明再溶液I中加入中加入RNase；向洗脫液；向洗脫液中按中按1:3的比例加入無水乙醇。的比例加入無水乙醇。操作步驟操作步驟1.1.收集收集1.51.53ml3ml菌液沉淀于菌液沉淀于1.5ml1.5ml離心管中。離心管中。加入加入100100m ml溶液溶液1 1，振蕩至徹底懸浮。，振蕩至徹

16、底懸浮。為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒為了獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNADNA，培養(yǎng)細菌的時，培養(yǎng)細菌的時間不宜過長，一般為間不宜過長，一般為1212小時；小時；細菌沉淀中加入溶液細菌沉淀中加入溶液1 1后，一定要徹底懸浮，后，一定要徹底懸浮，否則抽提質(zhì)粒否則抽提質(zhì)粒DNADNA的純度及得率會大大降低的純度及得率會大大降低2.2.加入加入150150m ml溶液溶液2 2，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，立即輕柔顛倒離心管數(shù)次，使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。使菌體充分裂解，裂解后的菌體變得清亮。隨后將離心管隨后將離心管冰上冰上放置放置1 12 2分鐘分鐘（時間勿（時間勿超）。超）。3.3. 加入加入150150

17、m ml溶液溶液3 3，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置室溫放置5 5分鐘。分鐘。12000rpm12000rpm離心離心1212分鐘。分鐘。要獲得更好得質(zhì)粒提取效果，請于步驟要獲得更好得質(zhì)粒提取效果，請于步驟2 2和步和步驟驟3 3后，冰上放置。后，冰上放置。4.4. 將將420420m ml結(jié)合緩沖液結(jié)合緩沖液加入加入離心柱離心柱中。然后將中。然后將步驟步驟3 3的上清的上清加入離心加入離心吸附柱中吸附柱中（盡量去除雜質(zhì)），（盡量去除雜質(zhì)），混勻?；靹?。12000rpm12000rpm離心離心3030秒鐘。倒掉廢液收集管秒鐘。倒掉廢液收集管中得溶液。中得溶液。5.5

18、. 加入加入750750m ml洗滌緩沖液洗滌緩沖液于離心吸附柱中，于離心吸附柱中，12000rpm12000rpm離心離心1 1分鐘。分鐘。濃縮漂洗液配置成工作濃度時，一定要使用無濃縮漂洗液配置成工作濃度時，一定要使用無水乙醇，否則，吸附于硅基質(zhì)材料上的水乙醇，否則，吸附于硅基質(zhì)材料上的DNADNA可能可能被洗脫下來，影響回收效率。被洗脫下來，影響回收效率。6.6. A.A.重復步驟重復步驟5 5一次；一次；B.B.隨后，再次于隨后，再次于12000rpm12000rpm空空管離心管離心2 2分鐘，盡量除去漂洗液。分鐘，盡量除去漂洗液。洗涕時（即步驟洗涕時（即步驟5和和6）一定要盡量除去漂洗

19、液，）一定要盡量除去漂洗液，否則，漂洗液中得乙醇會抑制后續(xù)得各種酶促否則，漂洗液中得乙醇會抑制后續(xù)得各種酶促反應。必要時，可適當延長離心時間或者用反應。必要時，可適當延長離心時間或者用Tip頭吸凈。頭吸凈。如果含有較多得蛋白、鹽類等雜質(zhì)，可多洗如果含有較多得蛋白、鹽類等雜質(zhì)，可多洗滌幾次。滌幾次。7. 小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的1.5ml離心管中。加入離心管中。加入50m ml洗脫緩沖液洗脫緩沖液，室溫，室溫放置放置5分鐘后，分鐘后，12000rpm離心離心1分鐘。分鐘。洗脫緩沖液一定要加入離心吸附柱中硅基質(zhì)洗脫緩沖液一定要加入離心吸附柱中硅基

20、質(zhì)材料得正中，以確保被吸附在硅基質(zhì)材料中材料得正中，以確保被吸附在硅基質(zhì)材料中得得DNA都能被洗脫下來。為提高回收效率，都能被洗脫下來。為提高回收效率，可適當加大洗脫液體積及洗脫次數(shù)。可適當加大洗脫液體積及洗脫次數(shù)。 為了充分除盡為了充分除盡RNARNA的污染，可在提取的質(zhì)粒中的污染，可在提取的質(zhì)粒中加入加入0.50.5m ml lRNaseARNaseA（10mg/ml10mg/ml）。這并不影響其）。這并不影響其他后續(xù)實驗，所提取的質(zhì)粒的純度足以用來作他后續(xù)實驗，所提取的質(zhì)粒的純度足以用來作為測序模板和其他酶促反應。為測序模板和其他酶促反應。 若提取的質(zhì)粒大于若提取的質(zhì)粒大于10Kb10K

21、b，在加入洗脫緩沖液后，在加入洗脫緩沖液后，可在可在7070水浴中放置水浴中放置3 35 5分鐘，以確保質(zhì)粒分鐘，以確保質(zhì)粒DNADNA的完全洗脫。的完全洗脫。B. 用分光光度計法定量用分光光度計法定量DNA1. 取取2m ml提取的質(zhì)粒提取的質(zhì)粒DNA，加入，加入98m ml蒸蒸餾水對待測餾水對待測DNA樣品做樣品做1:50(或更高或更高倍數(shù)的稀釋倍數(shù)的稀釋);2. 蒸餾水作為空白蒸餾水作為空白,在波長在波長260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計讀數(shù)處調(diào)節(jié)紫外分光光度計讀數(shù)至零。至零。3.加入加入DNA稀釋液，測定稀釋液，測定260nm 及及280nm的吸收值。的吸收值。260nm 讀數(shù)用于計算樣品中讀數(shù)用于計算樣品中核酸的濃度，核酸的濃度，OD260值為值為1相當于約相當于約50m mg /ml雙鏈雙鏈DNA，33m mg /ml單鏈?？筛鶕?jù)在單鏈?？筛鶕?jù)在260nm以及在以及在280nm的讀數(shù)的比值的讀數(shù)的比值（OD260/OD280）估計核酸的純度。一般）估計核酸的純度。一般DNA的純品，其比值為的純品，其比值為1.8，低于此值說，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它