第15章平面色譜法0507(2010級藥學)

1、平面色譜法平面色譜法 (plane chromatography)(plane chromatography)主講：袁玉主講：袁玉中南大學藥學院中南大學藥學院20122012年年5 5月月 第一節(jié)第一節(jié) 平面色譜法的分類和原理平面色譜法的分類和原理 第二節(jié)第二節(jié) 薄層色譜法薄層色譜法 第三節(jié)第三節(jié) 紙色譜法紙色譜法本章內容本章內容第一節(jié)平面色譜法的分類和原理第一節(jié)平面色譜法的分類和原理一、平面色譜法的分類一、平面色譜法的分類 組分在以平面為載體的固定相和流動相之間吸附或組分在以平面為載體的固定相和流動相之間吸附或分配平衡而進行的一種色譜方法。分配平衡而進行的一種色譜方法。按按操操作作方方式式

2、1薄層色譜法薄層色譜法（thin layer chromatography）2 紙色譜法紙色譜法(paper chromatography)3 薄層電泳法薄層電泳法(thin layer electrophoresis)吸附薄層色譜法吸附薄層色譜法分配薄層色譜法分配薄層色譜法分子排阻薄層色譜法分子排阻薄層色譜法等等等等按按分分離離機機制制二二 平面色譜法參數(shù)平面色譜法參數(shù)1. 定性參數(shù)：反映組分的保留行為定性參數(shù)：反映組分的保留行為2. 相平衡參數(shù)：描述分離過程相平衡參數(shù)：描述分離過程3. 面效參數(shù)：衡量分離效能面效參數(shù)：衡量分離效能4. 分離參數(shù)：衡量分離條件的優(yōu)劣分離參數(shù)：衡量分離條件的優(yōu)

3、劣（一）（一） 定性參數(shù)定性參數(shù)1 比移值比移值(Retardation factor, Rf值值)溶質移動距離與流動相移動距離之比。溶質移動距離與流動相移動距離之比。 Rf =L/L0 （適宜范圍（適宜范圍0.20.8，最佳，最佳0.30.5） L原點至斑點中心的距離原點至斑點中心的距離 L0原點至溶劑前沿的距離原點至溶劑前沿的距離 展開溶劑展開溶劑原點原點L0L前沿前沿1 比移值比移值(Retardation factor, Rf值值) Rf數(shù)值與組分及色譜條件（薄層板活性，展開劑等）數(shù)值與組分及色譜條件（薄層板活性，展開劑等）和溫度有關和溫度有關 實驗中滿足下列條件，可獲得真實實驗中滿足

4、下列條件，可獲得真實Rf值：值： a 展開槽密閉不泄露，薄層板周圍空間被展開劑蒸汽展開槽密閉不泄露，薄層板周圍空間被展開劑蒸汽所飽和，無邊緣效應所飽和，無邊緣效應; b 沿分離軌跡固定相與流動相無梯度變化沿分離軌跡固定相與流動相無梯度變化; c 展開劑的前沿位置能正確測定。展開劑的前沿位置能正確測定。2 相對比移值相對比移值(relative Rf；Rr) Rr = Rf (i)/Rf (s)=L(i)/L(s) 與組分、色譜條件、參考物質有關。與組分、色譜條件、參考物質有關。 Rr值可以大于值可以大于1，也可以小于，也可以小于1。 重現(xiàn)性和可比性均比重現(xiàn)性和可比性均比Rf值好，能消除系統(tǒng)誤差

5、值好，能消除系統(tǒng)誤差（參考物質與組分在完全相同的條件下展開）參考物質與組分在完全相同的條件下展開） 1 分配系數(shù)分配系數(shù) K = 2 保留因子保留因子 k = =3 分配系數(shù)分配系數(shù)K、保留因子、保留因子 k與與Rf值的關系：值的關系： ( (二二) )相平衡參數(shù)相平衡參數(shù)kR11fms/11VKVff1RRk組分在固定相中的量組分在固定相中的量組分在流動相中的量組分在流動相中的量CsVsCmVmCsCmCs、Cm分別表示在達到分分別表示在達到分配平衡后，某物質在固定配平衡后，某物質在固定相和流動相中的濃度。相和流動相中的濃度。（三）面效參數(shù)（三）面效參數(shù)1 理論塔板數(shù)（理論塔板數(shù)（n） n

6、= 16(L/ W)22 塔板高度（塔板高度（H） H = L0/n（四）分離參數(shù)（四）分離參數(shù)1 分離度（分離度（R）R12 分離數(shù)（分離數(shù)（SN） R=1.177時，時， SN =L0 / ( b 0 + b 1) - 1, dW1W2Rf=0Rf=1前沿前沿原點原點SN: 7 10（一般（一般TLC板）板） 10 20（高效（高效TLC板）板）)(2d)()2(RWWWWLL212112第二節(jié)薄層色譜法第二節(jié)薄層色譜法 (thin layer chromatography；TLC)一一 定義、特點、主要類型定義、特點、主要類型二二 吸附薄層色譜的吸附劑和展開劑吸附薄層色譜的吸附劑和展開劑

7、三三 薄層色譜操作方法薄層色譜操作方法四四 定性和定量分析定性和定量分析五五 高效薄層色譜法高效薄層色譜法六六 薄層掃描法簡介薄層掃描法簡介七七 在藥物研究中的應用在藥物研究中的應用 薄層色譜法特點：薄層色譜法特點：1 分析速度快，需十至幾十分鐘，同時展開多個試樣。分析速度快，需十至幾十分鐘，同時展開多個試樣。2 試樣預處理簡單，對試樣限制少。試樣預處理簡單，對試樣限制少。 3 載樣量比較大，適用于制備。載樣量比較大，適用于制備。 4 儀器簡單，操作方便。儀器簡單，操作方便。5 分離能力較強，分析結果直觀。分離能力較強，分析結果直觀。一一 薄層色譜法定義、特點及主要類型薄層色譜法定義、特點及主

8、要類型 定義：定義：將吸附劑或載體涂布成一均勻薄層，點樣，將吸附劑或載體涂布成一均勻薄層，點樣，（密閉的容器中）展開，斑點顯色，（與對照物質（密閉的容器中）展開，斑點顯色，（與對照物質比較）進行定性定量。比較）進行定性定量。 薄層色譜法的主要類型薄層色譜法的主要類型1 吸附薄層色譜法吸附薄層色譜法 原理原理 ：組分在薄層板上吸附、解組分在薄層板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的過程。吸附、再吸附、再解吸附的過程。 吸附系數(shù)吸附系數(shù) Ka 大小不同實現(xiàn)分離大小不同實現(xiàn)分離 極性強的組分極性強的組分 Ka 大，大，Rf值??；值小； 極性弱的組分極性弱的組分 Ka 小，小，Rf值大。值大。 2 分配

9、薄層色譜法分配薄層色譜法 原理：多次分配的過程，分配系數(shù)原理：多次分配的過程，分配系數(shù)（溶解度）大小不同實現(xiàn)分離（溶解度）大小不同實現(xiàn)分離 分類：按流動相與固定相極性大小分類：按流動相與固定相極性大?。?）正相色譜）正相色譜 固定相：含水硅膠固定相：含水硅膠 流動相：有機溶劑。流動相：有機溶劑。 極性強的組分極性強的組分K大，大， Rf 值小。值小。（2）反相色譜：）反相色譜： 固定相：烷基化學鍵合相固定相：烷基化學鍵合相 流動相：水有機溶劑。流動相：水有機溶劑。 極性強的組分極性強的組分K小，小， Rf 值大。值大。3 凝膠薄層色譜法：凝膠薄層色譜法： 用葡聚糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠等鋪成薄層

10、板進行用葡聚糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠等鋪成薄層板進行大分子化合物的分離。凝膠是具有一定孔徑的網(wǎng)狀結構物大分子化合物的分離。凝膠是具有一定孔徑的網(wǎng)狀結構物質，是利用其網(wǎng)孔大小把分子大小和形狀不同的大分子化質，是利用其網(wǎng)孔大小把分子大小和形狀不同的大分子化合物分開（一般是分開成組，而不能分開為單一化合物），合物分開（一般是分開成組，而不能分開為單一化合物），又稱為排阻或分子篩層析法。又稱為排阻或分子篩層析法。4 膠束薄層色譜法膠束薄層色譜法(micellar TLC)： 用低濃度表面活性劑的水溶液為流動相，當所用的用低濃度表面活性劑的水溶液為流動相，當所用的表面活性劑水溶液需超過某一濃度（臨界膠束濃

11、度表面活性劑水溶液需超過某一濃度（臨界膠束濃度CMC）時多余的表面活性劑不再溶解，而聚集成膠束（膠粒），時多余的表面活性劑不再溶解，而聚集成膠束（膠粒），因流動相為膠體分散體系，故稱為膠束液相色譜。因流動相為膠體分散體系，故稱為膠束液相色譜。薄層色譜法的主要類型薄層色譜法的主要類型二、吸附薄層色譜的吸附劑和展開劑二、吸附薄層色譜的吸附劑和展開劑（一）吸附劑（一）吸附劑 1 硅膠硅膠：多孔性無定形粉末，表面帶有硅醇基多孔性無定形粉末，表面帶有硅醇基 （Si-OHSi-OH），呈弱酸性），呈弱酸性, ,表面表面pHpH5 5。 原理：原理：硅醇基硅醇基( (吸附中心吸附中心) )與極性基團形成氫鍵

12、與極性基團形成氫鍵 （吸附性）。組分與硅醇基形成氫鍵（吸附性）。組分與硅醇基形成氫鍵 （被吸附）的能力不同而分離。（被吸附）的能力不同而分離。 應用：應用：酸性和中性物質的分離，如有機酸酚類、酸性和中性物質的分離，如有機酸酚類、 醛類等。醛類等。 堿性物質與硅膠作用，展開時被吸附、堿性物質與硅膠作用，展開時被吸附、 拖尾、甚至展不開。拖尾、甚至展不開。硅膠硅膠 活度活度與含水量的關系：含水量高，活性級高，活度低。與含水量的關系：含水量高，活性級高，活度低。 活化：活化：加熱至加熱至100左右，除去吸附水提高度。左右，除去吸附水提高度。 （注意溫度不可過高，硅醇基（注意溫度不可過高，硅醇基硅氧基

13、硅氧基） 分離效率：分離效率： 與其與其粒度粒度、孔徑孔徑及及表面積表面積等有關。等有關。 一般地一般地 (10-40(10-40m)m) (100nm) (400-600m (100nm) (400-600m2 2/g)/g) 常用硅膠：常用硅膠：硅膠硅膠H H 不含黏合劑不含黏合劑硅膠硅膠G(GypsumG(Gypsum, ,石膏石膏) )：含煅石膏（：含煅石膏（CaSOCaSO4 41/2H1/2H2 2O O）硅膠硅膠GFGF254254：含煅石膏和一種無機熒光劑，即錳激活的硅：含煅石膏和一種無機熒光劑，即錳激活的硅酸鋅，在酸鋅，在254nm254nm紫外光下呈強烈黃綠色熒光背景。紫外

14、光下呈強烈黃綠色熒光背景。 2 2 氧化鋁（氧化鋁（活度也與含水量有關）活度也與含水量有關）堿性氧化鋁堿性氧化鋁(pH9.0)分離中性或堿性化合物，如生物堿、分離中性或堿性化合物，如生物堿、脂溶性維生素等；脂溶性維生素等； 中性氧化鋁中性氧化鋁(pH7.5)分離酸性及對堿不穩(wěn)定的化合物；分離酸性及對堿不穩(wěn)定的化合物；酸性氧化鋁酸性氧化鋁(pH4.0) 酸性化合物的分離。酸性化合物的分離。3 3 聚酰胺聚酰胺 聚己內酰胺：白色多孔性非晶型粉末聚己內酰胺：白色多孔性非晶型粉末 酰胺基與化合物質子給體形成氫鍵而對化合物產(chǎn)生酰胺基與化合物質子給體形成氫鍵而對化合物產(chǎn)生吸附。吸附。 應用：酚、酸、硝基、

15、醌類等分離應用：酚、酸、硝基、醌類等分離（二）展開劑（二）展開劑( (流動相流動相) )選擇原則：選擇原則：同吸附柱色譜，根據(jù)同吸附柱色譜，根據(jù)被分離物質的極性被分離物質的極性、吸附劑活度吸附劑活度、展開劑極性展開劑極性Stahl簡圖：簡圖： 例：極性物質例：極性物質 活度低（活性級大）活度低（活性級大）的吸附劑的吸附劑 極性展開劑極性展開劑 常用溶劑的極性強弱順序常用溶劑的極性強弱順序 水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳甲苯苯三氯乙烷四氯化碳 環(huán)己烷環(huán)己烷 石石油醚油醚極性強的溶劑，洗脫能力強極性強的溶劑

16、，洗脫能力強單一溶劑展開單一溶劑展開 分離效果分離效果Rf ？ Rf值太?。杭訕O性強的溶劑，如乙醇、丙酮等；值太小：加極性強的溶劑，如乙醇、丙酮等； Rf值太大，加極性弱的溶劑，如環(huán)己烷、石油醚值太大，加極性弱的溶劑，如環(huán)己烷、石油醚等；等；可加入一定比例的酸或堿可加入一定比例的酸或堿,使斑點集中。使斑點集中。 展開劑展開劑 混合溶劑混合溶劑三、薄層色譜操作方法三、薄層色譜操作方法 1 制板均勻制板均勻 2 點樣集中點樣集中 3 展開展開(多種方式多種方式) 預飽和預飽和 4 斑點定位斑點定位1 薄層板的制備薄層板的制備（1 1）薄層板的選擇）薄層板的選擇 表面光滑、平整、潔凈，厚度一致表面光

17、滑、平整、潔凈，厚度一致 玻璃板、塑料板或鋁箔玻璃板、塑料板或鋁箔 大小按實驗需要選規(guī)格：大小按實驗需要選規(guī)格： 10 cm10 cm 10 cml5 cm 20 cm10 cm 20 cm20 cm （2 2）薄層板的涂布：）薄層板的涂布：將固定相、粘合劑和水，按比例混合將固定相、粘合劑和水，按比例混合均勻、無氣泡的固定相勻漿均勻、無氣泡的固定相勻漿均勻玻璃板均勻玻璃板 (厚度為厚度為0.250.5mm)玻板置室溫下水平臺上晾干玻板置室溫下水平臺上晾干在反射光及透射光下檢視在反射光及透射光下檢視薄層板表面應均勻，干整，薄層板表面應均勻，干整，無麻點、無氣泡、無破損及污染。無麻點、無氣泡、無破

18、損及污染。研磨研磨涂布（使用涂布器、傾倒涂涂布（使用涂布器、傾倒涂層、浸涂、噴涂）層、浸涂、噴涂）（3）薄層板的活化）薄層板的活化一般活化：硅膠一般活化：硅膠110烘烘30分鐘，分鐘， 氧化鋁氧化鋁110烘烘45分鐘分鐘 強活化：強活化： 硅膠硅膠150烘烘4h， 氧化鋁氧化鋁180烘烘4h冷卻后立即使用或置干燥箱中備用，或用商品預冷卻后立即使用或置干燥箱中備用，或用商品預制板。制板。 2 點樣點樣 樣品溶液：濃度樣品溶液：濃度0.010.010.10.1, ,溶劑：有機溶劑，如溶劑：有機溶劑，如乙醇或甲醇等，避免用水；乙醇或甲醇等，避免用水； 點樣工具：點樣毛細管或微量注射器點樣工具：點樣毛

19、細管或微量注射器 點樣基線距底邊點樣基線距底邊1.0-1.5cm1.0-1.5cm 樣點一般為圓點，直徑一般樣點一般為圓點，直徑一般2-4mm2-4mm 采用分量多次點，每次點樣需自然干燥或電吹風吹干采用分量多次點，每次點樣需自然干燥或電吹風吹干后，才能二次點樣。后，才能二次點樣。 點樣量點樣量: :幾微升，薄層定量或薄層制備時，可幾百微幾微升，薄層定量或薄層制備時，可幾百微升升 點樣時必須注意勿損傷薄層表面。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。 3 展開展開 將點好樣品的薄層板放入展開缸的展開劑中，浸入展將點好樣品的薄層板放入展開缸的展開劑中，浸入展開劑的深度為距原點開劑的深度為距原點5mm5mm

20、為宜，密閉，待展開至規(guī)定為宜，密閉，待展開至規(guī)定距離，除另有規(guī)定外，一般為距離，除另有規(guī)定外，一般為8 815cm15cm，取出薄層板，取出薄層板，標記溶劑前沿，晾干，按具體試驗的規(guī)定檢測。標記溶劑前沿，晾干，按具體試驗的規(guī)定檢測。 展開缸如需預先用展開劑預平衡，可在缸中加入適量展開缸如需預先用展開劑預平衡，可在缸中加入適量的展開劑，必要時并在壁上貼二條與缸一樣高、寬的的展開劑，必要時并在壁上貼二條與缸一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，蓋嚴，使展開缸平衡。濾紙條，一端浸入展開劑中，蓋嚴，使展開缸平衡。避免邊緣效應。避免邊緣效應。 邊緣效應：邊緣效應：同一組分在同一板上同一組分在同一板上處于

21、邊緣斑點的處于邊緣斑點的Rf比處于中心的比處于中心的Rf值大的現(xiàn)象。值大的現(xiàn)象。 產(chǎn)生原因：產(chǎn)生原因： 展開劑的展開劑的蒸發(fā)速度蒸發(fā)速度從薄層中從薄層中央到兩邊緣逐漸增加，即央到兩邊緣逐漸增加，即處于邊處于邊緣的溶劑揮發(fā)速度較快緣的溶劑揮發(fā)速度較快。在相同。在相同條件下，致使同一組分在邊緣的條件下，致使同一組分在邊緣的遷移距離大于中心的遷移距離。遷移距離大于中心的遷移距離。薄層色譜的邊緣效應薄層色譜的邊緣效應展開劑：展開劑：氯仿氯仿-甲醇（甲醇（95：5）展開距離展開距離10cm展開一個展開一個TLC板，一個紫色的斑點被分離為一個紅色斑點與一個藍色斑點板，一個紫色的斑點被分離為一個紅色斑點與一

22、個藍色斑點 樣品的二次展開樣品的二次展開B 一次展開一次展開C 二次展開二次展開A 點樣點樣溶劑展開方向溶劑展開方向4 斑點的確定斑點的確定斑點位置的確定方法：斑點位置的確定方法：（1）在日光燈下觀察，畫出有色物質的斑點位置；）在日光燈下觀察，畫出有色物質的斑點位置；（2）在紫外燈下（）在紫外燈下（254nm或或365nm）觀察有無暗斑）觀察有無暗斑 或熒光斑或熒光斑點，并記錄其顏色、位置及強弱。點，并記錄其顏色、位置及強弱。（3） 254nm紫外燈下，摻入了少量熒光物質的薄板呈黃綠色紫外燈下，摻入了少量熒光物質的薄板呈黃綠色熒光，被測組分在熒光薄層板上猝滅而產(chǎn)生暗斑進行檢出。熒光，被測組分在

23、熒光薄層板上猝滅而產(chǎn)生暗斑進行檢出。(注意帶防護眼鏡注意帶防護眼鏡)（4）利用顯色劑顯色斑點（適合無色無紫外吸收的物質）。）利用顯色劑顯色斑點（適合無色無紫外吸收的物質）。 通用型顯色劑通用型顯色劑：碘：碘：生物堿、氨基酸類、肽類、脂類、皂苷類生物堿、氨基酸類、肽類、脂類、皂苷類10硫酸乙醇溶液硫酸乙醇溶液：105加熱加熱10-15min，大多大多數(shù)有機物（紅色、棕色、紫色或出現(xiàn)熒光）數(shù)有機物（紅色、棕色、紫色或出現(xiàn)熒光）0.05熒光黃甲醇溶液熒光黃甲醇溶液：芳香族與雜環(huán)：芳香族與雜環(huán)專屬型顯色劑專屬型顯色劑：如：如： 0.3%茚三酮丁醇溶液茚三酮丁醇溶液（含（含3%醋酸）檢測氨基酸醋酸）檢測

24、氨基酸及脂肪伯胺類化合物，顯粉紅色到紫色；及脂肪伯胺類化合物，顯粉紅色到紫色；等等等等 10種種精油精油通過薄層色譜展開后，再使用通過薄層色譜展開后，再使用香草香草醛醛試劑顯色后的效果。試劑顯色后的效果。 四、定性和定量分析四、定性和定量分析1 1 定性分析定性分析 a a 比較比較R Rf f值或值或R Rr r值值 、斑點顏色或熒光、斑點顏色或熒光b b 常采用已知標準物質對照（同一板上展常采用已知標準物質對照（同一板上展開）開）c c 多種展開系統(tǒng)的多種展開系統(tǒng)的R Rf f值與對照品一致。值與對照品一致。2 2 定量分析定量分析a a洗脫法洗脫法b b直接定量法直接定量法b1.b1.目

25、視比較法（目視比較法（如雜質檢查方法如雜質檢查方法）b2.b2.薄層掃描法薄層掃描法 雜質檢查方法雜質檢查方法1 雜質對照品比較法：雜質對照品比較法： 配制試樣溶液（配制試樣溶液（A）和規(guī)定限量濃度的雜）和規(guī)定限量濃度的雜質對照品溶液（質對照品溶液（B） 斑點顏色：試樣中雜質不得比雜質對照品斑點顏色：試樣中雜質不得比雜質對照品深深2 主成分自身對照法主成分自身對照法 供試品溶液（供試品溶液（A1）, 將其稀釋一定倍數(shù)得將其稀釋一定倍數(shù)得到低濃度溶液（到低濃度溶液（A2）作為對照溶液）作為對照溶液,將供將供試液和對照液一同展開，供試液中雜質斑試液和對照液一同展開，供試液中雜質斑點顏色不得比對照液

26、主斑點深。點顏色不得比對照液主斑點深。A B雜質雜質A1 A2雜質雜質主斑點主斑點五五 高效薄層色譜法高效薄層色譜法1 高效薄層板：商品預制板高效薄層板：商品預制板2 點樣：濃溶液一次點樣點樣：濃溶液一次點樣 點樣器：鉑點樣器：鉑-銥合金點樣毛細管、微量注射器或銥合金點樣毛細管、微量注射器或專用點樣儀器。專用點樣儀器。3 展開：與經(jīng)典薄層色譜法相同的展開方式。展開：與經(jīng)典薄層色譜法相同的展開方式。 或專用高效薄層色譜展開槽（重現(xiàn)性較好）。或專用高效薄層色譜展開槽（重現(xiàn)性較好）。4 定量分析：均采用薄層掃描儀定量分析。定量分析：均采用薄層掃描儀定量分析。六六 薄層掃描法簡介薄層掃描法簡介（一）薄

27、層掃描法基本原理（一）薄層掃描法基本原理 用一定用一定波長波長和和強度強度的光照射到薄層斑點上進的光照射到薄層斑點上進行整個斑點掃描，用儀器測量行整個斑點掃描，用儀器測量透過斑點透過斑點或或被斑點反被斑點反射射的光束強度的變化達到定量的目的。的光束強度的變化達到定量的目的。斑點掃描積分面積斑點掃描積分面積物質含量物質含量（二）薄層掃描儀組成：（二）薄層掃描儀組成： 主機：主機：光源：光源：可見光源可見光源 鎢燈鎢燈 400-800nm 紫外光源紫外光源 氘燈氘燈 200-400nm （光源選擇桿變換）（光源選擇桿變換） 分光器分光器：光柵：光柵 200-800nm 檢測器檢測器：光電倍增管：光

28、電倍增管 數(shù)據(jù)處理及信號輸出數(shù)據(jù)處理及信號輸出1 薄層色譜掃描儀光束系統(tǒng)薄層色譜掃描儀光束系統(tǒng)光光波長波長1波長波長2檢測器檢測器斬波器斬波器光光波長波長1檢測器檢測器光光波長波長1檢測器檢測器斬波器斬波器A 單光束單光束B 雙光束雙光束C 雙波長雙波長 2.1透射法透射法 光源與檢測器在薄層板上光源與檢測器在薄層板上下兩側。光源發(fā)出的光經(jīng)下兩側。光源發(fā)出的光經(jīng)單色器成為一定波長的單單色器成為一定波長的單色光，光束照到薄層斑點色光，光束照到薄層斑點上，測量透射光強度。上，測量透射光強度。 實際應用少實際應用少光源單色器2 薄層色譜掃描儀測定方法薄層色譜掃描儀測定方法 2.2反射法反射法 光源與

29、檢測器在薄層板同光源與檢測器在薄層板同側。光源發(fā)出的光經(jīng)單色側。光源發(fā)出的光經(jīng)單色器成為一定波長的單色光，器成為一定波長的單色光，光束照到薄層斑點上，部光束照到薄層斑點上，部分被薄層吸收，部分經(jīng)過分被薄層吸收，部分經(jīng)過漫反射又折回表面成為反漫反射又折回表面成為反射光，測量反射光強度，射光，測量反射光強度，得到反射光譜。得到反射光譜。 反射吸收度與物質含量有反射吸收度與物質含量有確定關系，可進行定量。確定關系，可進行定量。光源單色器3 薄層色譜掃描儀掃描方式薄層色譜掃描儀掃描方式 直線型掃描（直線型掃描（linear scan） 用一束比斑點寬度略寬的光作一用一束比斑點寬度略寬的光作一個方向的等

30、速掃描。個方向的等速掃描。 鋸齒型掃描鋸齒型掃描(zigzag scan）或稱飛）或稱飛點（點（flying spot）掃描）掃描 用微小的正方形光速在對斑點進用微小的正方形光速在對斑點進行行Y軸等速直線掃描的同時對斑軸等速直線掃描的同時對斑點進行點進行X軸等輻往復掃描，光束軸等輻往復掃描，光束運動軌跡呈鋸齒形。運動軌跡呈鋸齒形。直線掃描直線掃描鋸齒掃描鋸齒掃描輪廓曲線輪廓曲線積分曲線積分曲線A B C斑點斑點ABC對于不規(guī)則斑點，兩種掃描結果不一樣。同對于不規(guī)則斑點，兩種掃描結果不一樣。同一斑點從一斑點從A、B、C三個不同方向掃描，鋸齒三個不同方向掃描，鋸齒掃描所得積分值變動小，而直線掃描所

31、得積掃描所得積分值變動小，而直線掃描所得積分值變動大。分值變動大。直線掃描直線掃描鋸齒掃描鋸齒掃描4 散射參數(shù)的選擇散射參數(shù)的選擇非線性關系的校正非線性關系的校正 曲線校正：實驗前根據(jù)薄曲線校正：實驗前根據(jù)薄層板的類型，選擇合適的層板的類型，選擇合適的散射參數(shù)（散射參數(shù)（SX），由計算），由計算機根據(jù)適當?shù)男拚绦颍瑱C根據(jù)適當?shù)男拚绦?，自動進行校正。曲線較直自動進行校正。曲線較直后方可進行定量分析。后方可進行定量分析。 島津薄層掃描儀一般設有島津薄層掃描儀一般設有10個散射參數(shù)，硅膠薄層個散射參數(shù)，硅膠薄層板，板，SX一般選用一般選用3，氧化，氧化鋁板選鋁板選7.樣品量樣品量吸吸光光度度DC

32、BAA A 未校正的標準曲線未校正的標準曲線 B B 校正不夠校正不夠 C C 校正合適校正合適 D D 校正過頭校正過頭 5 5 定量分析法定量分析法 （）外標法：（）外標法：分別配分別配制對照品溶液和樣品溶制對照品溶液和樣品溶液，先做出標準曲線，液，先做出標準曲線，然后在同一塊薄層板上然后在同一塊薄層板上交叉點對照品溶液和樣交叉點對照品溶液和樣品溶液，品溶液，根據(jù)標準曲線根據(jù)標準曲線（對照品含量和峰面積（對照品含量和峰面積值）和樣品的面積值計值）和樣品的面積值計算出樣品的含量。算出樣品的含量。 （）外標一點法（）外標一點法 （）外標兩點法（）外標兩點法A1aC10AxCx外標一點法外標一點

33、法A1aC10A2CxC2b外標外標兩兩點法點法6 分析誤差分析誤差 薄層分析的誤差包括三個方面：點樣誤差、展開誤差、定薄層分析的誤差包括三個方面：點樣誤差、展開誤差、定位誤差和檢測誤差。位誤差和檢測誤差。 采用自動點樣器，誤差可控制在采用自動點樣器，誤差可控制在0.5%，熟練的分析人員，熟練的分析人員用毛細管點樣，誤差小于用毛細管點樣，誤差小于1.0%，若用微量進樣器，誤差，若用微量進樣器，誤差會大一些。會大一些。 展開誤差來自鋪板的均勻性和樣品展開效果，若采用預制展開誤差來自鋪板的均勻性和樣品展開效果，若采用預制的高效薄層板，誤差會明顯降低，采用雙波長鋸齒掃描，的高效薄層板，誤差會明顯降低

34、，采用雙波長鋸齒掃描，也能有效降低展開誤差。也能有效降低展開誤差。 定位誤差：定位誤差： 斑點的位置和大小判定，擴散、脫尾等斑點的位置和大小判定，擴散、脫尾等易產(chǎn)生定位誤差。檢測誤差來自光源的穩(wěn)定性、光檢易產(chǎn)生定位誤差。檢測誤差來自光源的穩(wěn)定性、光檢測器的穩(wěn)定性以及樣品對光吸收（或熒光產(chǎn)生）的線測器的穩(wěn)定性以及樣品對光吸收（或熒光產(chǎn)生）的線性度等方面。為減少這些誤差，需要非常精密的機電性度等方面。為減少這些誤差，需要非常精密的機電系統(tǒng)，這也直接導致產(chǎn)品高昂的價格。系統(tǒng)，這也直接導致產(chǎn)品高昂的價格。 通常情況下，薄層掃描分析的誤差可控制在通常情況下，薄層掃描分析的誤差可控制在3%以以下。下。 七

35、七 薄層色譜法在藥物分析中的應用薄層色譜法在藥物分析中的應用1 藥物與毒物的快速鑒定；藥物與毒物的快速鑒定；2 藥物的鑒別和純度檢查；藥物的鑒別和純度檢查；3 混合物質的分離和微量提純（包括異混合物質的分離和微量提純（包括異構體的分離）；構體的分離）；4 復方制劑的定性與定量分析；復方制劑的定性與定量分析；5 藥物及其制劑在制備和貯藏過程中的藥物及其制劑在制備和貯藏過程中的穩(wěn)定性考察，及有關質量的研究；穩(wěn)定性考察，及有關質量的研究；鹵菜中色素的鑒別鹵菜中色素的鑒別6 體液中藥物及其代謝物的分離分析；體液中藥物及其代謝物的分離分析；7 中草藥有效成分的分離、提純與研究；中草藥有效成分的分離、提純

36、與研究；8 化學藥物合成反應歷程的判斷與控制，及中間體的質化學藥物合成反應歷程的判斷與控制，及中間體的質量控制；量控制；9為一般柱色譜或高效液相色譜法選擇合適的分離條件；為一般柱色譜或高效液相色譜法選擇合適的分離條件；10 幫助判斷分析物質的化學結構以及用于物質幫助判斷分析物質的化學結構以及用于物質 相對分相對分子質量的測定。子質量的測定。11 etc.七七 薄層色譜法在藥物分析中的應用薄層色譜法在藥物分析中的應用 使用薄層色譜法分離綠葉的提取物（如使用薄層色譜法分離綠葉的提取物（如菠菜菠菜）的的7個階段。胡蘿卜素洗脫的速度很快因此只能個階段。胡蘿卜素洗脫的速度很快因此只能在第二步中看到。在第二步中看到。葉綠素葉綠素A和和B在最后一步的中在最后一步的中間位置，間位置，葉黃素葉黃素是保持黃色的第一個斑點。是保持黃色的第一個斑點。 從左到右：第從左到右：第1階段階段-第第7階段階段 黑墨水在黑墨水在TLC板上的分離板上的分離 第三節(jié)紙色譜法第三節(jié)紙色譜法一、紙色譜法的分離原理一、紙色譜法的分離原理 紙纖維為載體，吸著在其上的紙纖維為載體，吸著在其上的水為固定相水為固定相 屬于屬于正相分配色譜正相分配色譜 依據(jù)分