多藥耐藥基因的臨床意義與檢測方法

1、多藥耐藥基因的臨床意義與檢測方法1MDR 概念腫瘤細胞耐藥性可分為內(nèi)在性耐藥(intrin sic drug resista nee 和獲得性 耐藥(acquired drug resista nee 兩類，既原發(fā)地存在于某些腫瘤中， 稱內(nèi)在性 耐藥；繼發(fā)于化療后，稱獲得性耐藥。根據(jù)耐藥譜可分為原藥耐藥(primary drug resistance,PDR 和多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)。PDR 只對誘導(dǎo)原藥產(chǎn)生耐藥，而對其它藥物不 產(chǎn)生交叉耐藥。 而 MDR 是一種藥物誘發(fā)， 而同時對其它多種結(jié)構(gòu)和作用機 制完全不同抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥。內(nèi)在性耐藥原因仍不清

2、楚，而獲得性 耐藥是由于變異耐藥腫瘤細胞亞群過渡生長所致。內(nèi)在性耐藥與獲得性耐 藥作為一種獨特耐藥現(xiàn)象是成功地治療腫瘤關(guān)鍵性難題，因而成為近幾年 國內(nèi)外研究和探索熱點。2MDR 耐藥機制1970 年 Biedler 和 Riehm 首先描述了 MDR 表型：一種藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生耐 藥細胞株可用對其它多種化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能完全不同化療藥物產(chǎn)生耐藥。他 們發(fā)現(xiàn)對放線菌 D 耐藥細胞，同時也對多種抗腫瘤抗生素如柔紅霉素等， 以及結(jié)構(gòu)與作用機制迥異植物堿類抗腫瘤藥如長春新堿等交叉耐藥。 1976 年，Julia no 等最先在耐藥中國蒼鼠卵巢細胞中發(fā)現(xiàn)一種新與耐藥程度呈數(shù) 量關(guān)系高分子量細胞膜糖蛋白，命名為

3、P 糖蛋白(p-glycopratain,p-gp)。因其 分子量為 170kda,又名 pgp170，認為此蛋白可降低細胞膜對藥物通透性而 引起耐藥。后來又陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在不同來源多藥耐藥細胞中這種P 糖蛋白分子量范圍在 130180kda,主要集中在 150180kda,它由多藥耐藥基因 MDR編碼。近十幾年，國外已從耐藥腫瘤細胞株中分離出耐藥基因 MDR1 和它表達 P糖蛋白。1986 年 chen 等克隆了編碼 P 糖蛋白 cDNA :2。2.1MDR 基因家族在哺乳動物， MDR 基因是一較小相對保守基因家族。 在人類基因組中， 它含有兩個基因 MDR1 和 MDR2，在嚙齒類由三個基

4、因組成： MDR1 , MD R2，MDR3。2.2MDR 基因基因圖譜研究表明人類 MDR 兩種基因定位于第 7 號染色體 q21.1 帶 3 30kb中。含有 28 個外顯子，28 個外顯子序列與 cDNA 完全一致，cDNA 全長 4.5kb。在不同細胞系中 MDR1 啟動子顯示活性不同，其增加子活性亦 不同，因此 MDR1表達呈組織特異性。2.3MDR 基因表型MDR 基因表型是與其基因產(chǎn)物 P 糖蛋白有關(guān)。許多研究表明，MDR 表型表現(xiàn)為 MDR 基因過度表達伴有或不伴有基因擴增。 研究發(fā)現(xiàn)， 在耐藥 程度低耐藥細胞系，可無 MDR 基因擴增，只有 MDR 基因表達增加 （即 mR

5、NA 表達增加，P 糖蛋白功能增強）。此時低度耐藥細胞 P 糖蛋白功能增加是 由于 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平增高，而非基因拷貝增加所致。MDR 表型最突出特點是其編碼 P 糖蛋白功能增加而導(dǎo)致產(chǎn)生了多藥耐 藥性。因此 P 糖蛋白是 MDR 基因表型標志。2.4P 糖蛋白MDR 基因編碼 P 糖蛋白是分子量約為 170Kda 胞膜蛋白，由 1280 個氨 基酸組成，同源雙鏈，每條鏈有 6 個跨膜疏水區(qū)，其構(gòu)成三個跨膜孔有一 個細胞內(nèi)核苷糖連接點可能與 ATP 連接并發(fā)生水解作用。通常認為，P 糖 蛋白具有一種能量依耐跨膜藥物外輸泵功能，當腫瘤細胞與抗癌藥物接觸 時，脂溶性藥物濃度梯度進入細胞，而 P

6、糖蛋白則結(jié)合藥物分子，同時其 A TP 結(jié)合位點連上 ATP, ATP水解后釋放能量將藥物從胞內(nèi)泵出胞外，藥物 在胞內(nèi)濃度不斷下降，其細胞毒作用因而減弱甚至喪失，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。人類 MDR1 和 MDR2 兩種基因分別編碼了兩種結(jié)構(gòu)相似,功能不同 P 糖蛋白，MDR1 和 MDR2 兩種基因及其所編碼兩種 P 糖蛋白具有高度同源 性,其同源性達 80%,然而這兩種基因產(chǎn)物表達卻呈組織特異性而且有不 同生理功能。 MDR1表達產(chǎn)物可將親脂類化療藥泵出細胞外,因而有耐藥 特性； MDR2 表達產(chǎn)物則主要分布在骨骼肌纖維上,可將肌纖維代謝產(chǎn)物, 如激素等轉(zhuǎn)運到膜外,無轉(zhuǎn)運親脂類藥物功能,故不具多藥耐

7、藥性作用。然而在最近研究報告中這種基因仍然作為一個重要提示,即治療前髓性白 血病 B 細胞出現(xiàn)高表達 1。3在正常組織及腫瘤組織中 MDR1 基因表達3.1在正常組織中 MDR1 基因表達認識 P 糖蛋白在體內(nèi)正常表達進行和功能是重要。P 糖蛋白在正常人體 細胞內(nèi)也有表達，表明 MDR 基因并非異常基因，P 糖蛋白并非是一種異常 蛋白，而且具有一定生理功能。了解 MDR1 基因在正常組織中表達，具有 三個作用。（1）為了建立一個腫瘤中 MDR1 表達增加基線。 （2）增加我們關(guān)于 正常 P-gp 生理功能知識。 （3）更好了解在緩解人類腫瘤耐藥方面潛在作用。 正常組織中分為高、中、低三個表達水

8、平。腎上腺、腎臟高水平表達；肺、 肝、結(jié)腸、空腸、直腸中等表達；而皮膚、骨骼肌、心肌、脾、食道、胃、 卵巢、骨髓等則低表達或不表達。可以發(fā)現(xiàn) MDR1 表達主要是在具有分泌 和排泄功能器官組織特殊上皮細胞中，其功能為降低有害外源性物質(zhì)對細 胞損害，具有正常生理保護功能。維持血腦、血睪丸及血胎盤屏障（腦組織及睪丸組織血管內(nèi)皮細胞、胎盤滋養(yǎng)葉細胞 MDR1 基因表達水平高 ）。已有 報道 MDR 基因及其產(chǎn)物在正常細胞防御中起著不可忽略作用， 尤其是對化 學(xué)致癌物及化學(xué)毒素防御 1， 7， 4。3.2在實體腫瘤中 MDR1 基因表達如前所述，腫瘤細胞多藥耐藥性分為內(nèi)在性耐藥與獲得性耐藥兩類。 在腫

9、瘤細胞中，MDR1 表達與腫瘤細胞組織起源有關(guān)。 臨床研究發(fā)現(xiàn)， 實 體腫瘤中 MDR1基因表達分四組：第一組癌癥通常表達高水平 MDR1mRN A。大多數(shù)本組腫瘤正常組織中存在中間至高水平 P-gp 170 表達，如腎細 胞癌、結(jié)腸癌、肝細胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌、嗜絡(luò)細胞瘤等。臨床發(fā)現(xiàn)這些 腫瘤顯示出對治療不敏感性 （那就是說存在內(nèi)在性耐藥 ）。第二組所包括癌癥 偶然表達高水平 MDR1mRNA（ 中間 MDR1 表達水平 ）、如神經(jīng)母細胞瘤、 軟 組織肉瘤、乳腺癌，本組腫瘤趨向比第一組治療效果好，不幸是本組經(jīng)過 化療后常常得到獲得性耐藥。第三組所包括腫瘤罕見 MDR1mRNA 表達（幾 乎所有

10、都沒檢測到或低 MDR1 表達）如卵巢癌、食道癌、wilms 瘤、膀胱癌、 肺癌等。本組腫瘤通?；熤委熓怯行ВS多腫瘤通過藥物刺激將發(fā)展 為獲得性耐藥。第四組包括腫瘤經(jīng)過化療后 MDR1基因表達水平提高。3.3在惡性血液學(xué)方面檢測 MDR1 基因表達許多血液失調(diào)病人在治療過程中發(fā)展成為耐藥。由此 MDR 概念產(chǎn)生 研究白血病病人耐藥最大優(yōu)勢是不論治療前與治療后都很容易獲得腫瘤標 本，且不受腫瘤大小、存在部位和血管血流等非耐藥因素影響。因此與實 體腫瘤相比惡性血液病人 MDR1 表達數(shù)據(jù)是回歸性且經(jīng)過了化療治療。在正常血液細胞內(nèi) (全骨髓、 脾、純凈淋巴細胞 )發(fā)現(xiàn)低和非常低 MDR1 水平

11、表達。在幾乎所有類型白血病、多發(fā)性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤不 論治療或未經(jīng)治療病人都有 MDR1 水平增高報道， MDR1 水平可以在一個 由低到高范圍甚至在未治療病人中出現(xiàn)高水平表達。我們用非同位素原位 雜交方法檢測正常人骨髓 MDR1mRNA 表達陽性率低于 10%，強度為弱陽 性。惡性血液病在 MDR1 表達方面可以分為三個不同組。 第一組 MDR1 水 平通常在未治療前增高即內(nèi)在性耐藥腫瘤， 如 CML 在其復(fù)發(fā)期。 第二組為 未經(jīng)治療癌癥病人 MDR1 水平偶爾提高，如成人急性淋巴性白血病 (ALL) 、 成人急性非淋巴細胞白血病 (ANLL) 、何杰金氏淋巴瘤。第三組，在有些癌 癥

12、中經(jīng)治療復(fù)發(fā)時， MDR1 水平提高，包括 ALL 、ANLL 。在臨床急性白血病研究中發(fā)現(xiàn)， MDRImRNA 陽性組緩解率(CR)，明 顯低于 MDRImRNA 陰性組 CR,并且 MDRImRNA 陽性患者達到緩解而 需療程較MDR1 陰性患者長。有文獻報道 MDR1 基因表達陽性初治患者 C R 率為 27%60% :7,而 MDR1 基因表達陰性者 CR 率為 72%90%,說 明 MDR1 基因表達是導(dǎo)致誘導(dǎo)緩解失敗主要原因。4MDR1 基因表達研究臨床意義研究 MDR1 基因表達與臨床化療關(guān)系,是從分子水平而非細胞水平來 探討腫瘤對化療藥物敏感性與耐受性,可用來預(yù)測病人對化療反應(yīng)

13、以及化 療過程中療效判斷和監(jiān)測預(yù)后,可望使腫瘤在更高水平上進行治療和觀察, 使化療個體化,臨床醫(yī)生可根據(jù)每個病人 MDR1 表達水平判斷耐藥程度, 合理地制定化療方案,具體來講 2：(1)預(yù)測病人對化療藥物敏感性與耐 受性,有針對性地選擇最有效藥物,避免盲目用藥,減少不必要毒副作用。(2) 化療過程中,若 MDR1 表達逐漸增高,要注意獲得性多藥耐藥性發(fā)生, 及時調(diào)整化療方案。 (3)在未進行化療前, MDR1 即顯高表達,表示存在內(nèi) 在性多藥耐藥性，可考慮使用 MDR 逆轉(zhuǎn)劑配合抗癌藥物化療。 (4)預(yù)測腫 瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后。 (5)在研究中評價 MDR 逆轉(zhuǎn)藥物療效。與 MDR1 基因相

14、關(guān)化療藥物包括 (1) 烷化劑類。 (2)植物堿類抗腫瘤藥。(3) 抗腫瘤抗生素類。 (4)激素類等。通常為分子量大親脂類化合物。與 MD R1基因無關(guān)化療藥物包括(1)抗代謝類藥物，如 5-氟脲嘧啶等。(2)鉑類化合 物如順鉑等 2， 5。由于 MDR 相關(guān)化療藥物包括了常用抗癌藥絕大部分，可供 MDR1 高 表達病人選擇使用抗癌藥所剩無幾。如何克服 ?目前研究方向之一是選擇逆 轉(zhuǎn)劑。所謂逆轉(zhuǎn)劑機理是，逆轉(zhuǎn)劑能與耐藥細胞表面P 糖蛋白結(jié)合，競爭性抑制 P 糖蛋白與化療藥物結(jié)合，阻止化療藥物從細胞內(nèi)流出，從而提高 細胞內(nèi)化療藥物濃度，增強化療效果。(圖 1B)目前發(fā)現(xiàn)可逆轉(zhuǎn) MDR 藥物包 括

15、(1)鈣通道阻滯劑；如異博定。 (2)鈣調(diào)蛋白拮抗劑：如環(huán)胞菌素 A 等。 (3) 抗心律失常藥：如潘生丁，心得安等。目前主要用于臨床是異博定 (VRP) 和環(huán)胞霉素 A(CSA) ，但都存在一定毒副作用。如果還存在其它耐藥機制則 影響逆轉(zhuǎn)效果。5MDR 檢測方法 隨著分子生物學(xué)發(fā)展，檢測手段不斷增加。目前主要從分子水平、蛋 白水平、細胞水平多途徑展開了研究。5.1 分子水平 由于人腫瘤細胞幾乎不存在 MDR1DNA 擴增，因此，無法 檢測 DNA變化，主要是檢測 MDR1mRNA 表達水平。常用方法包括： RT- PCR、原位雜交(ISH)、Slot-blot(SB)、Northern bl

16、ot(NB)、RNase 保護實驗 等12。5.2 蛋白水平 免疫組織化學(xué)法(IHC)，免疫熒光等。常用 P-gp 特異性單 克隆抗體有 JSB-1、 MRK1 、 C219、 U12、 HYB-612 等，不同單抗識別不同 抗原決定簇，每種單抗特異性和親合力不完全相同。5.3細胞水平 檢測細胞藥物輸出功能，采用熒光染料如若丹明 -123 或具 有天然熒光柔紅霉素與細胞共同培養(yǎng)后，用熒光分光度計測定單個細胞內(nèi) 藥物濃度，與對照組比較判定細胞耐藥程度。最近國外使用流式細胞儀， 高分析技術(shù)(掃描激光和聚焦顯微鏡)等先進設(shè)備對 P-gp 進行功能檢測。Pi wneca-Worns 等描述一個人造 r

17、 散射锝洛合物 hexakis 99MTC SESTAMI BI 對 P-gp170 進行功能圖象分析。99MTC SESTAMIBI 是一脂性具有放 射性藥物性陽離子其可被多藥轉(zhuǎn)移機制主動轉(zhuǎn)導(dǎo)。這項技術(shù)通過有價值 r 散射性99MTC 進行 P-gp170 功能測試，是一個新穎快速測定人體內(nèi)腫 瘤細胞 P-gp170 表達方法。以上各種方法，各有優(yōu)缺點。綜合評價： (1)敏感性， PCRISHPGP SB、NB 及細胞功能測定。(2)特異性，PCR、ISHPGPSB、NB 及細胞功 能測定2，12。目前 MDR1 基因檢測強調(diào)標準實驗重要性。要求標準實驗為：既要有 足夠靈敏性以檢測小體積樣本

18、中 MDR1 基因表達，并且能定量且能區(qū)別出 正常組織表達還是腫瘤組織表達。要想達到該標準，幾種實驗組合會給臨 床提供更確切信息。且參與實驗室須規(guī)范標準化報告及進行質(zhì)量控制 1， 7。由于上面介紹這些檢測技術(shù)不論是在靈敏性方面還是特異性方面都不 可避免地受到一因素限制。這些因素導(dǎo)致我們不論是對正常組織還是惡性 腫瘤組織 MDR方面檢測都出現(xiàn)相互矛盾結(jié)果。 當然抗腫瘤藥物耐藥過程復(fù) 雜性，及一些外在其它因素如腫瘤組織變異，其它耐藥機制存在和低水平 MDR 標志表達等因素都會導(dǎo)致一些相互矛盾結(jié)果。 還有以前治療因素影響 MDR 表型及實驗時間不適當?shù)纫蛩囟紩?dǎo)致 MDR 表達與引起化療困難結(jié) 果不

19、一致。要解決這些問題我們還有大量工作要做。作者單位：張真路 (430050 武漢市漢陽鐵路中心醫(yī)院病理科 ) 吳人亮 (同濟醫(yī)科大學(xué)病理教研室 )參考文獻：1sglke van der Heyden.P-Glycoprotein:clinical significance and Met hodsof Analysis.CIinical Laboratory Scienee, 1995, 32(3): 221 2642柏珊，多藥耐藥基因與腫瘤化療、白血病現(xiàn)代分型 .中國抗癌協(xié)會 腫瘤標志委員會, 1995, 89 923蘇慧慈,原位雜交 .北京:中國技術(shù)出版社, 1994, 592294Cor

20、don-Cardo,et al.Expression of Multidrug Resistance Gene Product(P-Glycoprotein)in Human Normal and Tumor Tissuse.The Journeal ofHistochemistry a nd Cytochemistry, 1990, 38(9): 1277 12875K Nooter,et al Multidrug resistance(mdr)genesin human cancer.Br JCancer, 1991,63, 663 6696Kayuga Endo,et al Multid

21、rug Resistance-AssociatedProtein Express ionin Clinical Gastric Carcinoma CANCER,1996,77: 168116877Robert J Arceit.Clinical Significance of P-Glycoprotein in Multidr ugResistance Malignacies Blood,1993,81: 221522228FoJo,et al.Expression of a multidrug gene in human tumor and tissues.Medical Science,

22、1987,84:265 2699 JEAE-PIERRE MARIE , et al Multidrug Resistance(MDR)Gene E xpressionin Acute Non Lymphoblastic Leukemia:Sequential Analysis.Leuk emia andLymphoma, 1992,8:262 26510Hiroshi Kanamaru,et al MDR1 RNA Levels in Human Renal Cel lCarcinomas:Correlation With Grade and Prediction of Reversal o

23、f Doxor ubicinResistance by Quinidine in Tumor Explants.Joumal of the National CancerInstitute, 1989, 81(11)11Kazuya Endo,et al.Multidrug Resistance-AssociatedProtei n Expression in Clinical Gastric Carcinoma.CANCER Supplement 1996,77: 16811 68712N.A.Brophy,et al.Mdrl Gene Expression in Childhood Ac

24、ute Lymphoblastic Leukemias and Lymphomas:A Critical Evaluation by Four Techniques.LEUKEMIA.1994 , 2: 327 33513PRAMILA RAMANI , et al.EXPRESSION OF mdr1/P-GLYCOPROTEIN AND p110 IN NEUROBLASTOMA.JOURNAL OF PATHOLOGY,1995,175: 13 2214Daniel.Multidrug Resistance(MDR1)in Leukemia:Is it Time to Test?Bloo

25、d, 1992,295 29815William T.Beck Multidrug Resistance and its Circumvmtion.EUr JCancer, 1990,26(4): 51351516Shinn-Liang Lai,et al.MDR1 Gene Expression in Lung Cancer.J o f theNational Cancer Inst 1989,181(15): 11441150 17 R.BROWN GENE AMPLIFICATION AND DRUG RESISTANCE. J ofPathol, 1991,163,28729218Je

26、an Bourhis,et al.Correlation of MDR1 Gene Expression With Chemotherapy in Neuroblastoma.J Natl Cancer Inst, 1989,81(18): 140114 0519Jean-PierreMarie,et al Multidrug Resistance(mdr1) Gene Expressio n inAdult Acute Leukemias:Correlation With Treatrnent Outcome and In Vitro DrugSensitivity.Blood,1991,7

27、8(3): 58659220Goldstein et al.Expression of a Multidrug Resistance Gene in Hu manCancers.J Natl Cancer Inst, 1989,81:11612421Ding-Wu Shen,et al.In Situ Hybridization Analysis of Acquistition andLoss of the Human Multidrug-Resistance Gene.CANCER RESEASE,1988,48:4334433922Kathleen W,et al.Afplificatio

28、n and Expression of Genes Associate d andExpression of Genes Associated with Multidrug Resistance in Mam malianCells.SCIENCE,1986,232:75175423Bethesda.Clinical Trials of Agents That Reverse Multidrug-Resistance.J Clinical Oncology, 1989,7:40941124Rik J.Scheper.Overexpressionof a Mr 110,000 Vesicular

29、 Protein i nNon-P-Glycoprotein-mediated Multidrug Resistance.CNCER RESRARC H, 1993,53:1 475 147925D.Russo,et al.Coexpression of Anionic Glutathione-S-Transferase(GSTn)and Multidrug Resistance(mdrl) Genes in Acute Myeloid and Lymp hoidLeukemias.LEUKEMIA,1994,8:881 88426Akira Nakagawara, et al.Inverse Correlation between Expression ofMultidrug Resistance Gene and N-myc Oncogene in Human