第六章 外源基因的表達(dá)1

1、遺傳信息從遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)到蛋白質(zhì)的傳遞過程的傳遞過程中心法則中心法則（central dogma）。）。 基因表達(dá)：基因表達(dá)： 克隆基因的表達(dá)：克隆基因的表達(dá)：外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。外源基因外源基因表達(dá)載體表達(dá)載體重組載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中在宿主細(xì)胞中 表達(dá)出蛋白質(zhì)表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白提取蛋白宿主細(xì)胞：宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。 最佳的基因表達(dá)體系最佳的基因表達(dá)體系： 目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高、表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定、目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高、表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定、生物活性高和表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。生物活性高和表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化

2、。1 基因表達(dá)的機(jī)制基因表達(dá)的機(jī)制2 基因表達(dá)的調(diào)控元件基因表達(dá)的調(diào)控元件3 外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)4 基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)和分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)和分離純化1 基因表達(dá)的機(jī)制基因表達(dá)的機(jī)制1.1 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄外源基因的起始轉(zhuǎn)錄1.2 mRNA的延伸和穩(wěn)定性的延伸和穩(wěn)定性1.3 外源基因外源基因mRNA的有效翻譯的有效翻譯1.4 表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性1.5 目的基因沉默目的基因沉默1.1 外源基因的外源基因的起始轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄 外源基因在宿主細(xì)胞中有效表達(dá)是基因工程的外源基因在宿主細(xì)胞中有效表達(dá)是基因工程的核心問題核心問題 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表

3、達(dá)的外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟。 轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟限速步驟。 選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)表達(dá)選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問題。系統(tǒng)首先要考慮的問題。原核生物原核生物啟動(dòng)子啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：組成型啟動(dòng)子：組成型啟動(dòng)子：如如lac、trp、PR、 PL、 tac等的啟動(dòng)子等的啟動(dòng)子如如T7噬菌體的啟動(dòng)噬菌體的啟動(dòng)子子真核生物啟動(dòng)子也可分為誘導(dǎo)型和組成型等類型。真核生物啟動(dòng)子也可分為誘導(dǎo)型和組成型等類型。1.2 mRNA的延伸與穩(wěn)定的延伸與穩(wěn)定外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，

4、保持外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有效延伸、終止的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵。一方面，要防止因轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異性終止而誘一方面，要防止因轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異性終止而誘發(fā)的發(fā)的mRNA轉(zhuǎn)錄提前終止的現(xiàn)象；轉(zhuǎn)錄提前終止的現(xiàn)象；另一方面，又要存在正常的轉(zhuǎn)錄終止序列以防止產(chǎn)生不另一方面，又要存在正常的轉(zhuǎn)錄終止序列以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使mRNA的長(zhǎng)度限制在一定的范圍內(nèi)，從的長(zhǎng)度限制在一定的范圍內(nèi)，從而增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。而增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。 mRNA的穩(wěn)定性直接決定翻譯產(chǎn)物的多少。的穩(wěn)定性直接決定

5、翻譯產(chǎn)物的多少。對(duì)對(duì)原核細(xì)胞原核細(xì)胞來說，最佳的方法是選擇一個(gè)來說，最佳的方法是選擇一個(gè)RNase缺失的受體菌。缺失的受體菌。真核細(xì)胞真核細(xì)胞來說，則需要考慮增加來說，則需要考慮增加mRNA的正的正確加工，提高成熟確加工，提高成熟mRNA的穩(wěn)定性。的穩(wěn)定性。1 基因表達(dá)的機(jī)制基因表達(dá)的機(jī)制1.1 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄外源基因的起始轉(zhuǎn)錄1.2 mRNA的延伸和穩(wěn)定性的延伸和穩(wěn)定性1.3 外源基因外源基因mRNA的有效翻譯的有效翻譯1.4 表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性1.5 目的基因沉默目的基因沉默1.3 外源基因外源基因mRNA的有效翻譯的有效翻譯外源基因外源基因mRNA有效翻

6、譯必須考慮的基本原則：有效翻譯必須考慮的基本原則：AUG(ATG)是首選的起始密碼子。是首選的起始密碼子。SD序列為與核糖體序列為與核糖體16S rRNA互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序列至少含有列至少含有AGGAGG序列中的序列中的4個(gè)堿基。個(gè)堿基。SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為序列與翻譯起始密碼子之間的距離為39個(gè)堿基。個(gè)堿基。在翻譯起始區(qū)周圍序列不易形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在翻譯起始區(qū)周圍序列不易形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 真核細(xì)胞真核細(xì)胞mRNA的的5非翻譯區(qū)含有共同的序列非翻譯區(qū)含有共同的序列5 -CCA（G）CCATGG- 3。不同基因組使用密碼子具有選擇性。不同基因組使用密碼

7、子具有選擇性。主密碼子（主密碼子（major codon）稀有密碼子（稀有密碼子（rare codon）如果外源基因如果外源基因mRNA的主密碼子與受體細(xì)胞的主密碼子與受體細(xì)胞基因組的主密碼子相同或接近，則該基因表達(dá)的基因組的主密碼子相同或接近，則該基因表達(dá)的效率就高；效率就高；反之，若外源基因含有較多的稀有密碼子，反之，若外源基因含有較多的稀有密碼子，其表達(dá)效率就低。其表達(dá)效率就低。1 基因表達(dá)的機(jī)制基因表達(dá)的機(jī)制1.1 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄外源基因的起始轉(zhuǎn)錄1.2 mRNA的延伸和穩(wěn)定性的延伸和穩(wěn)定性1.3 外源基因外源基因mRNA的有效翻譯的有效翻譯1.4 表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性表達(dá)蛋白

8、在細(xì)胞中的穩(wěn)定性1.5 目的基因沉默目的基因沉默1.4 表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性 外源基因的表達(dá)產(chǎn)物能否在宿主細(xì)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物能否在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定積累而不被內(nèi)源蛋白水解酶所水胞中穩(wěn)定積累而不被內(nèi)源蛋白水解酶所水解是基因有效表達(dá)的一個(gè)重要因素。解是基因有效表達(dá)的一個(gè)重要因素。 （1）構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)。）構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)。 （2） 構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)。構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)。 （3）構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)。）構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)。 （4）選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)）選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)。1 基因表達(dá)的機(jī)制基因表達(dá)的機(jī)制1.1 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄外

9、源基因的起始轉(zhuǎn)錄1.2 mRNA的延伸和穩(wěn)定性的延伸和穩(wěn)定性1.3 外源基外源基mRNA的有效翻譯的有效翻譯1.4 表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性1.5 目的基因沉默目的基因沉默1.5 目的基因沉默目的基因沉默基因沉默的基因沉默的作用機(jī)制作用機(jī)制位置效應(yīng)的基因沉默：位置效應(yīng)的基因沉默：轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默：轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默：基因沉默（基因沉默（gene silencing）是導(dǎo)致外源基因不能正是導(dǎo)致外源基因不能正常表達(dá)的重要因素。常表達(dá)的重要因素。n共抑制（共抑制（cosuppression）是轉(zhuǎn)錄后水平的基因是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默

10、的一種，指被整合的外源基因沉默的同時(shí)，沉默的一種，指被整合的外源基因沉默的同時(shí)，與其同源的內(nèi)源與其同源的內(nèi)源DNA的表達(dá)也受到抑制。的表達(dá)也受到抑制。1 基因表達(dá)的機(jī)制基因表達(dá)的機(jī)制2 基因表達(dá)的調(diào)控元件基因表達(dá)的調(diào)控元件3 外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)4 基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)和分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)和分離純化2 基因表達(dá)的調(diào)控元件基因表達(dá)的調(diào)控元件2.1 啟動(dòng)子啟動(dòng)子2.2 增強(qiáng)子增強(qiáng)子2.3 終止子終止子2.4 衰減子衰減子2.5 絕緣子絕緣子2.6 反義子反義子2.1 啟動(dòng)子啟動(dòng)子啟動(dòng)子（啟動(dòng)子（promoter）：）：是一段提供是一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合聚合酶識(shí)別和結(jié)合的的

11、DNA序列，它位于基因的上游。序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶正是通過聚合酶正是通過與它的結(jié)合而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。與它的結(jié)合而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。*啟動(dòng)子的特征啟動(dòng)子的特征序列特異性序列特異性方向性方向性位置特性位置特性種屬特異性種屬特異性TTGACATATAAT轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)53-35-1016-19 bp5-9 bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45原核生物的PromoterRNA pol IITFIIDTAFs TBP Pol III 啟啟 動(dòng)動(dòng) 子子 TFIIIB TFIIIC TBP RNA pol III Pol I 啟啟 動(dòng)動(dòng) 子子 RN

12、A pol I SL1 UBF1 TBP Pol II 啟啟 動(dòng)動(dòng) 子子 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) TATA 2 基因表達(dá)的調(diào)控元件基因表達(dá)的調(diào)控元件2.1 啟動(dòng)子啟動(dòng)子2.2 增強(qiáng)子增強(qiáng)子2.3 終止子終止子2.4 衰減子衰減子2.5 絕緣子絕緣子2.6 反義子反義子 2.2 增強(qiáng)子增強(qiáng)子增強(qiáng)子（增強(qiáng)子（enhancer）：是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的：是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列，又稱順式作用序列，又稱強(qiáng)化子強(qiáng)化子。v增強(qiáng)子的特性：增強(qiáng)子的特性：雙向性。雙向性。重復(fù)序列。重復(fù)序列。增強(qiáng)子行使功能與所處的位置無關(guān)。增強(qiáng)子行使功能與所處的位置無關(guān)。特異性。特異性。增強(qiáng)子不僅與同源基因

13、相連時(shí)有調(diào)控功能，與異源增強(qiáng)子不僅與同源基因相連時(shí)有調(diào)控功能，與異源基因相連時(shí)也有功能?；蛳噙B時(shí)也有功能。2 基因表達(dá)的調(diào)控元件基因表達(dá)的調(diào)控元件2.1 啟動(dòng)子啟動(dòng)子2.2 增強(qiáng)子增強(qiáng)子2.3 終止子終止子2.4 衰減子衰減子2.5 絕緣子絕緣子2.6 反義子反義子2.3 終止子終止子本征終止子：本征終止子：不需要其他蛋白輔助因子便可在特殊的不需要其他蛋白輔助因子便可在特殊的RNA結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)實(shí)現(xiàn)終止作用。結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)實(shí)現(xiàn)終止作用。依賴終止信號(hào)的終止子：依賴終止信號(hào)的終止子：要依賴專一的蛋白質(zhì)輔助因子。要依賴專一的蛋白質(zhì)輔助因子。2.4 衰減子衰減子 衰減子（衰減子（attenuator）是位于是位

14、于mRNA分子前導(dǎo)序列中的分子前導(dǎo)序列中的一段控制蛋白質(zhì)合成起始速率的調(diào)節(jié)區(qū)，亦即發(fā)生弱化一段控制蛋白質(zhì)合成起始速率的調(diào)節(jié)區(qū)，亦即發(fā)生弱化作用的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列，又稱作用的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列，又稱弱化子弱化子。 鄰氨基苯 吲哚甘油 色氨酸合成酶 甲酸合成酶 硼酸合成酶 TrpE terpD trpC trpB trpA t t 啟動(dòng)子 操縱基因 前導(dǎo)順序 衰減子 pppN26AUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAGGUUGGUGGCGCACUUCCUGAN43A UUUUUUUU 富含G-C的發(fā) G C Leader peptide 夾結(jié)構(gòu) / 富含 C G U的單鏈末端 C G Aaa

15、aaa C G Met Lys Aly Ile Phe Val Leu Lys Gly Trp Trp Arg Thr Ser A G C C G A C G U U A A 圖16-28 trp 操縱子含有5 個(gè)結(jié)構(gòu)基因和1 個(gè)控制區(qū)?？刂茀^(qū)由啟動(dòng)子、操縱基因、前導(dǎo)順序和衰減子構(gòu)成。前導(dǎo)區(qū)編碼14個(gè)氨基酸，其中有2個(gè)是色氨酸。(仿B.Lewin:GENES,1997, Fig .12.38) 弱化子弱化子色氨酸濃度高時(shí)色氨酸濃度高時(shí)色氨酸濃度低時(shí)色氨酸濃度低時(shí)2.5 絕緣子絕緣子絕緣子（絕緣子（insulator）：）：既是基因表達(dá)的調(diào)控元件，也是一種邊界元件；既是基因表達(dá)的調(diào)控元件，也是一

16、種邊界元件；它能阻止鄰近的調(diào)控元件對(duì)其所界定基因的啟動(dòng)子起增強(qiáng)它能阻止鄰近的調(diào)控元件對(duì)其所界定基因的啟動(dòng)子起增強(qiáng)或抑制作用；或抑制作用； 2.6 反義子反義子反義反義RNA（antisence RNA）：同某種天然：同某種天然mRNA反向互補(bǔ)的反向互補(bǔ)的RNA分子稱為反義分子稱為反義RNA。反義子反義子：編碼反義：編碼反義RNA的的DNA稱為反義子。稱為反義子。反義子在反義子在DNA的的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯三個(gè)水平對(duì)基因的表達(dá)三個(gè)水平對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用，其中以對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制最為普遍。起調(diào)節(jié)作用，其中以對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制最為普遍。n反義反義RNA作為作為的作用機(jī)制：的作用機(jī)制

17、： 與與mRNA上核糖體上核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，使結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，使得翻譯不能起始；得翻譯不能起始； 與與mRNA形成雙螺形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，作為內(nèi)切旋結(jié)構(gòu)，作為內(nèi)切酶底物；酶底物； 與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄提前終止使轉(zhuǎn)錄提前終止。1 基因表達(dá)的機(jī)制基因表達(dá)的機(jī)制2 基因表達(dá)的調(diào)控元件基因表達(dá)的調(diào)控元件3 外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)4 基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)和分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)和分離純化 3 外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)：外源基因表達(dá)系統(tǒng)：泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物

18、合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）。（目的蛋白）。外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)載體基因表達(dá)載體受體細(xì)胞受體細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)系統(tǒng)原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：如大腸桿菌表達(dá)如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。統(tǒng)、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：如酵母表達(dá)系如酵母表達(dá)系統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。 3.1 大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌基因表

19、達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌大腸桿菌革蘭氏陰性細(xì)菌；革蘭氏陰性細(xì)菌；目目前應(yīng)用最廣泛的基因表達(dá)系統(tǒng)。前應(yīng)用最廣泛的基因表達(dá)系統(tǒng)。v大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性：大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)越性：掌握了大腸桿菌基礎(chǔ)生物學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等方面的掌握了大腸桿菌基礎(chǔ)生物學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等方面的背景知識(shí)，特別是對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻了解；背景知識(shí)，特別是對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻了解；大腸桿菌已被發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各大腸桿菌已被發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體系列；類適用的寄主菌株和不同類型的載體系列；實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，許多克隆的真核基因

20、，都可以在大腸桿菌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，許多克隆的真核基因，都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效的、高水平的表達(dá)；中實(shí)現(xiàn)有效的、高水平的表達(dá)；大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化批大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。量生產(chǎn)。3.1.1 大腸桿菌基因表達(dá)載體大腸桿菌基因表達(dá)載體3.1.2 宿主菌宿主菌3.1.3 常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)3.1.4 外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式3.1.5 外源基因的高效表達(dá)策略外源基因的高效表達(dá)策略3.1.1 大腸桿菌基因表達(dá)載體大腸桿菌基因表達(dá)載體大腸桿菌基因表達(dá)載體可分為大腸桿菌基

21、因表達(dá)載體可分為3個(gè)系統(tǒng)：個(gè)系統(tǒng)：DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)（1）DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng) 復(fù)制子復(fù)制子常見的常見的復(fù)制子復(fù)制子pMB1、p15A、ColE1: 松弛復(fù)制型松弛復(fù)制型，每，每細(xì)胞質(zhì)?？截悢?shù)細(xì)胞質(zhì)?？截悢?shù)1020個(gè)。個(gè)。pSC101: 嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制型嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制型，每細(xì)胞質(zhì)?？截悢?shù)，每細(xì)胞質(zhì)?？截悢?shù)少于少于5個(gè)。個(gè)。選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記絕大多數(shù)的質(zhì)粒載體都是使用絕大多數(shù)的質(zhì)粒載體都是使用抗菌素抗性記號(hào)抗菌素抗性記號(hào)，多為，多為氨氨芐青霉素抗性芐青霉素抗性、四環(huán)

22、素抗性四環(huán)素抗性、鏈霉素抗性鏈霉素抗性、氯霉素抗性氯霉素抗性以及以及卡那霉素抗性卡那霉素抗性等。等。原因：原因：許多質(zhì)粒本身帶有抗菌素抗性基因的抗藥性許多質(zhì)粒本身帶有抗菌素抗性基因的抗藥性R因子；因子；抗菌素抗性記號(hào)具有便于操作、易于選擇等優(yōu)點(diǎn)。抗菌素抗性記號(hào)具有便于操作、易于選擇等優(yōu)點(diǎn)。大腸桿菌基因表達(dá)載體的大腸桿菌基因表達(dá)載體的3個(gè)系統(tǒng)：個(gè)系統(tǒng)：DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)（2）外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)）外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)包括包括啟動(dòng)子啟動(dòng)子 和和轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子。啟動(dòng)子和終止子因宿

23、主的不同而有差別，在不同的宿啟動(dòng)子和終止子因宿主的不同而有差別，在不同的宿主中表達(dá)效率也不一樣，特別是原核生物和真核生物宿主主中表達(dá)效率也不一樣，特別是原核生物和真核生物宿主間完全不同，相互間不能通用。間完全不同，相互間不能通用。啟動(dòng)子啟動(dòng)子外源目的基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。選擇外源目的基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。選擇可調(diào)控的可調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子是構(gòu)建一個(gè)理想的表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的是構(gòu)建一個(gè)理想的表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問題。問題。P tac = 3 P trp = 11 P lac啟動(dòng)子啟動(dòng)子-35 區(qū)序列區(qū)序列-10 區(qū)序列區(qū)序列 P lacT T T A C A T A

24、 T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P l lLT T G A C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子 一方面，它使轉(zhuǎn)錄在目的基因之后立即停止，避免多余的一方面，它使轉(zhuǎn)錄在目的基因之后立即停止，避免多余的轉(zhuǎn)錄以節(jié)省宿主內(nèi)轉(zhuǎn)錄以節(jié)省宿主內(nèi)RNA的合成底物，提高目的基因的轉(zhuǎn)的合成底物，提高目的基因的轉(zhuǎn)錄量；錄量； 另一方面，正常轉(zhuǎn)錄終止子的存在能夠防止產(chǎn)生不必要的另一方

25、面，正常轉(zhuǎn)錄終止子的存在能夠防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，有效地控制目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，有效地控制目的基因mRNA的長(zhǎng)度，提高的長(zhǎng)度，提高mRNA的穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上其它基因的異常表達(dá)。的穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上其它基因的異常表達(dá)。大腸桿菌基因表達(dá)載體可分為大腸桿菌基因表達(dá)載體可分為3個(gè)系統(tǒng)：個(gè)系統(tǒng)：DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)（3）蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)）蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)在原核生物中影響翻譯起始的因素有：在原核生物中影響翻譯起始的因素有：起始密碼子、核起始密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）、起始

26、密碼子于序列）、起始密碼子于SD序列之間的距序列之間的距離和堿基組成、離和堿基組成、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、的二級(jí)結(jié)構(gòu)、mRNA上游的上游的5端非翻端非翻譯序列和蛋白編碼區(qū)的譯序列和蛋白編碼區(qū)的5端序列等。端序列等。蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）序列）翻譯起始密碼子翻譯起始密碼子翻譯終止密碼子翻譯終止密碼子核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS） SD序列序列與核糖體與核糖體16S rRNA特異配對(duì)而與宿主核糖體結(jié)合，特異配對(duì)而與宿主核糖體結(jié)合，它對(duì)它對(duì)mRNA的翻譯起著決定性的作用。的翻譯起著決定性的作用。大腸桿菌大腸桿菌SD序列的堿基組成、與起始密碼

27、子之間的距離序列的堿基組成、與起始密碼子之間的距離和堿基組成對(duì)保證準(zhǔn)確和高效翻譯很重要。和堿基組成對(duì)保證準(zhǔn)確和高效翻譯很重要。 SDmRNA 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCA翻譯起始密碼子翻譯起始密碼子AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）翻譯終止密碼子翻譯終止密碼子翻譯終止密碼子與核糖體相遇時(shí)，能使核糖體從翻譯終止密碼子與核糖體相遇時(shí)，能使核糖體從mRNA模模板上脫落下來，終止蛋白質(zhì)的翻譯過程。板上脫落下來，終止蛋白質(zhì)的翻譯過程。在實(shí)際應(yīng)用中，為了保證翻譯的有效終止，通常將幾個(gè)終在實(shí)際應(yīng)用中，為了保證翻譯的有效終止，通常將幾個(gè)終止密碼串連在一起。止密碼串連

28、在一起。 UAAU作為作為終止密碼終止密碼，可有效地終止多，可有效地終止多肽鏈的合成。肽鏈的合成。主要密碼子和稀有密碼子主要密碼子和稀有密碼子如果外源目的基因如果外源目的基因mRNA的主密碼子和受體細(xì)胞基因組的主密碼子和受體細(xì)胞基因組的主密碼子相同或接近，則該基因的表達(dá)效率就高；反之，的主密碼子相同或接近，則該基因的表達(dá)效率就高；反之，若外源基因含有較多的稀有密碼子，其表達(dá)水平就低。若外源基因含有較多的稀有密碼子，其表達(dá)水平就低。因此，在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時(shí)，要考慮所表達(dá)基因因此，在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時(shí)，要考慮所表達(dá)基因的種類和性質(zhì)，或?qū)ν庠椿虻膲A基進(jìn)行適當(dāng)置換，或?qū)Φ姆N類和性質(zhì)，或?qū)ν?/p>

29、源基因的堿基進(jìn)行適當(dāng)置換，或?qū)寺≥d體上的調(diào)控序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。克隆載體上的調(diào)控序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。3.1.1 大腸桿菌基因表達(dá)載體大腸桿菌基因表達(dá)載體3.1.2 宿主菌宿主菌3.1.3 常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)3.1.4 外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式3.1.5 外源基因的高效表達(dá)策略外源基因的高效表達(dá)策略3.1.2 宿主菌宿主菌 外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)會(huì)造成異源蛋白在細(xì)胞外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)會(huì)造成異源蛋白在細(xì)胞內(nèi)大量積累，而異源蛋白易被細(xì)胞內(nèi)的酶所降解。內(nèi)大量積累，而異源蛋白易被細(xì)胞內(nèi)的酶所降解。其主要原因是：其主要原因是： *

30、 大腸桿菌缺乏針對(duì)異源重組蛋白的折疊復(fù)性和翻譯后加大腸桿菌缺乏針對(duì)異源重組蛋白的折疊復(fù)性和翻譯后加工系統(tǒng)；工系統(tǒng)； * 不具備真核生物細(xì)胞完善的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及眾多基因表達(dá)不具備真核生物細(xì)胞完善的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及眾多基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定因子；產(chǎn)物的穩(wěn)定因子； * 高效表達(dá)的異源重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成高濃度微環(huán)境，高效表達(dá)的異源重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成高濃度微環(huán)境，增強(qiáng)蛋白分子相互作用。增強(qiáng)蛋白分子相互作用。常見的大腸桿菌基因表達(dá)受體菌株常見的大腸桿菌基因表達(dá)受體菌株3.1.1 大腸桿菌基因表達(dá)載體大腸桿菌基因表達(dá)載體3.1.2 宿主菌宿主菌3.1.3 常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)3.1.4 外

31、源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式3.1.5 外源基因的高效表達(dá)策略外源基因的高效表達(dá)策略3.1.3 常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)Lac和和Tac表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)：以：以lac操縱子調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)設(shè)操縱子調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。計(jì)和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。PL和和PR表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)：以：以噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子PL和和PR構(gòu)建的。構(gòu)建的。T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)：利用大腸桿菌：利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元件構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，它具有很高的表達(dá)能力。件構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，它具有很高的表達(dá)能力。3.1.1 大腸桿菌基因表達(dá)載體大腸

32、桿菌基因表達(dá)載體3.1.2 宿主菌宿主菌3.1.3 常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)3.1.4 外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式3.1.5 外源基因的高效表達(dá)策略外源基因的高效表達(dá)策略3.1.4 外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式 （1）包涵體型異源蛋白）包涵體型異源蛋白 （2）融合蛋白）融合蛋白 （3） 分泌蛋白分泌蛋白 （4）寡聚型外源蛋白）寡聚型外源蛋白 （5）整合型外源蛋白）整合型外源蛋白 3.1.4 外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式A）包涵體型異源蛋白）包涵體型異源蛋白 包涵體：包涵體：在一定條件下，外

33、源基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞在一定條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中累積，致密地積聚在細(xì)胞內(nèi)或被膜包裹或形成無膜裸中累積，致密地積聚在細(xì)胞內(nèi)或被膜包裹或形成無膜裸露的結(jié)構(gòu)。露的結(jié)構(gòu)。 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有正確的氨基酸序列，但空間結(jié)構(gòu)是錯(cuò)具有正確的氨基酸序列，但空間結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，無生物學(xué)活性。誤的，無生物學(xué)活性。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化了外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化程序。簡(jiǎn)化了外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化程序。B）融合型異源蛋白）融合型異源蛋白融合蛋白：外源蛋白基因和受體菌自身蛋白基因重組融合蛋白：外源蛋白基因和受體菌自身蛋白基因重組在一起，不改變兩個(gè)基因閱讀框。在一起，不改變兩個(gè)基因閱讀框。 受體菌蛋白位

34、于受體菌蛋白位于N端，外源蛋白在端，外源蛋白在C端。端。 特點(diǎn)特點(diǎn)：受體菌蛋白與異源蛋白形成良好的雜合構(gòu)象，受體菌蛋白與異源蛋白形成良好的雜合構(gòu)象，使得多肽鏈上的蛋白酶切位點(diǎn)隱藏在蛋白分子內(nèi)部而使得多肽鏈上的蛋白酶切位點(diǎn)隱藏在蛋白分子內(nèi)部而不易被切割，因而大大增加了產(chǎn)物的穩(wěn)定性。不易被切割，因而大大增加了產(chǎn)物的穩(wěn)定性。C）寡聚型異源蛋白寡聚型異源蛋白 在構(gòu)建外源蛋白表達(dá)載體時(shí)，將多個(gè)外源目的蛋白基因串在構(gòu)建外源蛋白表達(dá)載體時(shí)，將多個(gè)外源目的蛋白基因串連在一起，克隆在質(zhì)粒載體上，以這種方式表達(dá)的外源蛋連在一起，克隆在質(zhì)粒載體上，以這種方式表達(dá)的外源蛋白稱為白稱為寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白。多表

35、達(dá)單元重組：多表達(dá)單元重組：每個(gè)表達(dá)單元都含獨(dú)立的啟動(dòng)子、終止子、每個(gè)表達(dá)單元都含獨(dú)立的啟動(dòng)子、終止子、SD序列、序列、起始密碼和終止密碼，形成獨(dú)立轉(zhuǎn)錄與串連翻譯的表達(dá)單元。該方式適合起始密碼和終止密碼，形成獨(dú)立轉(zhuǎn)錄與串連翻譯的表達(dá)單元。該方式適合表達(dá)表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量較大相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白。的蛋白。多順反子重組多順反子重組：多拷貝外源基因有各自的多拷貝外源基因有各自的SD序列、翻譯起始和終止信序列、翻譯起始和終止信號(hào)，但轉(zhuǎn)錄是在共同的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子控制下進(jìn)行的，表達(dá)的外源蛋號(hào)，但轉(zhuǎn)錄是在共同的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子控制下進(jìn)行的，表達(dá)的外源蛋白分子是相互獨(dú)立的。該方式適合表達(dá)白分子是相互獨(dú)立

36、的。該方式適合表達(dá)中等大小分子量中等大小分子量的外源蛋白。的外源蛋白。多編碼序列重組多編碼序列重組：將多個(gè)外源基因串連在一起，利用同一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控將多個(gè)外源基因串連在一起，利用同一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、翻譯起始與終止密碼子，在各編碼序列的接口引入蛋白酶酶切位點(diǎn)元件、翻譯起始與終止密碼子，在各編碼序列的接口引入蛋白酶酶切位點(diǎn)或可被化學(xué)斷裂的位點(diǎn)。該方式特別適合表達(dá)外源或可被化學(xué)斷裂的位點(diǎn)。該方式特別適合表達(dá)外源小分子小分子蛋白或多肽。蛋白或多肽。D）整合型異源蛋白）整合型異源蛋白n 將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的非必需編非必需編碼區(qū)碼區(qū)上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)

37、定上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳，以此種方式表達(dá)的外源蛋白即為地遺傳，以此種方式表達(dá)的外源蛋白即為整合整合型外源蛋白型外源蛋白。外源基因與宿主染色體整合是根據(jù)外源基因與宿主染色體整合是根據(jù)DNA同源交同源交換的原理換的原理 E）分泌型蛋白）分泌型蛋白n將分泌型蛋白的信號(hào)肽編碼序列與外源基因?qū)⒎置谛偷鞍椎男盘?hào)肽編碼序列與外源基因拼接，使異源蛋白表達(dá)后分泌到細(xì)胞周質(zhì)中拼接，使異源蛋白表達(dá)后分泌到細(xì)胞周質(zhì)中或直接進(jìn)入到培養(yǎng)基中?；蛑苯舆M(jìn)入到培養(yǎng)基中。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：增大表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，簡(jiǎn)化后續(xù)的分增大表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，簡(jiǎn)化后續(xù)的分離純化步驟離純化步驟3.1.1 大腸桿菌基因表達(dá)載體大腸桿

38、菌基因表達(dá)載體3.1.2 宿主菌宿主菌3.1.3 常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)3.1.4 外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式3.1.5 外源基因的高效表達(dá)策略外源基因的高效表達(dá)策略3.1.5 外源基因的高效表達(dá)策略外源基因的高效表達(dá)策略n優(yōu)化表達(dá)載體：高效啟動(dòng)子優(yōu)化表達(dá)載體：高效啟動(dòng)子n提高稀有密碼子提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)的表達(dá)n提高提高mRNA穩(wěn)定性穩(wěn)定性n提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性n優(yōu)化發(fā)酵過程優(yōu)化發(fā)酵過程 3 外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)系統(tǒng)原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿

39、菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng) 藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng) 植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。1 基因表達(dá)的機(jī)制基因表達(dá)的機(jī)制2 基因表達(dá)的調(diào)控元件基因表達(dá)的調(diào)控元件3 外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)4 基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)和分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)和分離純化4.1 基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)4.2 基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化4.1 基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)

40、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)的過程就是對(duì)特異性外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)的過程就是對(duì)特異性mRNA或蛋或蛋白質(zhì)的檢測(cè)。白質(zhì)的檢測(cè)。檢測(cè)特異性檢測(cè)特異性mRNA的方法的方法Northern雜交法雜交法檢測(cè)特異性蛋白質(zhì)的方法檢測(cè)特異性蛋白質(zhì)的方法生化反應(yīng)檢測(cè)法生化反應(yīng)檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法免疫學(xué)檢測(cè)法生物學(xué)活性檢測(cè)法生物學(xué)活性檢測(cè)法當(dāng)轉(zhuǎn)化的外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物沒有可供直接檢測(cè)的性質(zhì)時(shí)，可當(dāng)轉(zhuǎn)化的外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物沒有可供直接檢測(cè)的性質(zhì)時(shí)，可把外源基因與標(biāo)記基因或報(bào)告基因一起構(gòu)成嵌合基因，通過檢測(cè)把外源基因與標(biāo)記基因或報(bào)告基因一起構(gòu)成嵌合基因，通過檢測(cè)嵌合基因中的標(biāo)記基因或報(bào)告基因間接確定外源目的

41、基因的存在嵌合基因中的標(biāo)記基因或報(bào)告基因間接確定外源目的基因的存在和表達(dá)。和表達(dá)。4.1.1 外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)Northern雜交雜交4.1.2 報(bào)告基因的酶法檢測(cè)：報(bào)告基因的酶法檢測(cè)： -葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（gus基因）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基基因）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（因（cat基因）、冠癭堿合成酶基因、抗卡那霉素基因基因）、冠癭堿合成酶基因、抗卡那霉素基因（npt-基因）等?；颍┑取?.1.3 免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)免疫沉淀法免疫沉淀法酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法Western印跡法印跡法固相放射免疫法固相放射免疫法4.1.4 表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性

42、檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測(cè)4.1 基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)4.2 基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物分離純化的步驟：基因表達(dá)產(chǎn)物分離純化的步驟：細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎離心分離離心分離柱層析柱層析電泳電泳4.2.1 細(xì)胞的破碎細(xì)胞的破碎對(duì)于進(jìn)行分泌型表達(dá)的細(xì)胞來說，這一步可以省略。對(duì)對(duì)于進(jìn)行分泌型表達(dá)的細(xì)胞來說，這一步可以省略。對(duì)于非分泌型表達(dá)的細(xì)胞可采用不同的細(xì)胞破碎方法。于非分泌型表達(dá)的細(xì)胞可采用不同的細(xì)胞破碎方法。常見的細(xì)胞破碎方式常見的細(xì)胞破碎方式變性劑裂解法變性劑裂解法超聲波破碎法超聲波破碎法機(jī)械破碎法機(jī)械破碎法酶裂解法酶裂解法4.2.2 離心離心離心力一般

43、在數(shù)萬離心力一般在數(shù)萬g范圍以內(nèi)，主要用來去除范圍以內(nèi)，主要用來去除未破碎的細(xì)胞和細(xì)胞壁碎片等；未破碎的細(xì)胞和細(xì)胞壁碎片等；高速離心：高速離心：超速離心：超速離心：離心力一般離心力一般100,000g以上，可用來去除細(xì)胞膜以上，可用來去除細(xì)胞膜碎片等高分子復(fù)合物。碎片等高分子復(fù)合物。v附：離心力和轉(zhuǎn)速的換算公式：附：離心力和轉(zhuǎn)速的換算公式：RCF=11.18(N/1000)2rRCF：相對(duì)離心力相對(duì)離心力，單位為重力加速度，單位為重力加速度gN：轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)速度（轉(zhuǎn)速）轉(zhuǎn)頭旋轉(zhuǎn)速度（轉(zhuǎn)速），用，用r/min表示表示r：轉(zhuǎn)頭半徑轉(zhuǎn)頭半徑，為離心管中軸底部?jī)?nèi)壁到離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心的距離，單位為，為離心管中軸底部?jī)?nèi)壁到離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心的距離，單位為厘米（厘米（cm）4.2.3 特異性表達(dá)蛋白的初步分離特異性表達(dá)蛋白的初步分離沉淀法：沉淀法：超濾濃縮法：超濾濃縮法：根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同而進(jìn)行初步根據(jù)蛋