第11章熒光分析法

1、2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 綠色熒光蛋白（綠色熒光蛋白（GFP）green fluorescence protein 科學(xué)家在線形蟲(chóng)體內(nèi)植入綠色熒光蛋白質(zhì)科學(xué)家在線形蟲(chóng)體內(nèi)植入綠色熒光蛋白質(zhì)GFP標(biāo)記的微管標(biāo)記的微管熒光與熒光分析法熒光與熒光分析法（fluorescene and fluorometry)fluorescene and fluorometry)v熒光熒光（fluorescene):fluorescene): 物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。發(fā)態(tài)的最低能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。v熒光分析法（熒光分析

2、法（fluorometry)fluorometry)： 根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法。選擇性好，靈物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法。選擇性好，靈敏度高，檢測(cè)限達(dá)敏度高，檢測(cè)限達(dá)1010-10-10g/ml,g/ml,甚至甚至1010-12-12g/mlg/ml。電子能級(jí)的多重態(tài)電子能級(jí)的多重態(tài) 電子能級(jí)的多重度：電子能級(jí)的多重度：M=2S+1 S S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0(0或或1)1)M=1，單重態(tài)，用，單重態(tài)，用S表示（表示（single state）M3，三重態(tài)，用，三重態(tài)，用T表示（表示（triple

3、t state） 能能量量單重基態(tài)單重基態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)激發(fā)三重態(tài)禁阻躍遷禁阻躍遷S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換l l 2體系間跨越體系間跨越振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑的能量傳遞途徑傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷輻射躍遷熒光熒光內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換 外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換體系間跨越體系間跨越振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷無(wú)輻射躍遷 激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大。發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大。熒光：熒光：10-710 -9 s,

4、 第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài)磷光：磷光：10-410s， 第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài)磷光磷光 激發(fā)光譜與熒光光譜激發(fā)光譜與熒光光譜 excitation spectrum and fluorescence spectrum1.1.熒光熒光( (磷光磷光) )的的激發(fā)光譜激發(fā)光譜： 固定測(cè)量波長(zhǎng)固定測(cè)量波長(zhǎng), ,化合物發(fā)射的熒光化合物發(fā)射的熒光( (磷光磷光) )強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。2.熒光熒光( (磷光磷光) )的的發(fā)射光譜發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(zhǎng)固定激發(fā)光波長(zhǎng), , 化合物發(fā)射的熒光

5、化合物發(fā)射的熒光( (或磷光強(qiáng)度或磷光強(qiáng)度) )與發(fā)射光波與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線。長(zhǎng)關(guān)系曲線。nmF200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜GFP的激發(fā)光譜與熒光光譜的激發(fā)光譜與熒光光譜激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系1.Stokes1.Stokes位移位移 熒光發(fā)射波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)的現(xiàn)象。熒光發(fā)射波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)的現(xiàn)象。內(nèi)轉(zhuǎn)換和內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫是主要原因。振動(dòng)弛豫是主要原因。 2. .發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) 電

6、子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量量, ,產(chǎn)生不同吸收帶，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生一個(gè)發(fā)射帶。低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生一個(gè)發(fā)射帶。 3. .鏡像關(guān)系鏡像關(guān)系 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜成鏡像對(duì)稱通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜成鏡像對(duì)稱關(guān)系。關(guān)系。 nm蒽的激發(fā)光譜（虛線）和熒光光譜（實(shí)線）蒽的激發(fā)光譜（虛線）和熒光光譜（實(shí)線）200250300350400450500 nmFS0S1*V=0V=1V=2V=0V=1V=2b0b1b2c2c1c0 E2 E1 E2

7、 E1b0c0b1b2c1c2鏡像關(guān)系鏡像關(guān)系解釋示意解釋示意熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件1. 具有強(qiáng)的可見(jiàn)紫外吸收具有強(qiáng)的可見(jiàn)紫外吸收(長(zhǎng)共軛分子）長(zhǎng)共軛分子）2. 具有一定的熒光效率（具有一定的熒光效率（ f）（剛性平面分子）（剛性平面分子）吸收激發(fā)光的光子數(shù)吸收激發(fā)光的光子數(shù)發(fā)射熒光的光子數(shù)發(fā)射熒光的光子數(shù)f長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu) 苯苯 萘萘 蒽蒽l lex 205nm 286nm 356nml lem 278nm 321nm 404nm f 0.11 0.29 0.36CH2OCOCH3維生素維生素A A l

8、lex327nm， l lem510nm 剛性平面結(jié)構(gòu)剛性平面結(jié)構(gòu)可降低化學(xué)鍵可降低化學(xué)鍵的旋轉(zhuǎn)，增加共軛的旋轉(zhuǎn)，增加共軛健的共平面性，使健的共平面性，使熒光效率增加。如熒光效率增加。如熒光素和酚酞有相熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。卻沒(méi)有。取代基取代基v第一類：增加分子的第一類：增加分子的 電子共軛程度，電子共軛程度，使熒光效率提高，熒光波長(zhǎng)增長(zhǎng)。如使熒光效率提高，熒光波長(zhǎng)增長(zhǎng)。如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-CN。v第二類：減弱分子的第二類：減弱分子的 電子共軛程度，使熒電子共軛程度，使熒光減弱甚至熄滅。如：光減弱甚至熄滅

9、。如：-COOH、-NO2、-CO、-X、-NO、-SH。v第三類：第三類： 對(duì)對(duì) 電子共軛作用較小，對(duì)熒光的電子共軛作用較小，對(duì)熒光的影響不明顯。如：影響不明顯。如：-R、-SO3H、-NH3+。熒光試劑熒光試劑 能與弱熒光物質(zhì)或無(wú)機(jī)離子反應(yīng)生能與弱熒光物質(zhì)或無(wú)機(jī)離子反應(yīng)生成強(qiáng)熒光物質(zhì)的試劑。可擴(kuò)大熒光分析成強(qiáng)熒光物質(zhì)的試劑?？蓴U(kuò)大熒光分析法的應(yīng)用范圍。法的應(yīng)用范圍。v熒光胺：測(cè)定脂肪伯胺和芳香伯胺。熒光胺：測(cè)定脂肪伯胺和芳香伯胺。v鄰苯二甲醛（鄰苯二甲醛（OPA）：測(cè)定伯胺、）：測(cè)定伯胺、-氨基酸。氨基酸。v丹酰氯丹酰氯:測(cè)定含有伯、仲胺基及酚基的生物堿測(cè)定含有伯、仲胺基及酚基的生物堿v測(cè)

10、定無(wú)機(jī)離子的熒光試劑測(cè)定無(wú)機(jī)離子的熒光試劑影響熒光強(qiáng)度的外部因素影響熒光強(qiáng)度的外部因素1.1.溫度溫度 熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，熒光效率降低。熒光效率降低。2.2.溶劑溶劑 溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成、粘度都將溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成、粘度都將使化合物的熒光發(fā)生變化。極性、粘度增強(qiáng)，熒光使化合物的熒光發(fā)生變化。極性、粘度增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，強(qiáng)度增加。波長(zhǎng)長(zhǎng)移，強(qiáng)度增加。3.3.酸度酸度 對(duì)酸堿化合物，溶液對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格的影響較大，需要嚴(yán)格控制。不同熒光物質(zhì)有其最適宜的控制。不同熒光物質(zhì)有其最適宜的pH值范圍。值范

11、圍。影響熒光強(qiáng)度的外部因素影響熒光強(qiáng)度的外部因素4.熒光熄滅劑：重金屬離子、鹵素離子、熒光熄滅劑：重金屬離子、鹵素離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。羰基和羧基化合物。5.散射光：注意溶劑的拉曼散射的影響。散射光：注意溶劑的拉曼散射的影響。瑞利光（瑞利光（Reyleigh scattering light)Reyleigh scattering light)拉曼光拉曼光(Raman scattering light)(Raman scattering light)波長(zhǎng)比入射光更長(zhǎng)的拉曼光波長(zhǎng)比入射光更長(zhǎng)的拉曼光 ，對(duì)熒光測(cè)定的，對(duì)熒光測(cè)定的干

12、擾更大。干擾更大。 aba：硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光：硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光b：0.1mol/L硫酸溶液在不同波長(zhǎng)下的拉曼散射光硫酸溶液在不同波長(zhǎng)下的拉曼散射光溶液的熒光測(cè)定溶液的熒光測(cè)定入射光入射光 I0透射光透射光 I熒光熒光 F F定量依據(jù)定量依據(jù) 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 F正比于吸收的光強(qiáng)度正比于吸收的光強(qiáng)度Ia和熒光量子效率和熒光量子效率 ： F = KIa 由朗伯由朗伯-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- cl ) F = K I0(1-10- cl ) = K I0(1-e-2.3 cl ) 濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：

13、F = 2.3 K I0 cl = Kc注意：當(dāng)注意：當(dāng) cl 0.05時(shí)，時(shí)，F(xiàn)與與C不成正比。不成正比。定量分析方法定量分析方法v校正曲線法校正曲線法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，分別測(cè)定系列中各配制標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，分別測(cè)定系列中各溶液的熒光強(qiáng)度溶液的熒光強(qiáng)度F F，作校正曲線，作校正曲線F-CF-C圖，根據(jù)圖，根據(jù)待測(cè)溶液的待測(cè)溶液的F Fx x值，在圖中求出待測(cè)液的值，在圖中求出待測(cè)液的C Cx x。若若空白溶液的熒光強(qiáng)度不能校正到空白溶液的熒光強(qiáng)度不能校正到0 0，則須作，則須作（F-FF-F0 0）-C-C圖。圖。定量分析方法定量分析方法v比例法比例法0000FFFFCCCCFFFFsxsxxs

14、xsv聯(lián)立方程法聯(lián)立方程法熒光計(jì)熒光計(jì)光光 源源第一單色器第一單色器或?yàn)V光片或?yàn)V光片樣品池樣品池檢測(cè)器檢測(cè)器第二單色器第二單色器或?yàn)V光片或?yàn)V光片記錄儀記錄儀激發(fā)激發(fā)熒光熒光v濾光片熒光計(jì)v濾光片-單色器熒光計(jì)v熒光分光光度計(jì)氙燈氙燈高壓汞燈高壓汞燈染料激光染料激光器器光電光電倍增管倍增管熒光法應(yīng)用熒光法應(yīng)用1.無(wú)機(jī)化合物的分析無(wú)機(jī)化合物的分析 與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定； 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定； 鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定； 鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定 熒光法應(yīng)用熒光法應(yīng)用2. 有機(jī)化合物的熒光分析有機(jī)化合物的熒光分析 熒光分析法主要應(yīng)用于有機(jī)物、生化熒光分析法主要應(yīng)用于有機(jī)物、生化物質(zhì)、藥物的測(cè)定（物質(zhì)、藥物的測(cè)定（200多種），包括：多種），包括：有機(jī)化合物有機(jī)化合物如：多環(huán)胺類、萘酚類、吲哚類、多環(huán)如：多環(huán)