Western_Blot過(guò)程步驟詳解_百度文庫(kù)(精)

1、BEIJING DINGGUO GHANGSHENG BIOTECHNOLOGYWester n Blot詳解(原理、分類(lèi)、試劑、步驟及問(wèn)題解答Western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行 檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物， 可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。本文主要通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)詳細(xì)地介紹一下Western Blot技術(shù)：一、 原理二、 分類(lèi)i.放射自顯影ii.底物化學(xué)發(fā)光ECLECFiv.底物DAB呈色三、 主要試劑四、 主要步驟五、 實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)的問(wèn)題指南1.參考書(shū)推薦2.針對(duì)樣品的常見(jiàn)問(wèn)題3.抗體oMMGEJ北京

2、鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司CO. , LTD4.濾紙、膠和膜的問(wèn)題5. Marker的相關(guān)疑問(wèn)6.染色的選擇7.參照的疑問(wèn)8.緩沖液配方的常見(jiàn)問(wèn)題9.條件的摸索10.方法的介紹11.結(jié)果分析北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. LTD與Southern或Northern雜交方法類(lèi)似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，探針”是抗體，顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià) 鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的

3、多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載 體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的 第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。、分類(lèi)原理現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用 第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買(mǎi)現(xiàn)成的試劑盒就 行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下(二抗用HRP標(biāo)記)：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯 米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。三、主要試劑1、 丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺， 應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙

4、稀酰胺 的 去離子水配制含有29%(w/v丙稀酰胺和1%(w/vN，N-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀 酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，力卩H2O至100ml。儲(chǔ)于棕色瓶，4C避 光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過(guò)7.0,因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過(guò)兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過(guò)濾。2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v0.1gSDS,1mlH2O去離子水配制，室溫保存。3、 分離膠緩沖液：1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8:18.15gTris和48ml1mol/LHCL混 合，加水稀釋到100ml終體積。過(guò)濾后40C保存。4、 濃縮

5、膠緩沖液：0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8:6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過(guò)濾后40C保存。這 兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL。北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO- LTD5、TEMED原溶液N，N，N N四甲基乙二胺催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。10%(w/v過(guò)硫酸胺溶 液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水

6、配制數(shù)ml，臨用前配制.6、SDS-PAGE加樣緩沖液：pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml,10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml,0.05%溴酚藍(lán)1.6ml,H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20- 25ul，總蛋白量100 yg7、Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS， 用蒸餾水溶解 至1000ml， 得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。8、 轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱(chēng)取2.9g甘氨酸、

7、5.8gTris堿、0.37g SDS,并加入200ml甲醇，加水至總量1L。9、麗春紅染液儲(chǔ)存液：麗春紅S 2g三氯乙酸30g磺基水楊酸30g加水至100ml用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。10、 脫脂奶粉5%（w/v。11、NaN3 0.02%疊氮鈉（有毒，戴手套操作，溶于磷酸緩沖鹽溶液（PBS。12、Tris緩沖鹽溶液（TBS:20mmol/LTris/HCL（pH7.5，500mmol/LnaCI。13、Tween20（15鼠抗人-MMP-9（16鼠抗人-TIMP-1。14、 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。15、NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml。

8、16、BCIP（溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml。17、100mmol/LTris-HCL（pH9.5。18、100mmol/L NaCl。19、50mmol/LTris-HCL（pH7.5，5mmol/L EDTA。（可以參看分子克?。┧摹⒅饕襟E主要包括以下4個(gè)基本步驟北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. LTD1.樣品制備原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。1培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。2棄培 養(yǎng)基, 用1

9、X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培 養(yǎng)基。3.加入1X SDS樣品緩沖液（6-well plate, 100或I7W cm2 plate, 5001000卩1/瓶，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。4.超聲1015秒剪切DNA以減低樣品粘性。5.煮沸樣品5 minutes。6.離心12000g, 5 mi n,取上清。7.電泳分離：上樣15卩l(xiāng)20至lSDS-PAGE膠（10 cm x 10 cm電泳。如要定 量檢測(cè)某蛋白的表達(dá)水平，應(yīng)用RIPA裂解液（1 ml per 107 cells/ 100 mm dish/ 150 cm2 flask裂解細(xì)胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混

10、勻415mi n，14000g離心15min（4C），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋 白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常 用beta-act in。注意：一般上樣2030卩已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量至100g但電泳條帶易拖尾，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測(cè)方法。2.電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法）3.轉(zhuǎn)膜北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)BEIJING DINGGUQ CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY任公司CO. , LTD雜交膜的選擇是決定Wester n blot成敗的重要環(huán)節(jié)。

11、應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜（NC和PVDF膜。NC膜是蛋白 印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋 白質(zhì)會(huì)與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用 下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來(lái)。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑 的NC膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常 用0.45 yn和0.2叩兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45卩曲勺膜，小于20kD的蛋白就要用0.2卩惱勺膜了，如用

12、0.45卩謚勺膜就會(huì)發(fā)生“Blowthrough的現(xiàn) 象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高， 非常適合于低分子量 蛋白的檢測(cè)。 但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。蛋白質(zhì)常 用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而 后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。1.將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10mi n。注意：如檢測(cè)小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠2.依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘。3.裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿?3層濾紙？膠

13、？膜?3層濾紙？海綿，每層放好后，用 試管趕去氣泡。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。4.將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對(duì)黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插 上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝 配正確，電源是否接通。北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. , LTD5.轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜4.免疫雜交與顯色1.用25 ml TBS洗膜5min，室溫，搖動(dòng)。2置膜于25 ml封閉緩沖液中1h,室溫，搖動(dòng)。3.15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。4.加入合

14、適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4C過(guò)夜，緩慢搖動(dòng)。5.15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的二 抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)。7.15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。8.15 ml TBS洗1次。9蛋白檢測(cè)（顯色法或發(fā)光法，按相應(yīng)試劑說(shuō)明操作0注意事項(xiàng):1操作中戴手套，不要用手觸膜。2. PVDF膜在甲醇中浸泡時(shí)間不要超過(guò)5秒。3.如檢測(cè)小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2卩価勺膜，并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。4.某些抗原和抗體可被Tween-20洗脫，此時(shí)可用1.0% BSA代替Tween-20。5.關(guān)于封閉劑

15、的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS:能和某些抗原相互作用，掩蓋 抗北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. LTD體結(jié)合能力；0.33% BSA in PBS:低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。6.如用0. 1% Tween 20 0.02% NaN 3 in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋 液，抗體檢測(cè)后可進(jìn)行蛋白染色。如要同時(shí)檢測(cè)大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。五、實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)的問(wèn)題指南根據(jù)問(wèn)題的類(lèi)型主要分成以下幾類(lèi)（以下資料權(quán)作參考，請(qǐng)勿盲目模仿?。?.參考書(shū)推薦A.對(duì)初學(xué)者看什么資料比較好?解答

16、：抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南和Antibodies（a laboratory manual wrote by Ed Harlow,david lane）兩本書(shū)不錯(cuò)。2.針對(duì)樣品的常見(jiàn)問(wèn)題B.做線粒體膜UCP2蛋白的Wester n Blot（以下簡(jiǎn)寫(xiě)成Wester n Blot），提取 線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑） ， 用的博士德的一抗， 開(kāi)始還有點(diǎn)痕跡， 現(xiàn)在 越來(lái)越差， 上樣量已加到120g換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？ 蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？解答： 懷疑是樣品問(wèn)題， 可能是：1,樣品不能反復(fù)凍融；2,樣品未加蛋白酶 抑制劑。 同時(shí)， 建議檢查WesternBlot

17、過(guò)程，提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制 劑來(lái)說(shuō)，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。E.同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Wester n Blot檢測(cè)嗎？解答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。F.如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時(shí)最好加上BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOfiY CO- LTDNaF去抑制磷酸化酶的活性。G.我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn) 只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條

18、帶都在， 只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？解答：你可以加大上樣量，沒(méi)有問(wèn)題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí) 多加5-10%甲醇。H.想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合 積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？解260kd的蛋白不好做， 分離膠用6%，Stacking Gel 3.5%。I.如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來(lái) 弱的條帶能看清楚。解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。 一般地，超載30%是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也 要

19、，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的comb。J.蛋白變性后可以存放多久?解答：-80C,兩年沒(méi)有問(wèn)題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要 被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了。K.我所測(cè)定的蛋白分子量是105KD，按理說(shuō)分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但我所查 資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方，不知為何？解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05KD的蛋白在上述兩種膠 的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。L.接下來(lái)我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù)，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是 親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5%的脫脂奶粉呢？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)

20、影響親和素生物素的生成，是嗎？北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. . LTD間,適?答:解答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼兀肂SA代替應(yīng)該好一 點(diǎn).M.還有一問(wèn)題，一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān) 系嗎？解答：Western Blot般上樣30100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上 樣量、一二抗的量和撫育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開(kāi)始摸條件時(shí)， 為了拿到陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來(lái)了。 要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不

21、好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng) 然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。N.做組織樣品的western的時(shí)候，處理樣品有什么訣竅嗎？還有，您用過(guò)大牛血清做封閉劑嗎？濃度如何？效果是不是比BSA好一點(diǎn)？解答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分， 膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心。還有 一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和 蛋白酶抑制劑cocktail），封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗 體，使用BSA也是不錯(cuò)的選擇。O.您是否可以介紹一下大分子量蛋白2

22、00KD，在做western要注意什么呢？ 解答：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠最好選擇7%的；剝膠時(shí)要 小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。P.有什么方法可以提高上樣量？解答：可以濃縮樣品；增大上樣體積來(lái)增大上樣量。Q.我要檢測(cè)的目的蛋白是分子量大概為42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以 不用到超速離心機(jī)，有沒(méi)有直接用低溫高速離心機(jī)就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffero北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司川科國(guó)BEIJING D1

23、NGGUO CHANGSHENG B10TECHN0L0GY CO- LTD提取膜蛋白和胞漿蛋白，用這個(gè)做Western Blot就可以了。如果是非要只提取 膜蛋白就要用到超速離心機(jī)。42kd不算大，也不算小，所以，可以按照一般的轉(zhuǎn) 移方法實(shí)施。R.蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求？解答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定，如果要求是定量和半定量的WesternBlot則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超過(guò)0.3卩g/mm2S.一抗，二抗的比例是否重要？解答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。3.抗體做細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，要做磷酸化某因子We

24、stern Blot，其二抗有何要求？解答：對(duì)二抗無(wú)要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗。U.同一公司的另外抗體用這個(gè)稀釋度做出來(lái)效果很好，所以沒(méi)做預(yù)試，怕費(fèi) 時(shí)間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，一抗孵育也是過(guò)夜的，若封閉也過(guò)夜的話就要四天才看的到結(jié)果了。解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最佳的抗體稀釋度也是不一樣 的，需要你實(shí)驗(yàn)摸索。我覺(jué)得轉(zhuǎn)膜過(guò)夜好像沒(méi)有必要吧，轉(zhuǎn)膜的目的也就是將蛋白應(yīng)用最廣的一種固相支持物，價(jià)格最便宜；PVDF膜介于二者之間轉(zhuǎn)到膜上就行啦，何必浪費(fèi)時(shí)間呢。至于具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間，還要看你的目的蛋白分 子量的大?。?/p>

25、轉(zhuǎn)膜的設(shè)備，是半干式，還是濕式。一抗當(dāng)然可以過(guò)夜，如果你想所 短Western Blot時(shí)間的話，可以增高一抗的孵育溫度，我們實(shí)驗(yàn)室一般37度，兩小時(shí)就足夠了；你可以參照抗體說(shuō)明書(shū)。至于一抗和二抗得稀釋度，你可以一抗1:1500;二抗1：20000試試。另外建議你洗膜時(shí)，多洗幾次，最好是在封閉；一 抗和二抗后至少是5x5min，跑一張好膜不容易，多盡點(diǎn)心吧，這樣不會(huì)浪費(fèi)你的 時(shí)間，只會(huì)節(jié)省你的時(shí)間！O鼻科田北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING D1NGGUQ CHANQSHENG B10TECHN0L0GY CO. . LTDV.免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

26、解答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱(chēng)表位），有 些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和 煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果 你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組 化。一般抗體說(shuō)明書(shū)上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）W.Wester n Blot中抗體的重復(fù)應(yīng)用問(wèn)題解答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù) 使用2-3次。稀釋后應(yīng)在2-3天內(nèi)使用，4度

27、保存，避免反復(fù)凍融。4.濾紙、膠和膜的問(wèn)題X. NC膜 PVDF膜尼龍膜怎樣鑒別？解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類(lèi)型；硝酸纖維素膜是目前就結(jié)合能力而言：尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)480600卩g/cm2可結(jié) 合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)80100卩g/cm2對(duì)于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強(qiáng)；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)125300卩g/cm2就溫度適應(yīng)性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可 與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印

28、跡。就韌性而言：尼龍膜較強(qiáng)；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強(qiáng)。就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針?lè)肿涌山?jīng)堿變性被 洗脫下來(lái)；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；PVDF膜可以重復(fù)使用。北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. LTDY.在做Western Blot時(shí)，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。乙檢測(cè)磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？解答：可以

29、。AA.轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端（即點(diǎn)樣空的一 側(cè)）的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？解答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢，你延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分 子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡BB.我想問(wèn)您裂解細(xì)胞用三去污裂解法，還是用上樣緩沖液?解答：用上樣緩沖液，這樣有幾個(gè)好處，可以提取總蛋白，同時(shí)又可以讓磷酸 化酶失活。CC.采用tank system有什么講究？解答：建議低電壓，長(zhǎng)時(shí)間，（一般tank System用衡壓好點(diǎn)），如28V 1416hrs。DD.做HSP WESTEN定量，同樣的抗體免疫組化能做出，而WESTEN卻不 能？解答：這多半是抗體的問(wèn)題，

30、要看抗體的說(shuō)明，是否能做Western Blot和IHC。EE.膜一般要如何處理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。FF.如果是6 8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗?解答：一抗的稀釋度是有說(shuō)明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的 膜孵育體積一般最少為35ml。北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. LTDGG.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果。解答：無(wú)要求。HH.跑電泳的時(shí)候配的膠總是 縮”是什么原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？解答：沒(méi)什么問(wèn)題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過(guò)夜時(shí)拿保鮮膜包起來(lái)，在 里面加點(diǎn)水保持濕度就

31、可以了。如果過(guò)夜，膠里的水分被蒸發(fā)，采用保鮮膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問(wèn)題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換 的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避免找問(wèn)題麻煩。脫色液中甲醇的含量太高 也會(huì)造成膠縮。II.膜、濾紙、膠大小有何講究?解答：如果是用的是半干轉(zhuǎn)，順序?yàn)椋宏帢O濾紙膠膜濾紙。濾紙的長(zhǎng)寬分別比膠小12mm，而膜的長(zhǎng)寬分別比膠大12mm。絕對(duì)禁忌:上下兩層濾紙因?yàn)檫^(guò)大而相互接觸，這樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過(guò)膠和濾紙。JJ.蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎?解答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，

32、12%SDS-PAge,濕轉(zhuǎn)36V，35hrs就可以了， 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào) 節(jié)；170kd用7%SDSpage，48V 10hrs16hrs。KK.不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決?解答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）（優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩 沖液，可以參考蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可 延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu) 質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠， 如低至6%。太大時(shí)還

33、可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓/電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí) 間。北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. . LTDLL.如何選擇最合適的蛋白雜交膜?解答：蛋白質(zhì)印跡雜交是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中極為常用的一門(mén)技術(shù)。選擇質(zhì)量上 層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)成敗的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)雜交方 案、被轉(zhuǎn)移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜 的材質(zhì)、孔徑和規(guī)格上都要做出合理的選擇。硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物。在低離子轉(zhuǎn) 移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與硝酸纖維

34、素膜發(fā)生疏水作用而高 親和力的結(jié)合在一起，雖然這其中的機(jī)制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜的 這個(gè)特性，而且易于封閉非特異性結(jié)合，從而得到了廣泛的應(yīng)用。在非離子型的去 污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來(lái)。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選 擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié) 合就越牢固。但是膜孔徑如果小于0.1mm，蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行了。因此，我 們通常用0.45 mn 0.2叩兩種規(guī)格的硝酸纖維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45卩伯勺膜，小于20kD的蛋白就要用0.2卩価勺膜了，如果用0.45卩謚勺膜就會(huì)發(fā) 生“Blowthro卩gh現(xiàn)象。從

35、膜的質(zhì)地上來(lái)看，最重要的指標(biāo)就是單位面積上能夠 結(jié)合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結(jié)合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關(guān)，市 場(chǎng)上有些硝酸纖維素膜通常會(huì)還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結(jié)合量。S&S公司采用的是100%純度的硝酸纖維素，保證了最大的蛋白結(jié)合量，可達(dá)80-150卩g/cm2由于100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結(jié)合，降低雜交背 景，無(wú)需高嚴(yán)謹(jǐn)度的洗脫步驟。其次，膜的強(qiáng)度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī) 的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會(huì)破損，不能反復(fù)使用。PVDF轉(zhuǎn)移膜：PVDF是一種高強(qiáng)度、耐腐蝕的物質(zhì)，通常是用來(lái)制造水管 的。PVDF膜可以結(jié)合蛋白質(zhì)，而且可

36、以分離小片段的蛋白質(zhì)，最初是將它用于蛋 白質(zhì)的序列測(cè)定，因?yàn)橄跛崂w維素膜在Edman試劑中會(huì)降解，所以就尋找了PDVF作為替代品，雖然PDVF膜結(jié)合蛋白的效率沒(méi)有硝酸纖維素膜高，但由于它 的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測(cè)序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與硝酸纖維素膜一樣，可以進(jìn)行各種染色和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，也有很廣的適用范圍。這種PVDF北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTEGHNOLOGY CO- LTD膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細(xì)工藝下比常規(guī)的膜都要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進(jìn)行浸泡飽

37、和1-5秒 鐘。離子交換型轉(zhuǎn)移膜：硝酸纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結(jié)合蛋白的，還有 一類(lèi)膜是根據(jù)離子交換的方式結(jié)合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素制成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質(zhì)印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結(jié)合陰離子基團(tuán)，包括那些高于其等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。在pH10以下，DEAE基團(tuán)都能帶電荷，在低離子強(qiáng)度的轉(zhuǎn)移液中結(jié)合蛋白分子。其最適的pH環(huán)境為5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、 病毒、 酶以及血紅蛋白的研究。 這種0.45 yn孔徑的DEAE膜， 除了可以做Western Blotting外，還可以用于核酸結(jié)合研 究。還有一種離子交換型膜是羧甲基（C

38、M）修飾的纖維素膜，它可以結(jié)合蛋白和 多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，最適結(jié)合pH范圍在4-7。結(jié)合的多 肽分子可以從CM膜上洗脫下來(lái)，用于氨基酸系列分析或微測(cè)序。5. Marker的相關(guān)疑問(wèn)MM.我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，請(qǐng)問(wèn)什 么原因？怎樣改善？膠用過(guò)8%,10%,12%，都是這樣。marker是新買(mǎi)的。解 答：一般來(lái)說(shuō)，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。 當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。NN.用的是Roche molecular Biochemicals公司的由1OOkd,75kd,45kd,30kd,20kd,10

39、kd組成的marker。開(kāi)始做Western Blot時(shí)還能夠看到marker, 當(dāng)然也僅能看見(jiàn)其中最多三條帶。用80V進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用恒壓10V45min轉(zhuǎn)印的。前幾次做Western Blot時(shí)沒(méi)有進(jìn)行麗春紅染色，但盡管用了此 方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現(xiàn)。再就是把70KD和130KD兩個(gè)目的蛋白同時(shí)在一塊膠上進(jìn)行分析，用培養(yǎng)基樣品進(jìn)行分析，沒(méi)有用 間接法，而是北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. , LTD直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體(Anti-V5-HR

40、P)。但就是出不來(lái) 結(jié)果，我很茫然。謝謝您過(guò)給予指點(diǎn)！解答：1、我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開(kāi)始做Western Blot時(shí)還能夠看到marker，當(dāng)然也僅能看見(jiàn)其中最多三條帶。”有的時(shí)候，Prestai ned Marker放久了 效果就會(huì)變差，電泳是條帶不清晰，擴(kuò)散。但是你的問(wèn)題可能還有其他的方面的問(wèn) 題，可能是蛋白跟膜結(jié)合的不緊密。轉(zhuǎn)移是多加點(diǎn)甲醇。2、 前幾次做Western Blot時(shí)沒(méi)有進(jìn)行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能 看到marker有一條大約是30K

41、D的條帶出現(xiàn)?！鞭D(zhuǎn)移時(shí)半干法建議用恒流，你這樣 的也就30kd-50kd的轉(zhuǎn)移地比較好。3、 再就是把70KD和130KD兩個(gè)目的蛋白同時(shí)在一塊膠上進(jìn)行分析，用培養(yǎng)基樣品進(jìn)行分析，沒(méi)有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體(Anti-V5-HRP)?！笔欠駲z測(cè)了表達(dá)量， 二抗是否是好的， 你做了陽(yáng)性對(duì)照？你要做這么大的蛋白 最好轉(zhuǎn)移時(shí)間延長(zhǎng)到1.5hrs。6.染色的選擇00. Wester n Blot哪種染色好？解答：(1)陰離子染料是最常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測(cè)極 限可達(dá)到1.5卩，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測(cè)后容易從蛋

42、白質(zhì)中除去，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語(yǔ)正電賀的膜。靈敏 度低。(2) 膠體金，靈敏度高，檢測(cè)范圍可到pg級(jí)，但染色比穩(wěn)定。(3) 生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO GHANGSHENG 81OTECHNOLOGY CO. . LTDPP.是否Western Blot實(shí)驗(yàn)半定量一定要加ACTIN內(nèi)參?解答：對(duì)于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)最好加內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。QQ.用BANDSCAN分析結(jié)果行嗎？解答：分析一般的結(jié)果沒(méi)問(wèn)題。RR.核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇

43、什么合適?7.參照的疑問(wèn)O解答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以 當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。SS.轉(zhuǎn)膜時(shí)采用電流是否比電壓準(zhǔn)確，是否根據(jù)0.8mA/cm2，般1小時(shí)左 右？解答：不是的，半干法推薦用恒流，一般根據(jù)目的蛋白的大小來(lái)確定電流和 時(shí)間。TT做半定量人卵巢癌細(xì)胞系的Western Blot， 內(nèi)參B-actin，GAPDH， 那個(gè) 好？解答： 選用beta-actin就可以。8.緩沖液配方的常見(jiàn)問(wèn)題UU.轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉時(shí)，所用的防沫劑A是什么？還有Tris-HCI是不是就是用Tris和鹽酸配出來(lái)的呢？解答：轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%

44、的TBST脫脂奶粉。TrisHCl就是Tris鹽用HCI調(diào)ph值，配置而成。VV.準(zhǔn)備做大鼠腦子的Western Blot，蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核中，請(qǐng)問(wèn)此蛋白質(zhì)的 提取液及操作方法是？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白質(zhì)是磷酸化的蛋白質(zhì)，操 作時(shí)如何防止去磷酸化的發(fā)生？解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化WW.想問(wèn)一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來(lái) 源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. LTD解答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)加入光譜的蛋白酶抑制

45、劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來(lái)說(shuō)都沒(méi)有區(qū)別。XX.最近作了兩次Western Blot，不但沒(méi)陽(yáng)性結(jié)果，顯色背景都沒(méi)有，電泳和 轉(zhuǎn)膜都染過(guò)，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過(guò)，沒(méi)問(wèn)題。1、檢測(cè)GAD-分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不會(huì)有影響把？ 樣本-20度放置一周內(nèi)測(cè)。2、一抗放置2年，可能效價(jià)不高！用的是1:100。如果 是一抗的原因，不會(huì)背景都沒(méi)有把？3、第一次有不均勻背景，因?yàn)橐豢惯^(guò)夜時(shí)密封袋不均勻。 后兩次無(wú)背景顯色。4、 封閉液用的是含15%脫脂奶粉TBST， 漂洗 液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20

46、為0.1%， 不會(huì)是封閉液的問(wèn)題吧？ 解答： 可以在下面幾個(gè)問(wèn)題上找找原因。1.封閉液用5%Milk，漂洗液(washing buffer用TBST)2.看看一抗是否能work，降到1:20。3.看看二抗是否有問(wèn)題。YY.加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起著一定的固定作用，因?yàn)樾》肿拥鞍踪|(zhì)容易轉(zhuǎn)出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因?yàn)镹C膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力較弱。ZZ.轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST最后那 個(gè)T是Tween嗎，濃度多大？解答：是Tween，配方如下：Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST, Dissolve 8.8g o

47、f NaCl，0.2g ofKCl，and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Twee n-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl,Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclav ing.AAA.封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒(méi)有什么規(guī)定呢，比如現(xiàn)在我就在室溫里 做，或者要在4度下？BEIJING DINGGUO GHANGSHENG BIOTECHNOLOGY解答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小 時(shí)，然后4度過(guò)夜。B

48、BB.實(shí)驗(yàn)室暫無(wú)NP40我用sds可以嗎？另外有過(guò)用尿素和硫脲提取膜蛋白嗎？配方如下：7M尿素，2M硫脲，Trit on -x-100 0.2ml，新鮮加入：65mM DTT蛋白酶抑制劑：試劑盒HaltTM Protease in hibitor cocktail kit 1%（v/v是用于抽提雙向電泳用蛋白的配方。不止用于抽提細(xì)胞全蛋白（主要是想得到 其中的膜蛋白）是否可行？改良的RIPA裂解緩沖液（Tris.HCl，50 mmol/L，pH 7.5; NaCl，150 mmol/L;NP-40，1%;脫氧膽酸鈉，0.5%; SDS,0.1%; EDTA，1 mmol/L; PMSF，1 m

49、mol/L; Leupeptin，2卩g/m不知對(duì)于膜蛋白效果如何？此外該方中的EDTA，是否用做蛋白酶抑制劑？解答：做2D絕對(duì)不推薦使用NP40（因?yàn)榧词惯M(jìn)口的NP40也不 純，其中的雜質(zhì)會(huì)影響質(zhì)譜結(jié)果）。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞，其蛋白酶活性較弱（相對(duì)于 組織和大腸桿菌等），可以不使用cocktail，因?yàn)?M尿素+2M硫脲+4%CHAPS構(gòu)成的變性環(huán)境已經(jīng)足以抑制大部分蛋白酶的活性， 2M硫脲+4%CHAPS對(duì)于抽提膜蛋白有很大的幫助，不過(guò)如果您專(zhuān)職做膜蛋白建議采用分級(jí)抽提 法。此外還可以采用梯度離心法和一些基于去垢劑的方法EDTA用于滅活金屬 蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加過(guò)多的蛋白酶抑制劑可以導(dǎo)

50、致蛋白質(zhì)的修飾，做WE無(wú)所謂，做MAILDI時(shí)會(huì)給正確鑒定帶來(lái)麻煩。裂解緩沖液中少了兩性電 解質(zhì)（在2-D裂解緩沖液中，兩性電解質(zhì)起的作用：提供連續(xù)的PH梯度，從很大程度上增加蛋白質(zhì)的溶解性；還可以去除一部分核酸；也不推薦采用SDS，因oMMGEJ北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司CO. , LTDSDS會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致其等電點(diǎn)發(fā)生改變，如果您實(shí)在要用，終濃度降到 以下。METHOD2（50ml總量）：？-mercaptoethanol 342;憶0% SDS 5 m；Tris-CI pH 6.7 3.125ml；北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHE

51、NG BIOTECHNOLOGY 00. * LTD加ddH2O至50 ml。方法：將用過(guò)的膜浸入stripping buffer中，置50E水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TTBS洗3*5min就好。此時(shí)你已經(jīng) 可以按新的轉(zhuǎn)移好的膜來(lái)再次使用了。該方法的優(yōu)點(diǎn)：省事，省力，省錢(qián)，符合國(guó)際慣例。METHOD31、beta-metaptoethanol 35ul2、10%SDS 1ml3、tris （ 0.5M，pH6.7 625ul4、dH2O 3.34ml50 -55C，30min。METHOD40.1%stripp ing buffer應(yīng)該是可以放置很久的。不過(guò)我習(xí)慣于現(xiàn)配mercapt

52、oetha nol以后太難聞了，配了就用；而且，有了現(xiàn)成的Tris-HCI緩沖液和SDS的母液，現(xiàn)配還是很方便的。每次用量5ml少了點(diǎn)，我每次用50ml。METHOD50.5M NaCl，0.5M HAc;室溫?fù)u床15min。METHOD6將用過(guò)的膜泡在1*TBS中室溫振搖過(guò)夜，中間可以換液2-3次，然后封閉, 加一抗，二抗（同第一次發(fā)光），實(shí)踐證明方法完全可行。不管用那種方法，洗脫后都要用PBS或TBS再洗幾次9.條件的摸索北示鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY CO. LTDDDD.用的是Santa Cruz的抗體，

53、也實(shí)驗(yàn)過(guò)一抗和二抗肯定能結(jié)合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍(lán)染色沒(méi)問(wèn)題，但是不知道與Marker對(duì)應(yīng)的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時(shí)轉(zhuǎn)膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉(zhuǎn)過(guò)去的較少。難道是裂解液出了問(wèn)題？ 我用的是三去污劑，但沒(méi)加疊氮鈉和大概叫Apopt in的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂 解-80度凍存的細(xì)胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克?。ǖ诙妫┥?的加樣buffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。不知道是哪里出了問(wèn)題？解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質(zhì)量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測(cè)蛋白 的濃度，一般來(lái)講，

54、其濃度應(yīng)該在幾-20微克/微升。畢竟，加了2、若是蛋白沒(méi)問(wèn)題，哪就看是不是電泳的問(wèn)題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10%和12%的膠。60-80V,1小時(shí)左右。跑過(guò)積層膠與分離膠的線時(shí)，換用100V，3-4小時(shí)。3、 轉(zhuǎn)膜，建議恒壓，15V，不用轉(zhuǎn)2小時(shí)，45分鐘足以。您所說(shuō)的大蛋白轉(zhuǎn) 過(guò)去的，并不是真正的少，而是因?yàn)樵谔岬牡鞍字写蟮鞍妆旧砭秃苌?。我曾?jīng)也轉(zhuǎn) 過(guò)2小時(shí)，但和45分鐘的區(qū)別并不大。4、 根據(jù)MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據(jù)MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，4

55、5-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在 上面。5、延長(zhǎng)1抗、2抗孵育時(shí)間（我曾室溫1小時(shí)，4度過(guò)夜），適當(dāng)加大1抗?jié)?度。&我買(mǎi)的也是Santa Cruz的抗體，我覺(jué)得質(zhì)量還可以，我想您應(yīng)該先找其他 方面的原因。EEE.電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉(zhuǎn)膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細(xì)胞和一抗在我的整個(gè)反應(yīng)體系下做出來(lái)了， 當(dāng)然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問(wèn)題應(yīng)該出在抗原和一抗上，不知對(duì)不對(duì)。 解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即 可。正常條件下，電泳時(shí)溴酚藍(lán)和10kd左

56、右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時(shí)間。建議你用恒壓80-100伏。O北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING D1NGGUO GHANGSHENG B1OTECHNOLOGY GO. . LTDFFF. BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有一個(gè)很致命的弱點(diǎn)就是無(wú)法控溫（我用的就 是這種），當(dāng)電流過(guò)高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下， 就很容易燒膠。就轉(zhuǎn)膜時(shí)，是采取恒壓還是恒流的問(wèn)題，我想和大家探討一下，我感覺(jué)我這個(gè) 系統(tǒng)用恒流很容易燒膠，我的膠有68cm2,用50mA恒流來(lái)轉(zhuǎn)膜，剛開(kāi)始電壓就很 高，有20 v左右，而用恒壓，開(kāi)始電流有110mA，但15min后，電流就

57、降到80mA，30min后就穩(wěn)定在40mA，不就相當(dāng)于恒流嗎？解答：恒流時(shí)電壓逐漸升高的原因是濕濾紙逐漸變干因而電阻逐漸增大的緣 故，如果電壓升得太快，可以使濾紙更濕一些以克服。就我的感覺(jué)，20V的電流30min以后20Kd以下的分子丟失很多，不過(guò)我用的是小膠40cm2，不知有無(wú)不 同。GGG.我想盡量提高轉(zhuǎn)膜的效率（我的實(shí)驗(yàn)要求轉(zhuǎn)到膜上的蛋白越多越好，不 管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？解答：不管怎么轉(zhuǎn)都會(huì)存在蛋白轉(zhuǎn)移不完全（電壓過(guò)小時(shí)間過(guò)短）或過(guò)度轉(zhuǎn)移 （電壓過(guò)大時(shí)間過(guò)長(zhǎng)）的問(wèn)題，魚(yú)（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可 得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜

58、，下半時(shí)間短， 上半時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，應(yīng)該會(huì)好一些。HHH.請(qǐng)問(wèn)一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？解答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話， 反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結(jié)果較差。尼龍膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋 白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì) 較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。III. 1、煮好后的樣品，若沒(méi)有及時(shí)上樣分離，應(yīng)如何保存，可以保存多久？2、有沒(méi)有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒(méi)有操作手冊(cè)？3、濕式轉(zhuǎn)移時(shí)是 否必須要用bio-rad的專(zhuān)用濾紙？4、恒壓轉(zhuǎn)移的條件如何確定

59、，因?yàn)槲乙蛛x小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移條件能夠相同嗎？5、凝膠的濃 度是不是可以用一個(gè)濃度？書(shū)上寫(xiě)不同的凝膠濃度分離的分子量范圍不同，還給北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司BEIJING DINGGUO CHANGSHENG BIOTEGHNOLOGY CO- LTD出了一個(gè)線形范圍，是不是不在這個(gè)范圍內(nèi)也能分離，只是就不是線性范圍 了？解答：1、煮好后的樣品，放到-20,我們?cè)谝粋€(gè)月后此樣品，效果一樣。2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊(cè)在他們的主頁(yè)Bio-Rad USA上有。3、轉(zhuǎn)移時(shí)一般的WATERMEN濾紙就可以。4、 轉(zhuǎn)移條件是和蛋白質(zhì)大小有關(guān)的

60、：以次確定電壓和時(shí)間。具體可讓ptglab幫你定奪。5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質(zhì)大小有關(guān)。不是隨心所欲選的，否則分離效 果可能不是你所期望的。JJJ.怎樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最佳的條件？解答：隨便說(shuō)一點(diǎn)，具體的還是需要自己想：1、在每個(gè)上樣孔里上同樣的蛋白樣品，量也一樣，最好是組織樣，（也可以 跑1個(gè)大well，不插梳子，多上樣，）SDS-page；2、轉(zhuǎn)移，設(shè)定電流或電壓；3、每隔1（or n）小時(shí)，取一點(diǎn)膜染色，看轉(zhuǎn)移效果。KKK.我要測(cè)兩種抗體，一種為磷酸化的目的蛋白，一種為總的目的蛋白，不 知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分鐘，似乎沒(méi)什么效果？解答：你可以加巰基乙醇（load