結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)活動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告

1、第六節(jié) 結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)活動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告1、 生物因子 （一）一般特性 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis)，于1882年由德國微生物學(xué)家Koch發(fā)現(xiàn)并證實(shí)為結(jié)核病的病原菌。1886年，Lehman和Neuman正式將其命名為結(jié)核分枝桿菌，又稱結(jié)核菌。1.形態(tài)與染色結(jié)核分枝桿菌細(xì)長略彎曲，端極鈍圓，大小約（14)m×(0.30.6)um ,呈單個(gè)或分枝狀排列，有時(shí)呈V、Y、人字型排列，無鞭毛和芽孢。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌無莢膜。結(jié)核分枝桿菌常用萋-尼氏（Ziehl- Neelsen)抗酸性染色法染色，染色后結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)紅色，其他非抗酸性細(xì)菌呈藍(lán)色

2、。結(jié)核分枝桿菌除正常典型桿狀形態(tài)外，在陳舊的病灶和培養(yǎng)物中，形態(tài)常不典型，可呈顆粒狀，串球狀，短棒狀，長絲形等；或受物理因素、化學(xué)因素，以及藥物等因素的影響，而呈現(xiàn)異常變化；另外，還有可通過在內(nèi)在電鏡下觀察細(xì)菌濾膜的濾過型、細(xì)胞壁缺損或喪失的細(xì)胞壁缺陷L型，以及存在于結(jié)核病灶、漿液性滲出液等樣品可看到的革蘭染色陽性顆粒的球狀微粒型。2.生長特性和培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌為緩慢生長細(xì)菌，較普通細(xì)菌生長十分緩慢，在動(dòng)物體內(nèi)繁殖代時(shí)約為15h,在家兔角膜中約需要2022h，在巨噬細(xì)胞內(nèi)月需要1520h。體外生長時(shí)營養(yǎng)要求高，可在含有蛋黃、馬鈴薯、甘油和天門冬素或動(dòng)物血清等的固體培養(yǎng)基上生長。最適PH6.47

3、.0，在3540可生長，最適溫度為3537。常用的培養(yǎng)基有羅氏培養(yǎng)基、小川培養(yǎng)基、油酸血清（白蛋白）瓊脂培養(yǎng)基和蘇通液體培養(yǎng)基等，在良好的培養(yǎng)條件下，生長代時(shí)約1824h，培養(yǎng)24周才出現(xiàn)肉眼可見的菌落。在固體培養(yǎng)基上菌落呈顆粒、結(jié)節(jié)或花菜狀，乳白色或米黃色，不透明；而在液體蘇通培養(yǎng)基內(nèi)呈粗糙皺紋狀菌膜生長。3.生化反應(yīng)結(jié)核分枝桿菌能夠產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，可使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；在酸性條件下，亞硝酸鹽與氨基苯磺胺、N-甲萘基乙烯二銨鹽酸鹽形成紅色偶氮化合物。牛分枝桿菌和部分非結(jié)核性分枝桿菌不能產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，因此可用于結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌的鑒別。結(jié)核分枝桿菌缺乏煙酸酶，故不能分解代謝過程

4、中產(chǎn)生的煙酸，在培養(yǎng)中，結(jié)核分枝桿菌生長時(shí)的煙酸聚集量較牛分枝桿菌及其他分枝桿菌高。煙酸砒啶環(huán)的氮與聯(lián)苯胺及溴化氰作用后，呈現(xiàn)桃紅色或紅色沉淀反應(yīng)。通過煙酸試驗(yàn)可以將結(jié)核分枝桿菌同其他分枝桿菌區(qū)分。4.免疫學(xué)特性抗結(jié)核免疫反應(yīng)在結(jié)核分枝桿菌感染中起著根本作用，免疫系統(tǒng)能有效地抵抗大多數(shù)感染，感染結(jié)核分枝桿菌的大多數(shù)人（約90%）在其一生中并不能發(fā)展成患有結(jié)核病。然而，當(dāng)與免疫系統(tǒng)疾病同時(shí)存在時(shí)，如合并感染人類免疫缺陷病毒（HIV）,發(fā)展為結(jié)核病的機(jī)會(huì)就會(huì)大大增加。結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)感染菌，其免疫主要是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌侵入人體內(nèi)，被巨噬細(xì)胞吞噬后，未活化的巨噬細(xì)胞的抗菌活性

5、弱，不能防止所吞噬的結(jié)核分枝桿菌生長，但可遞呈抗原，使周圍T淋巴細(xì)胞致敏。致敏淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生多種淋巴因子，如IL-2、IL-6、INF-。這些因子與TNF-的共同作用可殺死結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌的免疫屬于感染免疫，又稱有菌免疫，即只有當(dāng)結(jié)核分枝桿菌或其組分存在體內(nèi)時(shí)才有免疫力。一旦體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌或其組分全部消失，則免疫也隨之不存在。5.遺傳特性 結(jié)核分枝桿菌基因序列有4400多萬bp，包含了4000多個(gè)基因，有很高的鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）含量。結(jié)核分枝桿菌基因組在進(jìn)化過程中形成了不同的分枝，主要有北京家族、東非-印度分枝、中亞或德里家族、哈勒姆家族、拉丁美洲和地中海家族等，其中北京

6、家族有高毒力和高致病性。6. 耐藥性 結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐性的機(jī)制主要是靶編碼基因的突變所致。結(jié)核分枝桿菌的自然耐藥突變率為10-1010-5之間。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌的編碼基因發(fā)生突變后，其對(duì)耐藥的敏感性表型發(fā)生改變，這樣的突變是隨機(jī)、自發(fā)的，并和是否與藥物接觸無關(guān)。在一個(gè)菌群中，耐藥個(gè)體的出現(xiàn)是以一定頻率產(chǎn)生的，并隨著藥物對(duì)敏感菌體殺滅的選擇作用，耐藥菌體的比例逐漸增加，直至成為耐藥菌優(yōu)勢(shì)菌群。耐藥結(jié)核分枝桿菌可以分為原發(fā)耐藥、初始耐藥和繼發(fā)耐藥，但結(jié)核分枝桿菌會(huì)出現(xiàn)交叉耐藥的情況，即對(duì)一種藥物產(chǎn)生耐藥后，同時(shí)又對(duì)另一個(gè)藥物也產(chǎn)生敏感性的改變。（2） 來源 結(jié)核桿菌可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最

7、多見。結(jié)核病是一種古老的疾病，也許有了人類之后，不久就有了它的存在。1965年，法國學(xué)者Sylvius根據(jù)解剖了死于所謂“消耗病”或“癆病”人的尸體，發(fā)現(xiàn)肺臟及其他器官有顆粒狀的病變，根據(jù)其形態(tài)特征稱之為“結(jié)核”。1973年，湖南長沙馬王堆漢墓出土的2100年前的女尸身上發(fā)現(xiàn)左上肺門均有結(jié)核病灶。因而，結(jié)核的名稱就此被應(yīng)用至今。（3） 傳染性因結(jié)核病病變進(jìn)展的患者痰中帶有大量的結(jié)核桿菌，故這類患者是結(jié)核病的主要傳染源，痰中的結(jié)核桿菌越多，傳播的危險(xiǎn)性就越大。病人出現(xiàn)痰涂片陽性，若1mL痰液中含菌量為100010000，則其痰涂片陽性率為40%50%。病人排菌量越大，其密切接觸者的感染率也就越高

8、。結(jié)核桿菌菌株之間毒力有較大差異，不同類型的病人排出結(jié)核桿菌不僅在數(shù)量上不同，其毒力也不同，因而其傳染性亦不同。感染的結(jié)核桿菌活力越強(qiáng)，數(shù)量越大，傳染性也越強(qiáng)。 感染藥物敏感菌的結(jié)核病患者在未治療時(shí)的相對(duì)傳染性為100%。通常，結(jié)核病患者經(jīng)一段時(shí)間治療后，結(jié)核桿菌對(duì)人的感染能力減弱，相對(duì)傳染性降為25%；感染耐藥菌的病人未治療時(shí)相對(duì)傳染性為100%，在治療時(shí)則降為27.3%。(4) 傳播途徑結(jié)核分枝菌主要通過呼吸道傳播，傳染源主要是排菌的肺結(jié)核病人（尤其是痰涂片陽性，未經(jīng)治療者）的痰。飛沫感染為最常見的方式，健康人吸入患者咳嗽、打噴嚏時(shí)噴出的飛沫而受感染。直徑小于10um的痰滴可進(jìn)入肺泡腔，或

9、因其重量輕而漂浮于空氣中較長時(shí)間，在室內(nèi)通風(fēng)不良環(huán)境中的帶菌飛沫，亦可被吸入引起感染。感染的次要途徑是經(jīng)消化道進(jìn)入體內(nèi)。少量、毒力弱的結(jié)核分枝桿菌多能被人體免疫防御機(jī)制所殺滅。僅當(dāng)受大量毒力強(qiáng)的結(jié)核菌侵襲而機(jī)體免疫力不足時(shí)，感染后可能發(fā)病。其他感染途徑，如經(jīng)皮膚、消化道、泌尿生殖系統(tǒng)等均少見。（五）易感性1.宿主范圍 結(jié)核分枝桿菌的宿主包括人、牛、犬、豬、猴、羊等。人、畜、禽類被結(jié)核桿菌感染后，在感染個(gè)體的機(jī)體多種組織內(nèi)形成肉芽腫和干酪樣鈣化灶為特征的慢性傳染病。2.易感人群 結(jié)核病主要是人群之間傳播的傳染病，發(fā)生結(jié)核桿菌傳播主要取決于傳染源排菌情況。在受到結(jié)核菌感染的人群中只有4%5%的人發(fā)

10、生結(jié)核病，其余90%以上的人并不發(fā)病。3.易感者的自身因素 結(jié)核桿菌進(jìn)入人體，引起易感者機(jī)體的復(fù)雜反應(yīng)。易感者的身體和心理等狀況均可影響機(jī)體的反應(yīng)過程和結(jié)果。機(jī)體的自然免疫力強(qiáng)、接種過卡介苗（Bacillus calmette guérin,BCG）或受過感染后獲得了免疫力，則能將入侵的結(jié)核桿菌殺死或嚴(yán)密包圍，制止其擴(kuò)散，使病灶愈合。（六）潛伏期潛伏期尚不明確，可能為數(shù)天、數(shù)月、數(shù)年。（七）劑量效應(yīng)關(guān)系傳染源排出的飛沫受壓力和黏度的影響而大小不一。飛沫核直徑為110um者在空氣中漂浮的時(shí)間長。進(jìn)入人體末梢氣管內(nèi)越多，越容易傳播。豚鼠通過氣溶膠途徑接觸15個(gè)結(jié)核分枝桿菌感染就可造成肺部

11、感染并導(dǎo)致死亡。小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌少見天然感染，靜脈注射標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv2501000萬個(gè)菌量，可于半月左右發(fā)病死亡。而雜種小鼠則需要更大的劑量。不同小鼠株系也有耐受和敏感性程度上的差異。（八）致病性結(jié)核分枝桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素。其致病性可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)大量繁殖引起的炎癥、菌體成分和代謝物質(zhì)的毒性，以及機(jī)體對(duì)菌體成分產(chǎn)生的免疫損傷有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌可通過呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入易感機(jī)體，引起多種組織器官的結(jié)核病，其中以通過呼吸道引起肺結(jié)核為多見。因腸道中有大量正常菌群寄居，結(jié)核分枝桿菌必須通過競(jìng)爭(zhēng)才能生存并和易感細(xì)胞黏附。肺泡中無正常菌群，結(jié)核分枝桿菌可通過飛沫微滴或含菌塵埃的方式

12、被吸入，故肺結(jié)核較為多見。1. 肺部感染 由于感染菌的毒力、數(shù)量、機(jī)體的免疫狀態(tài)不同，肺結(jié)核可以有以下兩類表現(xiàn)。（1） 原發(fā)感染：多發(fā)生于兒童。肺泡中有大量巨噬細(xì)胞，少數(shù)活的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入肺泡即被巨噬細(xì)胞吞噬。該菌有大量脂質(zhì)，可抵抗溶菌酶而繼續(xù)繁殖，使巨噬細(xì)胞遭受破壞，釋放出的大量菌在肺泡內(nèi)引起炎癥，稱為原發(fā)灶。（2） 原發(fā)后感染：病灶亦以肺部為多見。病菌可以是外來的（外源性感染）或原來潛伏在病灶內(nèi)（內(nèi)源性感染）。由于機(jī)體已有特異性細(xì)胞免疫，因此，原發(fā)后感染的特點(diǎn)是病灶多局限。一般不累及鄰近的淋巴結(jié)，被纖維素包圍的干酪樣壞死灶可鈣化而痊愈。若干酪樣結(jié)節(jié)破潰，排入鄰近支氣管，則可形成空洞并釋放

13、大量結(jié)核分枝桿菌至痰中。2. 肺外感染 部分患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌可進(jìn)入血液循環(huán)引起肺內(nèi)、外播散，如腦、腎結(jié)核，痰菌被咽入消化道也可引起腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎等。結(jié)核分枝桿菌缺乏明確的外毒素、侵襲性酶和內(nèi)毒素。其毒力與素狀因子、硫脂、脂阿拉伯甘露聚糖、磷脂、某些分泌性蛋白等有關(guān)。但在整體水平和細(xì)胞水平仍未得到可滿意的解釋病原性毒力因子。其致病性可能與在宿主體內(nèi)頑強(qiáng)增殖和引起機(jī)體的病理性免疫反應(yīng)有關(guān)。結(jié)核感染和發(fā)病時(shí)間之間存在著很大的個(gè)體差異，感染后數(shù)月至數(shù)十年發(fā)病，甚至可終身無病。歐美在20世紀(jì)報(bào)道一代感染者中約有5%10%發(fā)病。日本在20世紀(jì)3040年代統(tǒng)計(jì)表明年內(nèi)發(fā)病率為30%，近年報(bào)告降低

14、為10%。我國無確切統(tǒng)計(jì)數(shù)字可依據(jù)。在發(fā)病者中近半數(shù)在感染后半年至兩年內(nèi)于機(jī)體抵抗力低時(shí)發(fā)病。90%的結(jié)核菌感染者可保持終生不發(fā)病。（九）變異性結(jié)核分枝桿菌可發(fā)生形態(tài)、菌落、毒力、免疫原性和耐藥性等變異?？ń槊纾˙CG）就是Calmette和Guerin 2人（1908年）將牛結(jié)核分枝桿菌在含甘油、膽汁、馬鈴薯的培養(yǎng)基中經(jīng)13年230次傳代而獲得的減毒活疫苗株。結(jié)核分枝桿菌的耐藥性變異隨著化療藥物的應(yīng)用而產(chǎn)生，耐藥利福平藥物結(jié)核分枝桿菌多聯(lián)系ropB基因突變，而異煙肼、吡嗪酰胺多聯(lián)系katG和inhA、pncA基因的突變。一株結(jié)核分枝桿菌可以發(fā)生多到對(duì)十幾種藥物的耐藥，印度等國家就陸續(xù)報(bào)道了全

15、耐藥結(jié)核分枝桿菌（TDR-TB）。（十）穩(wěn)定性1.在自然環(huán)境中的穩(wěn)定性與對(duì)溫度的敏感性 在自然條件下結(jié)核分枝桿菌在室內(nèi)陰暗潮濕處能存活半年；在干燥的痰中于陰暗處可存活68個(gè)月；在隨塵土飛揚(yáng)的空氣中可保持傳染性810d；在污染的圖書上可存活3個(gè)月；3條件下存活1年，68環(huán)境下可存活45年。另有資料表明，室內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌微滴核約60%71%，可存活3h，48%56%中存活6h,28%32%中存活9h以上。2.化學(xué)滅活 結(jié)核分枝桿菌直接接觸70%75%乙醇530min可被殺死，因此可用于皮膚消毒。但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一層把菌體包裹起來的膜，短時(shí)間內(nèi)不能殺死細(xì)菌，通常乙醇不用于痰標(biāo)本的

16、消毒，1%甲醛處理結(jié)核分枝桿菌5min，可使細(xì)菌死亡。5%甲醛和痰液等量混合，處理12h以上才能達(dá)到殺菌作用。在房間密閉性好、相對(duì)濕度60%80%的條件下，使用810g/m3甲醛熏蒸12h以上，可有效殺滅空氣中和光滑表面物品上的結(jié)核分枝桿菌。對(duì)結(jié)核分枝桿菌污染的室內(nèi)空氣，可用甲醛氣體熏蒸的方法進(jìn)行終末消毒。3.物理滅活 干熱180可達(dá)到殺菌目的，殺死痰中的結(jié)核菌則需3h以上。結(jié)核分枝桿菌對(duì)濕熱敏感，65 30min或95 1min可殺滅結(jié)核分枝桿菌純培養(yǎng)物；100煮沸5min可殺死痰中結(jié)核分枝桿菌。65巴氏消毒法可用于牛奶中結(jié)核分枝桿菌的滅活。用600W微波滅菌器照射4min，可將玻璃表面污染

17、的牛型結(jié)核分枝桿菌完全殺滅。121壓力蒸汽30min，132預(yù)真空壓力蒸汽3min均可殺滅動(dòng)物臟器、痰或培養(yǎng)基中的結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌對(duì)日光敏感，日光照射2h以上可殺死結(jié)核分枝桿菌，紫外線對(duì)結(jié)核分枝桿菌有一定殺滅作用，用輻射強(qiáng)度在100w/cm2以上的30w紫外線燈，在相對(duì)濕度50%70%的條件下，照射40min以上，對(duì)空氣中結(jié)核分枝桿菌的殺滅效果可達(dá)99.9%以上。（十一）預(yù)防和治療1.免疫 結(jié)核病是結(jié)核桿菌所致的慢性傳染病，具有抗感染免疫的特征，包括先天性免疫和獲得性免疫。先天性免疫是抗結(jié)核的天然抵抗力，由體表和體內(nèi)防御系統(tǒng)租成，是非特異性免疫，如體表屏障、呼吸道的纖毛上皮、肺泡巨噬

18、細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的吞噬作用、溶菌酶的殺菌作用等。獲得性免疫是機(jī)體受結(jié)核桿菌免疫原刺激后產(chǎn)生的針對(duì)該病原體的抵抗力，是特異性免疫。細(xì)胞免疫起決定性作用，體液免疫無重要影響。目前使用的卡介苗接種可以獲得部分免疫性保護(hù)，對(duì)預(yù)防和減少兒童結(jié)核病，特別是結(jié)核性腦膜炎等的發(fā)生起著重要作用，但是對(duì)于青少年和成人的保護(hù)效果差異較大，不同的人群和不同地區(qū)的保護(hù)力在0%80%不等，尤其是對(duì)HIV感染者，無法接種卡介苗以提供保護(hù)。2.預(yù)防 藥物預(yù)防的目的，主要是對(duì)那些已經(jīng)感染結(jié)核菌并有較高發(fā)病可能的人進(jìn)行預(yù)防性服藥以減少結(jié)核病的發(fā)生。因?yàn)榻】等耸艿浇Y(jié)核菌感染后不一定發(fā)病，是否發(fā)病主要受到兩種因

19、素的影響，即感染結(jié)核菌毒力的大小和身體抵抗力的強(qiáng)弱。對(duì)已感染結(jié)核菌但沒有發(fā)生結(jié)核病的人進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療，其目的是為了盡可能殺死體內(nèi)感染的結(jié)核菌，減少菌量，防止產(chǎn)生或減少已感染結(jié)核菌者發(fā)生結(jié)核病的機(jī)會(huì)。常用藥物預(yù)防方法有：利福噴叮加異煙肼，每周服藥2次，3個(gè)月；單服異煙肼每日1次，6個(gè)月。在進(jìn)行“預(yù)防性治療”時(shí)，必須有專業(yè)醫(yī)生指導(dǎo)，排除活動(dòng)性結(jié)核病的存在，服藥要進(jìn)行管理，防止不良反應(yīng)發(fā)生，在知情同意基礎(chǔ)上進(jìn)行。3.診斷 結(jié)核病的診斷分為臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷(1)臨床診斷肺結(jié)核病的診斷參照肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（ws288-2008）；肺外結(jié)核的診斷依據(jù)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室結(jié)果進(jìn)行判斷。（2）實(shí)驗(yàn)室診斷細(xì)菌

20、學(xué)檢測(cè) 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)包括涂片顯微鏡檢查、分離培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)。標(biāo)本的選擇根據(jù)感染部位，可取痰、支氣管灌洗液、尿、糞、腦脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相應(yīng)部位分泌液或組織細(xì)胞。涂片顯微鏡檢查是指對(duì)獲取標(biāo)本進(jìn)行染色后顯微鏡檢查，通過形體發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌，診斷結(jié)核病。該檢查簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確性較高，從痰中查出結(jié)核菌，就能確診患了結(jié)核病，但敏感性低（050%）。分離培養(yǎng)是指對(duì)獲取的標(biāo)本經(jīng)堿性處理后接種于培養(yǎng)基上，觀察生長情況，診斷結(jié)核病。分離培養(yǎng)的結(jié)果可信度高，一般23周內(nèi)肉眼可見菌落，但個(gè)別菌需68周，檢測(cè)時(shí)間長使得應(yīng)用受到限制。藥敏試驗(yàn)是指對(duì)分離后的結(jié)核分枝桿菌在耐藥培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以獲得結(jié)核分支桿

21、菌對(duì)抗結(jié)核藥物的敏感情況。藥敏試驗(yàn)是診斷耐藥結(jié)核病的主要方法，但傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)需要4周，影響了耐藥結(jié)核病的及時(shí)診斷。免疫學(xué)檢測(cè) 結(jié)核菌素試驗(yàn)是應(yīng)用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚來測(cè)定機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌是否能引起超敏反應(yīng)的一種試驗(yàn)。該方法可以用于結(jié)核病篩查，但不能區(qū)分自然感染和人工接種感染。細(xì)胞免疫介導(dǎo)的結(jié)核菌干擾素釋放試驗(yàn)（T-cell interferon gamma release assays，TIGRA又稱IFMGRA或GRA）是近年來采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）法定量檢出受檢者全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的IFN-檢出釋放反應(yīng)，用于結(jié)核菌潛伏感

22、染的診斷。結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)是檢測(cè)體液中的抗結(jié)核分枝桿菌的抗體，可以使用ELISA、膠體金等方法，但特異性和敏感性都不高，僅可作為結(jié)核病輔助診工具。分子檢測(cè) 通過檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌或耐藥結(jié)核分枝桿菌特異的基因片段從而推斷結(jié)核病，有熒光定量PCR、恒溫?cái)U(kuò)增等方法。該類方法檢測(cè)周期短，能及時(shí)提供檢測(cè)結(jié)果，但需要進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用評(píng)價(jià)。3. 治療 結(jié)核分枝桿菌是能侵襲機(jī)體任何組織、器官引起進(jìn)行性疾病的致病菌。人型結(jié)核分枝桿菌是人類結(jié)核病的病原菌，結(jié)核分枝桿菌的致病作用可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)頑強(qiáng)增殖引起炎癥反應(yīng)，以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)性損傷有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌可通過呼吸道、消化道和破損的皮膚黏膜進(jìn)入機(jī)

23、體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官的結(jié)核病，其中以肺結(jié)核最常見。臨床上肺結(jié)核大致可分為四種類型：原發(fā)性肺結(jié)核、粟粒性肺結(jié)核、浸潤性肺結(jié)核和空洞性肺結(jié)核。結(jié)核分枝桿菌對(duì)一般抗生素不敏感。對(duì)鏈球菌素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇等藥物敏感。對(duì)于非耐藥結(jié)核病有WHO推薦的DOTS發(fā)現(xiàn)治療和管理策略。按照標(biāo)準(zhǔn)的DOT規(guī)定，及時(shí)就診、及時(shí)確診、規(guī)范治療和管理，均能治愈。耐藥結(jié)核病的診斷復(fù)雜，治療困難，往往療程很長，耐多藥病人一般需要1824個(gè)月，而且醫(yī)藥費(fèi)用是治療一般病人的100倍左右。因此，耐藥結(jié)核病的治療對(duì)個(gè)人、家庭以及社會(huì)均造成巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。耐藥結(jié)核病的臨床表現(xiàn)與普通結(jié)核病無明顯差別，臨床癥狀多種多

24、樣，輕重不等，與患者的年齡、機(jī)體的免疫狀態(tài)、營養(yǎng)狀態(tài)、并存疾病，入侵的結(jié)核分枝桿菌的毒力、菌量及病變部位及嚴(yán)重程度等均有關(guān)系。臨床可表現(xiàn)發(fā)熱、不同程度的咳嗽、咳痰，部分患者可有咯血，病變廣泛時(shí)可有呼吸困難等。肺外耐藥結(jié)核病的臨床表現(xiàn)據(jù)不同發(fā)病部位而不同。耐藥結(jié)核病的診斷和治療需到市級(jí)以上的專業(yè)或定點(diǎn)結(jié)核病醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行診治，通過標(biāo)準(zhǔn)化治療方案、個(gè)體治療方案和經(jīng)驗(yàn)治療方案的結(jié)合，以及特殊治療措施的實(shí)施能達(dá)到較好的治療效果。（二）事故分析1.實(shí)驗(yàn)室本身事故 BSL-2及BSL-3實(shí)驗(yàn)室中尚未發(fā)生過結(jié)核分枝桿菌感染事故。2.有關(guān)實(shí)驗(yàn)室已發(fā)生的事故 迄今為止未見有關(guān)證實(shí)是由于在實(shí)驗(yàn)室操作結(jié)核桿菌而感染人

25、的報(bào)道。二、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與風(fēng)險(xiǎn)控制（一）實(shí)驗(yàn)活動(dòng)1.實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的分險(xiǎn)評(píng)估 所有實(shí)驗(yàn)活動(dòng)根據(jù)中華人民共和國傳染病防治法 病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例和結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)。2.實(shí)驗(yàn)操作過程（1）菌株的傳代操作過程1） 在磨菌管上標(biāo)記好樣品編號(hào)，于生物安全柜中是用無菌吸管吸取無菌生理鹽水后。加幾滴到磨菌管中。2） 打開菌株培養(yǎng)管，用滅菌的接種環(huán)輕輕刮取菌落，置于磨菌管中。3） 使用磨菌棒將菌落制成均勻的菌液。4） 靜置10min后，用吸管接種約0.1ml至中改良羅氏培養(yǎng)基斜面上。5） 傳代后的培養(yǎng)基放置36培養(yǎng)，每周1次觀察菌落生長情況，于肉眼可見菌落出現(xiàn)后23周進(jìn)

26、行藥敏試驗(yàn)。風(fēng)險(xiǎn)因素（見表8-20）。表8-20 菌株的傳代過程中可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)及控制措施序號(hào)實(shí)驗(yàn)操作可能風(fēng)險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生概率風(fēng)險(xiǎn)控制措施殘留風(fēng)險(xiǎn)1開蓋啟開液體濺出較低整個(gè)活動(dòng)中動(dòng)作輕柔，勿劇烈操作，以防止液體濺出低風(fēng)險(xiǎn)2刮取菌落菌落濺出中整個(gè)活動(dòng)中動(dòng)作輕柔，勿劇烈操作，以防止菌落濺出低風(fēng)險(xiǎn)3磨菌磨菌管破碎較低整個(gè)活動(dòng)中動(dòng)作輕柔，以防止磨菌管破裂低分險(xiǎn)4接種產(chǎn)生氣溶膠較低吸管動(dòng)作輕柔低分險(xiǎn)（3） 菌懸液制備操作過程1） 在磨菌管上標(biāo)記好樣品編號(hào)，于生物安全柜中使用無菌吸管吸取含10%吐溫80無菌生理鹽水后，加幾滴到磨菌管中。2） 用一次性接種棒（環(huán)）刮取23周德新鮮菌落，置于磨菌管中。3） 注意盡

27、可能刮取斜面各個(gè)部位的菌落，避免挑取1、2個(gè)單獨(dú)菌落進(jìn)行試驗(yàn)，刮取菌的量以半環(huán)或一環(huán)（510mg）為宜。4） 使用磨菌棒將菌落制成均勻度菌液。5） 逐漸滴加滅菌生理鹽水，直至菌液濁度與麥?zhǔn)?號(hào)標(biāo)準(zhǔn)比濁管一致，即得到1mg/mL的菌液。風(fēng)險(xiǎn)因素（見表8-21）。表8-21 菌懸液制備過程中可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)及控制措施序號(hào)實(shí)驗(yàn)操作可能風(fēng)險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生概率風(fēng)險(xiǎn)控制措施殘留風(fēng)險(xiǎn)1開蓋啟開液體濺出較低動(dòng)作輕柔，勿劇烈操作，以防止液體濺出低風(fēng)險(xiǎn)2刮取菌落菌落濺出中動(dòng)作輕柔，勿劇烈操作，以防止菌落濺出低風(fēng)險(xiǎn)3磨菌磨菌管破碎較低動(dòng)作輕柔，防止磨菌管破裂低分險(xiǎn)（4）菌液稀釋和接種操作過程1） 菌液稀釋：在無菌、帶有螺旋

28、蓋的試管中以無菌吸管加入2ml滅菌生理鹽水備用，每株待測(cè)菌準(zhǔn)備2管；菌液靜置，待顆?；蚓鷫K沉淀；用22 SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取2滿環(huán)1mg/mL的菌液，平移至2ml 滅菌生理鹽水中，即稀釋10-2mg/mL菌液；用同樣方法再進(jìn)行100倍稀釋，即成10-4mg/mL菌液。2） 接種：用22 SWG 標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別取1滿環(huán)（即0.01mL）10-2mg/mL和10-4mg/mL的菌液，用劃線法均勻接種至作為對(duì)照的中性改良羅氏培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基表面，應(yīng)注意使菌液盡可能均勻分散于培養(yǎng)基斜面；最終接種菌量為10-4mg和10-6mg。風(fēng)險(xiǎn)因素（見表8-22）。表8-22 菌懸液稀釋和接種過程中可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)

29、及控制措施序號(hào)實(shí)驗(yàn)操作可能風(fēng)險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生概率風(fēng)險(xiǎn)控制措施殘留風(fēng)險(xiǎn)1稀釋吸管吹動(dòng)產(chǎn)生氣溶膠中吸管操作輕柔，勿劇烈操作，以防止氣溶膠的產(chǎn)生低風(fēng)險(xiǎn)2接種液體濺出較高接種環(huán)移動(dòng)的活動(dòng)中動(dòng)作平穩(wěn)，勿劇烈操作，以防止液體濺出低風(fēng)險(xiǎn)（4） 培養(yǎng)操作過程1） 接種后的培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)內(nèi)，直立放置（36±1）培養(yǎng)。2） 培養(yǎng)4周后報(bào)告結(jié)果。風(fēng)險(xiǎn)因素（見表8-23）。表8-23 菌懸液培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)及控制措施序號(hào)實(shí)驗(yàn)操作可能風(fēng)險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生概率風(fēng)險(xiǎn)控制措施殘留風(fēng)險(xiǎn)1移送培養(yǎng)管培養(yǎng)管滑落破碎低移送培養(yǎng)管時(shí)動(dòng)作謹(jǐn)慎低風(fēng)險(xiǎn)（二）設(shè)施設(shè)備設(shè)備的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估按計(jì)劃進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)檢查實(shí)驗(yàn)室壓力是否正常

30、，以確保壓力處于正常狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)室安排專業(yè)公司定期維護(hù)保養(yǎng)，建立日常維護(hù)計(jì)劃，每年進(jìn)行年檢；對(duì)于生物安全柜和壓力蒸汽滅菌器，每年有專人維護(hù)、檢測(cè)；每年舉辦兩次周期性培訓(xùn)，確保人員掌握生物安全柜、壓力蒸汽滅菌器的使用規(guī)程，以及出現(xiàn)意外事故的應(yīng)急培訓(xùn)。本實(shí)驗(yàn)活動(dòng)儀器設(shè)備相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別與控制見表8-24。表8-24 XXXBSL-3 實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)操作儀器設(shè)備風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別與控制措施儀器名稱可能風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生可能性后果描述控制措施生物安全柜氣流異常、生物安全柜出現(xiàn)正壓不大可能對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及實(shí)驗(yàn)室的高度危險(xiǎn)操作培訓(xùn)，設(shè)備定期維護(hù)。使用時(shí)，觀察窗不要抬得過高；柜內(nèi)盡量少放儀器和物品，不要阻塞后面氣口處的空氣流通；

31、禁止在柜內(nèi)使用酒精燈；在柜內(nèi)的所有工作都要在工作臺(tái)中央或后部進(jìn)行，并且通過觀察窗能看見柜內(nèi)的操作；盡量減少操作者后面的人員走動(dòng)，操作者不要頻繁移動(dòng)及揮動(dòng)手臂以免破壞定向氣流，前面的空氣柵格不要被吸管或其他材料擋?。簧锇踩竦娘L(fēng)扇在工作開始前及操作結(jié)束后至少要再運(yùn)行5min。實(shí)驗(yàn)開始前開啟安全柜排風(fēng)，待壓力穩(wěn)定后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)箱二氧化碳泄漏；電源短路；培養(yǎng)物產(chǎn)生氣溶膠可能性低人員接觸污染1. 每次使用二氧化碳培養(yǎng)箱時(shí)，注意觀察二氧化碳?xì)獗?，以及培養(yǎng)箱顯示是否正常，確保電源連接正常，電源線周圍無液體存在2. 定期更換二氧化碳培養(yǎng)箱的空氣濾膜3. 嚴(yán)格規(guī)范操作，定期檢查離心機(jī)離心管發(fā)生破裂氣溶膠釋

32、放可能性低人員接觸污染配備離心機(jī)有安全套筒，可轉(zhuǎn)移到生物安全柜內(nèi)處理振蕩器產(chǎn)生氣溶膠、泄露和容器破裂可能性低人員樣品接觸污染必須使用塑料的器皿，因?yàn)椴ＡЭ赡軙?huì)破裂釋放出感染性物質(zhì)，而且可能傷及操作者。在操作結(jié)束后，容器應(yīng)在生物安全柜里才能重新啟動(dòng)冰箱保存管泄露可能性極低人員樣品接觸污染操作培訓(xùn)，做好個(gè)人防護(hù)高壓滅菌器人員接觸高溫部位，發(fā)生燙傷可能性中等人員發(fā)生燙傷操作培訓(xùn)，做好個(gè)人防護(hù)接種環(huán)滅菌器接種環(huán)滅菌器溫度過低，不能滅菌高度接種環(huán)滅菌不徹底定期檢修（三）人員1.健康監(jiān)護(hù)和健康狀況評(píng)估 BSL-3實(shí)驗(yàn)室人員每年開展健康體檢，實(shí)驗(yàn)操作前預(yù)留本底血清。BSL-3實(shí)驗(yàn)室人員健康狀況良好。2.人員

33、資質(zhì)和培訓(xùn) 我中心具有開展此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的技術(shù)和人員條件，技術(shù)上我中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開展了多年的常規(guī)結(jié)核病檢測(cè)工作，曾參與兩次WHO組織的全球結(jié)核病耐藥性監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。工作人員多年從事結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作，具有扎實(shí)的理論技術(shù)和豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。所有進(jìn)入BSL-3實(shí)驗(yàn)室人員都需經(jīng)過考察，在近期內(nèi)均接受過微生物操作技術(shù)與實(shí)驗(yàn)室安全的系統(tǒng)培訓(xùn)，并經(jīng)考核確認(rèn)適合現(xiàn)崗位工作，簽署知情同意書。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)我中心當(dāng)前及將來業(yè)務(wù)開展需要，組織制訂人員培訓(xùn)計(jì)劃。在常規(guī)微生物操作技術(shù)培訓(xùn)的基礎(chǔ)上，還需進(jìn)行消防和預(yù)備狀態(tài)、化學(xué)品安全、生物危險(xiǎn)和傳染預(yù)防、救治、緊急醫(yī)學(xué)處理措施的培訓(xùn)。并通過理論和實(shí)際操作考核評(píng)估每個(gè)工作人員對(duì)

34、提供的信息的理解力。工作人員要充分了解其實(shí)驗(yàn)工作的性質(zhì)和特點(diǎn)，并正確使用個(gè)人防護(hù)裝備。進(jìn)入BSL-3實(shí)驗(yàn)室須得到實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人的批準(zhǔn)，應(yīng)詳細(xì)登記出入時(shí)間，并保證兩名以上的人員同時(shí)進(jìn)入。實(shí)驗(yàn)人員素質(zhì)可能存在的風(fēng)險(xiǎn)及控制措施見表8-25.表8-25 XXXBSL-3實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)操作人員風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別與控制明細(xì)表潛在風(fēng)險(xiǎn)因素發(fā)生可能性后果嚴(yán)重性控制措施實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)水平技術(shù)培訓(xùn)不足或操作不熟練導(dǎo)致誤操作中實(shí)驗(yàn)人員需接受相關(guān)技術(shù)培訓(xùn)并考核合格后方能上崗；定期進(jìn)行相關(guān)培訓(xùn)及演練人員健康水平實(shí)驗(yàn)人員身體狀況不佳或患有基礎(chǔ)疾病嚴(yán)重實(shí)驗(yàn)室工作人員每年參加體檢，預(yù)留本底血清標(biāo)本；實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入BSL-3實(shí)驗(yàn)室前需

35、測(cè)量體溫，體溫高于37者不能進(jìn)入未經(jīng)授權(quán)人員未經(jīng)授權(quán)人員進(jìn)入BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)入BSL-3實(shí)驗(yàn)室須得到相關(guān)部門和實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人的批準(zhǔn)，應(yīng)詳細(xì)登記出入時(shí)間，并保證兩名以上的人員同時(shí)進(jìn)入（四）意外事件、事故帶來的風(fēng)險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)室意外事件包括感染性物質(zhì)的破碎及在臺(tái)面、地面和其他表面溢出。感染性物質(zhì)濺入眼睛，皮膚刺傷、誤接觸污染物（如標(biāo)識(shí)不清、消毒不徹底等原因）、皮膚刺傷是發(fā)生概率比較高的感染原因。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中盡量避免使用利器、實(shí)驗(yàn)時(shí)穿戴好N95口罩、眼罩及防護(hù)服，帶高質(zhì)量雙層手套，有接觸污染物時(shí)應(yīng)立即消毒并更換新的外層手套。同時(shí)，對(duì)工作臺(tái)面及發(fā)生濺灑的表面及時(shí)進(jìn)行可靠的消毒滅菌。（五）其他風(fēng)險(xiǎn)控制其

36、他風(fēng)險(xiǎn)控制包括對(duì)化學(xué)、物理、輻射、電器、水災(zāi)、火災(zāi)、自然災(zāi)害等的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。1. 工作人員實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的非生物風(fēng)險(xiǎn)（化學(xué)、物理、輻射、電氣）（1） 電氣設(shè)備安全風(fēng)險(xiǎn)。下列情況存在安全風(fēng)險(xiǎn)。電氣設(shè)備的設(shè)計(jì)及制造不符合相關(guān)安全標(biāo)準(zhǔn)的要求。需要備用電源的設(shè)備未連接備用電源。新的、改裝過的或修理過的電氣設(shè)備在未經(jīng)專業(yè)人員（如有資質(zhì)的電工或生物醫(yī)學(xué)工程師）完成電氣安全測(cè)試和設(shè)備符合安全使用要求之前使用。電氣設(shè)備使用人員未接受正確操作培訓(xùn)，操作方式不正確，降低電氣安全性。電氣設(shè)備使用人員未定期檢查設(shè)備的可能引起電氣故障的破損。非專業(yè)人員從事電氣設(shè)備和電路工作。未經(jīng)授權(quán)開展需要授權(quán)的工作。未采取措施對(duì)設(shè)備去污

37、染以減少維護(hù)人員受化學(xué)或生物性污染的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)所有電器設(shè)備未定期進(jìn)行檢查和測(cè)試，包括接地系統(tǒng)。在實(shí)驗(yàn)室電路中未配置斷路器和漏電保護(hù)器。斷路器不能保護(hù)人，只是用來保護(hù)線路不發(fā)生電流超負(fù)荷從而避免火災(zāi)。漏電保護(hù)器用于保護(hù)人員而避免觸電。實(shí)驗(yàn)室的所有電器未接地，未采用三相插頭。實(shí)驗(yàn)室的所有電器設(shè)備和線路不符合國家電氣安全標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。（2） 化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。 下列情況存在安全風(fēng)險(xiǎn)可能通過下列方式暴露于危險(xiǎn)性化學(xué)品：吸入，接觸，食入，針刺，通過破損皮膚。化學(xué)品的毒性作用在操作某些化學(xué)品或吸入它們的蒸汽時(shí)會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生不良影響。除了眾所周知的毒性物質(zhì)以外，已知許多化學(xué)品都有不同的毒性作用，可能對(duì)于呼吸系統(tǒng)、血液

38、、肺、肝臟、腎臟和胃腸道系統(tǒng)，以及其他器官和組織造成不良影響或嚴(yán)重?fù)p害，而有些化學(xué)品具有致癌性或致畸性。有些可溶性蒸汽在吸入后是有毒性作用的。除了上面所提到的許多嚴(yán)重影響外，發(fā)生暴露時(shí)還可能導(dǎo)致一些不能被立即識(shí)別的對(duì)人體健康的損傷，其中可能包括協(xié)調(diào)性差、嗜睡及類似的癥狀，并使出現(xiàn)事故的可能性增大。長期反復(fù)接觸許多液態(tài)有機(jī)溶劑可能造成皮膚損害，這可能是由于有機(jī)溶劑的去脂效果，另外還可能出現(xiàn)過敏和腐蝕癥狀。實(shí)驗(yàn)室未按要求保存滿足日常使用量的化學(xué)品。大量的化學(xué)品未儲(chǔ)存在專門指定的房間或建筑物內(nèi)。相容化學(xué)品未分類存放。爆炸性化學(xué)品如疊氮化物，通常用作溶液中的抗菌劑，由于輕微碰撞就可能造成疊氮化銅的猛烈

39、爆炸。因此，疊氮化物不應(yīng)該與銅或鉛（如污水管以及管道設(shè)施）接觸。乙醚老化和干燥形成結(jié)晶后極不穩(wěn)定，可能會(huì)爆炸。高氯酸如果在木制品、磚砌或纖維性物質(zhì)上干燥時(shí)，一旦碰撞，會(huì)發(fā)生爆炸并引起火災(zāi)?？辔端岷涂辔端猁}在加熱和撞擊時(shí)會(huì)發(fā)生爆炸?；瘜W(xué)品可能溢出造成人員傷害，未能及時(shí)獲得化學(xué)品溢出處理的示意圖和工具盒。（3） 輻射風(fēng)險(xiǎn)。 本實(shí)驗(yàn)室不涉及此類風(fēng)險(xiǎn)。（4） 物理風(fēng)險(xiǎn)。 本實(shí)驗(yàn)不涉及此類風(fēng)險(xiǎn)。2. 防護(hù)屏障的風(fēng)險(xiǎn)（正常運(yùn)行、錯(cuò)誤使用、功能失常、清潔、維護(hù)和關(guān)停期間）（1） 生物安全柜。 如果沒有按照設(shè)備操作規(guī)程或使用說明書進(jìn)行操作、維護(hù)，可能使生物安全柜的氣溶膠防護(hù)效果明顯降低或消失，失去安全防護(hù)效果。如果設(shè)備因長時(shí)間使用不能及時(shí)更換HEPA，則使用期內(nèi)的功能