酶的抑制劑與激活劑

1、酶的抑制劑與激活劑授課教師: 余子全研 究 生: 賈亮 何戀一.目的與內(nèi)容 目的：學(xué)習(xí)研究酶的抑制劑和激活劑的方法，并通過幾種金屬離子和表面活性劑對(duì)枯草桿菌堿性蛋白酶活力的影響，篩選出該酶的某些抑制劑和激活劑。 內(nèi)容：1.幾種金屬離子Ca2+、Ag+、Cu2+、Hg2+和Mg2+對(duì)枯草桿菌堿性蛋白酶活力的影響；2.洗衣粉對(duì)枯草桿菌堿性蛋白酶活力的影響。二.基本原理 酶分子與配體結(jié)合后，可以改變酶的活性。使酶活性降低乃至完全喪失活性的配體，稱為酶的抑制劑；能啟動(dòng)和（或）增強(qiáng)酶的活性，稱為酶的激活劑。研究酶的抑制和激活作用，具有重要的實(shí)用價(jià)值。 抑制劑或激活劑的作用部位，主要是酶的活性中心的必要基

2、團(tuán)或直接影響酶的結(jié)構(gòu)殘基所引起的效應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)所用的是枯草桿菌堿性蛋白酶，該酶是由地衣芽孢桿菌經(jīng)深層發(fā)酵提煉所得，能將大分子蛋白質(zhì)水解成游離的氨基酸等產(chǎn)物，最適pH值一般為9-11，最適溫度為40-50。 Folin-酚法測(cè)堿性蛋白酶酶活原理 Folin-酚試劑在堿性條件下，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。 在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色深淺與含酚羥基氨基酸 (酪氨酸)的量成正比，通過比較加入金屬離子(或洗衣粉)后和未加入金屬離子(或洗衣粉)的反應(yīng)酶液的OD680值，可以推斷出該種金屬離子是該酶的激活劑還是抑制劑。 三.器材和用具1.恒溫水浴鍋，試管，722紫

3、外可見分光光度計(jì)，移液槍，EP管，試管架。2.試劑：20mM/L氯化鈣， 20mM/L硝酸銀， 20mM/L硫酸銅， 20mM/L氯化汞， 20mM/L氯化鎂，0.6洗衣粉， 0.4 mol/L 碳酸鈉， 2酪蛋白，枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(稀釋2000倍)，福林-酚(市售福林-酚試劑加水稀釋1倍，約為1 mol/L )， 0.5M/L氫氧化鈉，pH10硼砂緩沖液，pH7磷酸緩沖液， 10% TCA。四四. .操作步驟操作步驟1金屬離子對(duì)酶活力的影響：金屬離子對(duì)酶活力的影響：(1)分別將1ml pH 10.0酶液與相應(yīng)體積的氯化鈣、硝酸銀、硫酸銅、氯化汞、氯化鎂溶液混合，使反應(yīng)液中金屬離子終濃度

4、分別為0.8 mmol/L和0.4mmol/L。(2)混合液及pH10原酶液、 pH10空白(共12支)25放置20 min。(3)將混合液預(yù)熱至40，加入預(yù)熱的2%酪蛋白溶液1 ml，于40反應(yīng)10 min。(4)反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入10%三氯醋酸溶液2 ml(終止反應(yīng)) ，立即搖勻，靜置10 min。(5)各取上清1.5ml于EP管中，6000rpm,離心1min 。取上清1ml于試管中，各加入0.4 mol/L Na2CO3溶液5ml及福林一酚試劑1 ml，置于40顯色15 min 。(6)測(cè)定OD680值 ，并以原酶活力為100，算出相對(duì)酶活?？瞻自囼?yàn)時(shí)，先加三氯醋酸溶液，再加入酶液和底物，

5、同樣測(cè)定OD680值。 2洗衣粉對(duì)酶活力的影響：洗衣粉對(duì)酶活力的影響：(1)分別在pH 7.0和pH 10.0酶液中加入洗衣粉(反應(yīng)液終濃度為0.03%)。(2)混合液和pH7原酶液、 pH7空白(共4支)于25下放置20 min。(3)測(cè)酶活力，并以原酶活力為100，算出相對(duì)酶活。五.注意事項(xiàng)1.實(shí)驗(yàn)中，以先加TCA的酶液為空白，以原酶液試管為 標(biāo)準(zhǔn)液，對(duì)其操作應(yīng)與實(shí)驗(yàn)試管同步一致。2.由于分光光度計(jì)比較精密，所以往試管中加藥品的 時(shí)候要盡量做到準(zhǔn)確。3.拿比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接觸它的光滑 面；擦拭比色皿要順著一個(gè)方向擦。4.在比色皿中裝入的液體量大約是比色皿體積的三分之二。六.實(shí)驗(yàn)報(bào)告 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填入下表中。 表1 金屬離子對(duì)酶活力的影響金屬離子剩余活力相對(duì)活力Ca2+0.8 mmol/L 1000.4mmol/L 100Ag+0.8 mmol/L 1000.4 mmol/L 100 Cu2+0.8 mmol/L 1000.4mmol/L 100Hg2+0.8 mmol/L 1000.4 mmol/L 100Mg2+0.8 mmol/L 1000.4 mmol/L 100表2 洗衣粉對(duì)酶活力的影響 剩余酶活 相對(duì)酶活標(biāo)準(zhǔn)pH7.0 酶 100pH10.0 酶 100洗衣粉pH7.0酶 100pH10.0 酶 100八.問題與思考 1