第八章離子交換層析Ⅱ

1、第八章 離子交換法n第六節(jié) 新型離子交換劑n第七節(jié) 應(yīng)用實例n第八節(jié) 離子交換聚集色譜第七節(jié) 新型離子交換樹脂n一、大孔、均孔樹脂一、大孔、均孔樹脂q1.大孔型離子交換樹脂（大孔型離子交換樹脂（MP）q2.均孔型離子交換樹脂均孔型離子交換樹脂 ( IR )n二、多糖基離子交換劑二、多糖基離子交換劑q1.離子交換纖維素離子交換纖維素q2.葡聚糖凝膠離子交換劑葡聚糖凝膠離子交換劑大孔型與凝膠型離子交換樹脂物理性質(zhì)大孔型與凝膠型離子交換樹脂物理性質(zhì)4一、大孔、均孔樹脂n 大孔離子交換樹脂具有和大孔吸附劑相同的骨架結(jié)構(gòu)，在大孔吸附劑合成后（加入致孔劑），再引入化學(xué)功能基團，便可得到大孔離子交換樹脂1.

2、大孔型離子交換樹脂（大孔型離子交換樹脂（MP）n特征：n骨架交聯(lián)度高，較好的化學(xué)、物理性能穩(wěn)定性、機械強度n孔徑大、不受環(huán)境影響的永久性孔隙，動力學(xué)性能好，抗污染能力強，交換速度快，有利大分子交換n表面積大、吸附能力強n孔隙率大、比重小，對小離子的體積交換量比凝膠型樹脂小大孔型離子交換樹脂主要特性 72.均孔型離子交換樹脂（均孔型離子交換樹脂（IR）n主要是主要是陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂。n骨架的交聯(lián)度比較均勻。骨架的交聯(lián)度比較均勻。n交聯(lián)度均勻，孔徑大小一致，交換容量都交聯(lián)度均勻，孔徑大小一致，交換容量都較高，膨脹度、機械強度好。較高，膨脹度、機械強度好。8二、多糖基離子交換劑二、多糖基

3、離子交換劑 n生物大分子對離子交換的要求生物大分子對離子交換的要求: : 固相載體具有固相載體具有親水性親水性和較大的和較大的交換空間交換空間; ;n 對其生物活性有穩(wěn)定作用，并便于洗脫。對其生物活性有穩(wěn)定作用，并便于洗脫。n生物來源穩(wěn)定的高聚物生物來源穩(wěn)定的高聚物多糖作載體。多糖作載體。n多糖基離子交換劑可以分為：多糖基離子交換劑可以分為：n 離子交換纖維素離子交換纖維素n 葡聚糖離子交換劑葡聚糖離子交換劑 9n 樹脂骨架:纖維素 1）根據(jù)活性基團的性質(zhì)可分:q 陽離子交換纖維素q 陰離子交換纖維素1.離子交換纖維素離子交換纖維素11常用的離子交換纖維素常用的離子交換纖維素n羧甲基纖維素（羧

4、甲基纖維素（CM-C）：弱酸性陽離子）：弱酸性陽離子交換纖維素，交換纖維素，pK=3.6 。n二乙基氨基乙基纖維素（二乙基氨基乙基纖維素（DEAE-C）：強）：強堿型陰離子交換纖維素，堿型陰離子交換纖維素，pK=9.1。122）離子交換纖維素特點：）離子交換纖維素特點：n(1)(1)開放的長鏈骨架，開放的長鏈骨架，親水性強親水性強，表面積大，易，表面積大，易吸附吸附大分子大分子。n(2)(2)交換交換基團稀疏基團稀疏，對大分子的實際交換容量大。，對大分子的實際交換容量大。 n(3)(3)吸附力弱，吸附力弱，交換和洗脫條件緩和交換和洗脫條件緩和，不宜變性。，不宜變性。n（4 4）分辨率高。）分辨

5、率高。133）離子交換纖維素的操作）離子交換纖維素的操作操作方式操作方式n可靜態(tài)交換，也可動態(tài)交換?？伸o態(tài)交換，也可動態(tài)交換。n交換基團密度低、吸附力弱。總交換容量低，緩交換基團密度低、吸附力弱?？偨粨Q容量低，緩沖鹽濃度不宜高沖鹽濃度不宜高（控制在（控制在0.0010.02 mol/L）。 14離子交換纖維素的選擇n正電荷-陽離子 負(fù)電荷-陰離子n根據(jù)等電點和溶液的pH確定帶點狀態(tài)，考慮物質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解度及交換劑的解離度，選擇合適的pH范圍離子交換纖維素的解吸 n洗脫緩和洗脫緩和。n升高環(huán)境的升高環(huán)境的pH、降低、降低pH或是增加離子強度都能將被或是增加離子強度都能將被吸附物質(zhì)洗脫下來。吸附

6、物質(zhì)洗脫下來。n 16離子交換纖維素的處理和再生 n酸堿濃度要適當(dāng)降低，酸堿濃度要適當(dāng)降低，處理時間也從處理時間也從4h縮短縮短為為0.31h。n以交換緩沖液平衡。以交換緩沖液平衡。n注意：注意：n不耐酸，用酸處理的濃度和時間須小心控制。不耐酸，用酸處理的濃度和時間須小心控制。17n2.葡聚糖凝膠離子交換樹脂和瓊脂糖凝膠離葡聚糖凝膠離子交換樹脂和瓊脂糖凝膠離子交換樹脂子交換樹脂n骨架:葡聚糖凝膠(sephadex)和瓊脂糖凝膠（sepharose)n分陽離子交換和陰離子交換樹脂n命名方法： 交換活性基團+原骨架編號 CM-sephadex C-25（羧甲基纖維素） DEAE-sephadex

7、A-25(二乙胺基乙基纖維素） A陰離子 C 陽離子n特點：除了具有離子交換功能以外、兼有分子篩的功能，提高了分離的效率常用的離子交換葡聚糖20第七節(jié) 應(yīng)用實例n分離純化分離純化氨基酸制備氨基酸制備n無鹽水制備無鹽水制備211.氨基酸制備、分離氨基酸制備、分離n豬血粉水解制備豬血粉水解制備6種種氨氨基酸基酸:222.無鹽水制備無鹽水制備n無鹽水制備是利用無鹽水制備是利用氫型氫型陽離子交換樹脂和陽離子交換樹脂和羥型羥型陰離子交換樹脂的組合以陰離子交換樹脂的組合以除去水中所有的離子除去水中所有的離子，其反應(yīng)式如下：其反應(yīng)式如下：23n當(dāng)對水質(zhì)要求高時，經(jīng)過一次組合脫鹽，還達不到當(dāng)對水質(zhì)要求高時，經(jīng)

8、過一次組合脫鹽，還達不到要求，可采用兩次組合要求，可采用兩次組合:n強酸強酸弱堿弱堿強酸強酸強堿強堿；n強酸強酸強堿強堿混合床混合床?；旌洗不旌洗瞡混合床系將陽、陰兩種樹脂混合而成，脫鹽效果混合床系將陽、陰兩種樹脂混合而成，脫鹽效果好好。n混合床中所發(fā)生的反應(yīng)混合床中所發(fā)生的反應(yīng):24混合床無鹽水混合床無鹽水25圖8.20 混合床的操作(a)為水制備時的情形；(b)為制備結(jié)束，用水逆流沖洗。陽、陰樹脂根據(jù)比重不同分層，一般陽樹脂較陽、陰樹脂根據(jù)比重不同分層，一般陽樹脂較重在下面，陰樹脂在上面；重在下面，陰樹脂在上面；(c)為上部、下部同時通入堿、酸再生，廢液自中間排出；(d)為再生結(jié)束，通入空

9、氣，將陽、陰樹脂混合、準(zhǔn)備制水 第八節(jié) 離子交換聚焦色譜 n色譜聚焦（色譜聚焦（chromatofocusing）: 是一種高分是一種高分辨的新型的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。辨的新型的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。是根據(jù)蛋白質(zhì)的等是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點，結(jié)合離子交換技術(shù)的大容量色譜電點，結(jié)合離子交換技術(shù)的大容量色譜，能分離，能分離幾百毫克蛋白質(zhì)樣品，洗脫峰被聚焦效應(yīng)濃縮，幾百毫克蛋白質(zhì)樣品，洗脫峰被聚焦效應(yīng)濃縮，分辨率高。分辨率高。n適用適用水溶性的兩性分子水溶性的兩性分子，如蛋白質(zhì)、酶、多肽、，如蛋白質(zhì)、酶、多肽、核酸等。核酸等。 26一、色譜聚焦的原理一、色譜聚焦的原理n（一）（一）自動形成自動形成pH梯度梯度。n

10、（二）（二）蛋白質(zhì)的色譜行為蛋白質(zhì)的色譜行為n（三）（三）聚焦效應(yīng)聚焦效應(yīng) 27（一）（一）PH梯度溶液的形成梯度溶液的形成n利用離子交換劑本身的帶電基團的緩沖作用，當(dāng)洗脫緩沖液不斷滴到離子交換柱時，柱內(nèi)自動形成pH梯度28PBE94柱聚焦色譜的柱聚焦色譜的pH梯度梯度29n（1）柱內(nèi)每點的柱內(nèi)每點的PH值從高到低逐漸下降值從高到低逐漸下降。n（2）從層析柱頂部到）從層析柱頂部到底部就形成了底部就形成了PH69的梯度。的梯度。n（3）PH梯度會逐漸梯度會逐漸向下遷移。向下遷移。n（4）底部流出液的底部流出液的PH由由9逐漸降至逐漸降至6。（二）蛋白質(zhì)的色譜行為（二）蛋白質(zhì)的色譜行為n當(dāng)柱中當(dāng)柱

11、中PH低于蛋白質(zhì)的低于蛋白質(zhì)的PI時，蛋白質(zhì)帶時，蛋白質(zhì)帶正電荷正電荷，不與陰離于交換劑，不與陰離于交換劑結(jié)合結(jié)合,隨洗脫液向下移動隨洗脫液向下移動 。n當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動至環(huán)境當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動至環(huán)境PH高于其高于其PI時，蛋白質(zhì)時，蛋白質(zhì)由帶正電荷變?yōu)閹ж?fù)電由帶正電荷變?yōu)閹ж?fù)電荷荷，并與，并與陰離子交換劑結(jié)合陰離子交換劑結(jié)合。n由于洗脫劑的通過，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境由于洗脫劑的通過，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境PH 再次低于再次低于PI時，它又帶時，它又帶正電荷正電荷，并，并從交換劑解吸下來從交換劑解吸下來而下降而下降 。n移至移至pH大于大于PI時又重新結(jié)合，直至蛋白質(zhì)從柱下流出。時又重新結(jié)合，直至蛋白質(zhì)從柱下流出

12、。n n不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，在被離子交換劑結(jié)合以前，不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，在被離子交換劑結(jié)合以前，移動距移動距離離是不同的，洗脫出來的先后次序是按等電點排列的。是不同的，洗脫出來的先后次序是按等電點排列的。30（三）聚焦效應(yīng)（三）聚焦效應(yīng)n當(dāng)一種蛋白質(zhì)在柱上隨洗脫液下移至等當(dāng)一種蛋白質(zhì)在柱上隨洗脫液下移至等電點處時，移動速度明顯減慢。電點處時，移動速度明顯減慢。n此時加上此時加上相同相同的的第二個樣品第二個樣品，它將以洗，它將以洗脫液移動的速度下降，直至追到正在慢脫液移動的速度下降，直至追到正在慢移的第一個樣品（移的第一個樣品（聚焦聚焦）。）。n如果加入的第二個樣品的等電點比第一

13、如果加入的第二個樣品的等電點比第一個樣品高，它可以越過第一個樣品區(qū)先個樣品高，它可以越過第一個樣品區(qū)先被洗脫出來。被洗脫出來。 31 抹香鯨肌紅蛋白 (pI = 8.2) 追過 馬肌紅蛋白 (pI = 7.4)二、多緩沖劑 n多緩沖劑是一種兩性電解質(zhì)緩沖劑，是多緩沖劑是一種兩性電解質(zhì)緩沖劑，是分子量分子量大小不同的多種組分的多羧基多氨基化合物大小不同的多種組分的多羧基多氨基化合物。nPolybuffer96 PBE94（pH69）nPolybuffer74 PBE94 （pH47）33三、多緩沖交換劑 nPBE94是以是以交聯(lián)瓊脂糖交聯(lián)瓊脂糖6B（Sepharose 6B）為載）為載體，并在糖

14、基上通過醚鍵偶合上配基制成的體，并在糖基上通過醚鍵偶合上配基制成的多緩沖多緩沖交換劑，是交換劑，是陰離子交換劑陰離子交換劑。n當(dāng)當(dāng)Polybuffer96流進多緩沖交換劑時，流進多緩沖交換劑時，PH梯度溶液梯度溶液可以自動形成（可以自動形成（96）。3435四、操作步驟凝膠柱的準(zhǔn)備凝膠柱的準(zhǔn)備n（1）凝膠按）凝膠按1 1懸浮于懸浮于起始緩沖液起始緩沖液中，除氣泡。中，除氣泡。n（2）柱垂直除底部尼龍網(wǎng)下的氣泡，關(guān)閉柱下端出）柱垂直除底部尼龍網(wǎng)下的氣泡，關(guān)閉柱下端出口。口。n（3）在柱中放）在柱中放23ml起始緩沖液，攪拌下緩緩倒入。起始緩沖液，攪拌下緩緩倒入。n（4）打開柱底部開關(guān)，待凝膠沉降后將柱頂部接頭）打開柱底部開關(guān)，待凝膠沉降后將柱頂部接頭裝好。裝好。n（5