第八章DNA或蛋白質(zhì)的化學修飾與基因表達

1、第八章第八章DNA或蛋白質(zhì)的化學修或蛋白質(zhì)的化學修飾與基因表達飾與基因表達 一、一、 DNA甲基化與基因表達甲基化與基因表達 二、二、 蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達 三、三、 基因重排的分子機制基因重排的分子機制 一、一、 DNA甲基化與基因表達甲基化與基因表達 DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。 1DNA甲基化的主要形式甲基化的主要形式 5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出現(xiàn)在CpG和CpXpG中，原核生物中CCA/TGG和GA

2、TC也常被甲基化。 真核生物細胞內(nèi)存在兩種甲基化酶活性：一種被稱為日常型（mainte-nance）甲基轉(zhuǎn)移酶，另一種是 從頭合成（denovo synthesis）甲基轉(zhuǎn)移酶。前者主要在甲基化母鏈（模板鏈）指導下使處于半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對應的胞嘧啶甲基化。日常型甲基轉(zhuǎn)移酶常常與DNA內(nèi)切酶活性相耦聯(lián)，有3種類型。II類酶活性包括內(nèi)切酶和甲基化酶兩種成分，而I類和III類都是雙功能酶，既能將半甲基化DNA甲基化，又能降解外源無甲基化DNA。 由于甲基化胞嘧啶極易在進化中丟失，所以，高等真核生物中CG序列遠遠低于其理論值。哺乳類基因組中約存在4萬個CG islands，大多

3、位于轉(zhuǎn)錄單元的5區(qū)。 沒有甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用，就可能被氧化成為U，被DNA修復系統(tǒng)所識別和切除，恢復成C。已經(jīng)甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用, 它就變?yōu)門, 無法被區(qū)分。因此, CpG序列極易丟失。 2甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制 甲基化導致某些區(qū)域DNA構象變化，從而影響了蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，抑制了轉(zhuǎn)錄因子與啟動區(qū)DNA的結合效率。 對弱啟動子來說，少量甲基化就能使其完全失去轉(zhuǎn)錄活性。當這類啟動子被增強時，即使不去甲基化也可以恢復其轉(zhuǎn)錄活性。甲基化密度較高時，即使增強后的啟動子仍無轉(zhuǎn)錄活性。 因為甲基化對轉(zhuǎn)錄的抑制強度與MeCP1（methylCpG-bin

4、ding protein1）結合DNA的能力成正相關，甲基化CpG的密度和啟動子強度之間的平衡決定了該啟動子是否具有轉(zhuǎn)錄活性。DNA甲基化對基因轉(zhuǎn)錄的抑制直接參與了發(fā)育調(diào)控。隨著個體發(fā)育，當需要某些基因保持沉默時，它們將迅速被甲基化，若需要恢復轉(zhuǎn)錄活性，則去甲基化。I DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的直接機制某些轉(zhuǎn)錄因子的結合位點內(nèi)含有CpG序列，甲基化以后直接影響了蛋白質(zhì)因子的結合活性，不能起始基因轉(zhuǎn)錄。II. 甲基化抑制轉(zhuǎn)錄的間接機制CpG甲基化，通過改變?nèi)旧|(zhì)的構象或者通過與甲基化CpG結合的蛋白因子間接影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結合。 與不含甲基化的染色質(zhì)相比，甲基化后染色質(zhì)對于核酸酶或限制性內(nèi)

5、切酶的敏感度下降，更容易與組蛋白H1相結合，說明甲基化與非甲基化DNA在構象上有差異。已經(jīng)分離純化了數(shù)個與甲基化DNA特異結合的蛋白質(zhì)。MeCP1可以與至少12個對稱的甲基化CpG結合，而MeCP2僅同單個甲基化的CpG序列結合。 3DNA甲基化與甲基化與X染色體失活染色體失活 雌性胎生哺乳類動物細胞中兩條X染色體之一在發(fā)育早期隨機失活，以確保其與只有一條X染色體的雄性個體內(nèi)X染色體基因的劑量相同。一旦發(fā)生X染色體失活，使該細胞有絲分裂所產(chǎn)生的后代都保持同一條X染色體失活。 科學家發(fā)現(xiàn)，在X染色體上存在一個與X染色體失活有密切聯(lián)系的核心部位稱為X染色體失活中心（X-chromosome ina

6、ctivation center，Xic），定位在Xq13區(qū)（正好是Barr氏小體濃縮部位）。 Xi-specific transcript (Xist)基因只在失活的X染色體上表達，其產(chǎn)物是一功能性RNA，沒有ORF卻含有大量的終止密碼子。實驗證明，Xist RNA分子能可能與Xic位點相互作用，引起后者構象變化，易于結合各種蛋白因子，最終導致X染色體失活。二、二、 蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達 蛋白質(zhì)的磷酸化反應是指通過酶促反應把磷酸基團從一個化合物轉(zhuǎn)移到另一個化合物上的過程,是生物體內(nèi)存在的一種普遍的調(diào)節(jié)方式，在細胞信號的傳遞過程中占有極其重要的地位。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)有

7、多達2000個左右的蛋白質(zhì)激酶和1000個左右的蛋白質(zhì)磷酸酶基因。蛋白質(zhì)的磷酸化是指由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過程，其逆轉(zhuǎn)過程是由蛋白質(zhì)磷酸酶催化的，稱為蛋白質(zhì)脫磷酸化。 1 蛋白質(zhì)磷酸化在細胞信號轉(zhuǎn)導中的作用蛋白質(zhì)磷酸化在細胞信號轉(zhuǎn)導中的作用(1). 在胞內(nèi)介導胞外信號時具有專一應答特點。與信號傳遞有關的蛋白激酶類主要受控于胞內(nèi)信使，如cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油，diacyl glycerol）等，這種共價修飾調(diào)節(jié)方式顯然比變構調(diào)節(jié)較少受胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的影響。 (2).蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化控制了細胞內(nèi)已有的酶“活性”。與酶的重新合成

8、及分解相比，這種方式能對外界刺激做出更迅速的反應。(3).對外界信號具有級聯(lián)放大作用；(4).蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化保證了細胞對外界信號的持續(xù)反應。被磷酸化的主要氨基酸殘基：絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。組氨酸和賴氨酸殘基也可能被磷酸化。2. 真核細胞主要跨膜信號轉(zhuǎn)導途徑真核細胞主要跨膜信號轉(zhuǎn)導途徑 3. 蛋白激酶的種類與功能蛋白激酶的種類與功能 根據(jù)底物蛋白質(zhì)被磷酸化的氨基酸殘基的種類可分為三大類： 第一類為絲氨酸/蘇氨酸型。這類蛋白激酶使底物蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化第二類為酪氨酸型。被磷酸化的是底物的酪氨酸殘基。第三類是雙重底物特異性蛋白激酶（dual-specificity prot

9、ein kinase），既可使絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化又可使酪氨酸殘基磷酸化。 根據(jù)是否有調(diào)節(jié)物來分又可分成兩大類： 信使依賴性蛋白質(zhì)激酶（messenger-dependent protein kinase），包括胞內(nèi)第二信使或調(diào)節(jié)因子依賴性蛋白激酶及激素（生長因子）依賴性激酶兩個亞類； 非信使依賴型蛋白激酶。4. 受受cAMP調(diào)控的調(diào)控的A激酶激酶 被A激酶磷酸化的蛋白質(zhì)其N端上游往往存在兩個或兩個以上堿性氨基酸，特異氨基酸的磷酸化（X-Arg-Arg-X-Ser-X）改變了這一蛋白的酶活性。這一酶活性代表了絕大多數(shù)細胞中cAMP所引起的全部反應。PKA全酶由4個亞基組成(R2C2）包括兩

10、個相同的調(diào)節(jié)亞基（R）和兩個相同的催化亞基（C）。全酶的分子量為150-170kD。 C亞基具有催化活性，R亞基具有調(diào)節(jié)功能，有兩個cAMP結合位點。R亞基對C亞基具有抑制作用，所以，R和C聚合后的全酶（R2C2）無催化活性。R亞基與cAMP的結合導致C亞基解離并表現(xiàn)出催化活性。 激素與其受體在肌肉細胞外表面相結合，誘發(fā)細胞質(zhì)cAMP的合成并活化A激酶，再將活化磷酸基團傳遞給無活性的磷酸化酶激酶，活化糖原磷酸化酶，最終將糖原磷酸化，進入糖酵解并提供ATP。5. C激酶與激酶與PIP2、IP3和和DAG 磷酸肌醇級聯(lián)放大的細胞內(nèi)信使是磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）的兩個酶解 產(chǎn)物：肌醇1

11、，4，5-三磷酸（IP3）和二?；视停―AG）。C激酶（PKC）是依賴于Ca2+的蛋白質(zhì)激酶。由于IP3所引起的細胞質(zhì)Ca2+濃度升高，導致C激酶從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到靠原生質(zhì)膜內(nèi)側(cè)處，并被DAG和Ca2+的雙重影響所激活。 C激酶的活性也受磷脂酰絲氨酸的影響，原因是后者大大提高了C激酶對于Ca2+的親和力，從而使得C激酶能被生理水平的Ca2+離子所活化。C激酶主要實施對絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化，它具有一個催化結構域和一個調(diào)節(jié)結域。6. CaM激酶及激酶及MAP激酶激酶 Ca2+的細胞學功能主要通過鈣調(diào)蛋白激酶（CaM-kinase）來實現(xiàn)，它們也是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，但僅應答于細胞內(nèi)Ca2+水平。

12、MAP激酶（mitogen-activated proteinkinase, MAP-kinase，又稱為extracellular-signal-regulated kinase，ERKS）活性受許多外源 細胞生長、分化因子的誘導，也受到酪氨酸蛋白激酶及G蛋白受體系統(tǒng)的調(diào)控。MAP-激酶的活性取決于該蛋白中僅有一個氨基酸之隔的酪氨酸、絲氨酸殘基是否都被磷酸化?？茖W家把能同時催化這兩個氨基酸殘基磷酸化的酶稱為MAP-激酶-激酶，它的反應底物是MAP激酶。MAP-激酶-激酶本身能被MAP-激酶-激酶-激酶所磷酸化激活，后者能同時被C激酶或酪氨酸激酶家族的Ras蛋白等激活，從而在信息傳導中發(fā)揮功能

13、。7. 酪氨酸蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶 對于許多生長因子受體的研究表明，跨膜的酪氨酸蛋白激酶在信息傳遞過程中起著重要作用。表皮生長因子（EGF）、胰島素樣生長因子（IGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、神經(jīng)生長因子（NGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）和血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）受體都擁有定位于胞內(nèi)的酪氨酸激酶功能區(qū)域和膜外區(qū)。 具有受體功能的酪氨酸 蛋白激酶 (receptor protein tyrosine kinase, RPTK)。包括三個結構域：胞外的配體結合區(qū)，細胞內(nèi)部具有酪氨酸蛋白激酶活性的區(qū)域和連接這兩個區(qū)域的跨膜結構。胞外配體結合區(qū)：RPTK的N端大約500-85

14、0個氨基酸組成親水性胞外配體結合區(qū)域，氨基酸序列變化較大，是不同RPTK與相應配體特異性結合的結構基礎。 跨膜結構區(qū)：是連接受體細胞內(nèi)、外兩部分，鑲嵌在細胞膜中的結構，在靠近膜內(nèi)側(cè)C端常常是由堿性氨基酸形成簇狀結構。胞內(nèi)活性區(qū)：保守性較高，由三個不同的部分組成。與跨膜區(qū)相連的近膜區(qū)包括41-50個氨基酸，可能是RPTK活性的功能的調(diào)節(jié)部位。第二部分為活性位點所在的催化區(qū)，其氨基酸組成具有很高的保守性。該區(qū)含有ATP結合位點和底物結合位點，可能是不同類型RPTK底物特異性的決定區(qū)域。第三部分是多變的C末端，包括70-200個氨基酸，主要是由小分子量氨基酸組成的親水性結構，具有高度的可塑性。 沒有

15、Cyclin，CDK無活性。 Cyclin的合成和積累。 形成Cyclin和CDK復合物。Tyr磷酸化阻礙了ATP的結合，CDK仍然無活性。 T-環(huán)中的Thr被磷酸化，Tyr上的磷酸基團被去掉，CDK活性大為增強。 CDK使磷酸酯酶磷酸化，進一步提高其活性。 CDK使DBRP磷酸化，具有酶活性。 在DBRP的幫助下，泛素連接酶把泛素加到Cyclin上。 Cyclin被降解，CDK失活。見Lehninger, figure 13-33。 CDK通過蛋白質(zhì)磷酸化過程控制細胞分裂。沒有被磷酸化的PRb能與轉(zhuǎn)錄因子E2F相結合并使后者不能激活一系列與DNA合成有關的酶，導致細胞無法由G1進入S。 er

16、bB原癌基因其實編碼了一個突變的EGF受體蛋白，它的胞內(nèi)激酶活性區(qū)被永久性激活（相當于EGF到正常EGF受體上）。因此，erbB導致了細胞的永久型分裂。8. 蛋白磷酸酯酶蛋白磷酸酯酶 Ser/Thr蛋白磷酸酯酶主要包括：PP-1，PP-2A，PP-2B和PP-2C四類。 PP-1是糖代謝中的一個關鍵酶，具有很高的活性，其催化亞基為38kDa，可以與其它組分或調(diào)節(jié)亞基組成全酶。PP-2A全酶包括一個36kDa的催化亞基和一個65kDa的調(diào)節(jié)亞基。PP-2B是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca和CaM調(diào)節(jié)的蛋白磷酸酶,催化了磷酸化酶激酶亞基的脫磷酸化作用。由61kDa的A亞基和16kDa的B亞基組成。A為催化

17、亞基。PP-2C的分子量為43-48kDa，其活性需要mmol/L水平的Mg2+，現(xiàn)對其參與調(diào)節(jié)的生理過程知之甚少。 酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP）主要有:胞內(nèi)型，跨膜受體型。兩類PTP的共同點是它們 的催化域中氨基酸順序極為相似，共有240個氨基酸，內(nèi)含-HCXGXXR（S/T）G-的signature motif。胞內(nèi)型PTP只有一個催化域。受體型中常有兩個催化區(qū)，其不同類型的胞外結構往往不同。PTP1B（胞內(nèi)型）是一個37kDa的胞內(nèi)酶，在氨基酸水平上與CD45（跨膜受體型）的胞內(nèi)部分有很高的同源性。 CD45是一類在結構上相關的，高分子量（150-280kD）跨膜蛋白，具有與受體極為相似的

18、結構特點，在免疫T細胞和B細胞中含量極高。 9.蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達 處于信號傳遞鏈終端的蛋白質(zhì)磷酸化既能對許多酶蛋白及生理代謝過程起直接的調(diào)節(jié)作用，又能通過使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化來調(diào)節(jié)基因活性。a. 對轉(zhuǎn)錄因子核定位的調(diào)節(jié) SV40抗原未磷酸化時存在于胞質(zhì)，其111和112位殘基被酪蛋白激酶II（CKII）磷酸化后，其分子內(nèi)的核轉(zhuǎn)位信號結構域(nuclear transport signal，NTS)變構而易于進入細胞核發(fā)揮作用。 轉(zhuǎn)錄因子SWI5只在G1期存在于細胞核內(nèi)，激活核酸內(nèi)切酶基因轉(zhuǎn)錄。在其它時期則以磷酸化的形式存在于細胞質(zhì)中。CdC2使其核轉(zhuǎn)位信號結構域附近的3

19、個Ser殘基磷酸化，使之無法進入核內(nèi)，失去激活基因轉(zhuǎn)錄功能。 有時轉(zhuǎn)錄因子上存在一種抑制結構（R），掩蓋了它的NTS功能區(qū)， 從而不能進入核內(nèi)；磷酸化使該區(qū)暴露，從而易于進入核內(nèi)。有時，非磷酸化狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄因子與胞質(zhì)錨定或抑制亞基結合，掩蓋其NTS結構使之不能進入核內(nèi)。當轉(zhuǎn)錄因子本身或者其抑制亞基被磷酸化，使NTS結構暴露，進入核內(nèi)發(fā)揮功能。轉(zhuǎn)錄因子NF-KB常與IKB結合成復合體存在于胞質(zhì)中。只有在被各種刺激因子或佛波脂（PKC激活劑）作用后IKB磷酸化并與NF-KB解離，后者才能進入核內(nèi)。b. 對轉(zhuǎn)錄因子DNA結合活性的調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子上的DNA結合結構域（DBD）或其附近殘基被磷酸化后，由于負電荷增加而減弱了轉(zhuǎn)錄因子DBD和DNA序列的靜電相互作用。 靜止態(tài)細胞中，AP-1復合體中轉(zhuǎn)錄因子c-Jun DBD附近的3個氨基酸殘基（Thr231，Ser243和Ser249）被Gsk-3和CKII磷酸化，不能與DNA結合。受到生長因子等刺激