第八章DNA或蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾與基因表達(dá)

1、第八章第八章DNA或蛋白質(zhì)的化學(xué)修或蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾與基因表達(dá)飾與基因表達(dá) 一、一、 DNA甲基化與基因表達(dá)甲基化與基因表達(dá) 二、二、 蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá) 三、三、 基因重排的分子機(jī)制基因重排的分子機(jī)制 一、一、 DNA甲基化與基因表達(dá)甲基化與基因表達(dá) DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。 1DNA甲基化的主要形式甲基化的主要形式 5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出現(xiàn)在CpG和CpXpG中，原核生物中CCA/TGG和GA

2、TC也常被甲基化。 真核生物細(xì)胞內(nèi)存在兩種甲基化酶活性：一種被稱為日常型（mainte-nance）甲基轉(zhuǎn)移酶，另一種是 從頭合成（denovo synthesis）甲基轉(zhuǎn)移酶。前者主要在甲基化母鏈（模板鏈）指導(dǎo)下使處于半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對(duì)應(yīng)的胞嘧啶甲基化。日常型甲基轉(zhuǎn)移酶常常與DNA內(nèi)切酶活性相耦聯(lián)，有3種類型。II類酶活性包括內(nèi)切酶和甲基化酶兩種成分，而I類和III類都是雙功能酶，既能將半甲基化DNA甲基化，又能降解外源無(wú)甲基化DNA。 由于甲基化胞嘧啶極易在進(jìn)化中丟失，所以，高等真核生物中CG序列遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其理論值。哺乳類基因組中約存在4萬(wàn)個(gè)CG islands，大多

3、位于轉(zhuǎn)錄單元的5區(qū)。 沒(méi)有甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用，就可能被氧化成為U，被DNA修復(fù)系統(tǒng)所識(shí)別和切除，恢復(fù)成C。已經(jīng)甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基作用, 它就變?yōu)門, 無(wú)法被區(qū)分。因此, CpG序列極易丟失。 2甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制 甲基化導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，從而影響了蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，抑制了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)區(qū)DNA的結(jié)合效率。 對(duì)弱啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)，少量甲基化就能使其完全失去轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)這類啟動(dòng)子被增強(qiáng)時(shí)，即使不去甲基化也可以恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性。甲基化密度較高時(shí)，即使增強(qiáng)后的啟動(dòng)子仍無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。 因?yàn)榧谆瘜?duì)轉(zhuǎn)錄的抑制強(qiáng)度與MeCP1（methylCpG-bin

4、ding protein1）結(jié)合DNA的能力成正相關(guān)，甲基化CpG的密度和啟動(dòng)子強(qiáng)度之間的平衡決定了該啟動(dòng)子是否具有轉(zhuǎn)錄活性。DNA甲基化對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制直接參與了發(fā)育調(diào)控。隨著個(gè)體發(fā)育，當(dāng)需要某些基因保持沉默時(shí)，它們將迅速被甲基化，若需要恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性，則去甲基化。I DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的直接機(jī)制某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含有CpG序列，甲基化以后直接影響了蛋白質(zhì)因子的結(jié)合活性，不能起始基因轉(zhuǎn)錄。II. 甲基化抑制轉(zhuǎn)錄的間接機(jī)制CpG甲基化，通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象或者通過(guò)與甲基化CpG結(jié)合的蛋白因子間接影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。 與不含甲基化的染色質(zhì)相比，甲基化后染色質(zhì)對(duì)于核酸酶或限制性內(nèi)

5、切酶的敏感度下降，更容易與組蛋白H1相結(jié)合，說(shuō)明甲基化與非甲基化DNA在構(gòu)象上有差異。已經(jīng)分離純化了數(shù)個(gè)與甲基化DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。MeCP1可以與至少12個(gè)對(duì)稱的甲基化CpG結(jié)合，而MeCP2僅同單個(gè)甲基化的CpG序列結(jié)合。 3DNA甲基化與甲基化與X染色體失活染色體失活 雌性胎生哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中兩條X染色體之一在發(fā)育早期隨機(jī)失活，以確保其與只有一條X染色體的雄性個(gè)體內(nèi)X染色體基因的劑量相同。一旦發(fā)生X染色體失活，使該細(xì)胞有絲分裂所產(chǎn)生的后代都保持同一條X染色體失活。 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在X染色體上存在一個(gè)與X染色體失活有密切聯(lián)系的核心部位稱為X染色體失活中心（X-chromosome ina

6、ctivation center，Xic），定位在Xq13區(qū)（正好是Barr氏小體濃縮部位）。 Xi-specific transcript (Xist)基因只在失活的X染色體上表達(dá)，其產(chǎn)物是一功能性RNA，沒(méi)有ORF卻含有大量的終止密碼子。實(shí)驗(yàn)證明，Xist RNA分子能可能與Xic位點(diǎn)相互作用，引起后者構(gòu)象變化，易于結(jié)合各種蛋白因子，最終導(dǎo)致X染色體失活。二、二、 蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá) 蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)是指通過(guò)酶促反應(yīng)把磷酸基團(tuán)從一個(gè)化合物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)化合物上的過(guò)程,是生物體內(nèi)存在的一種普遍的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)的傳遞過(guò)程中占有極其重要的地位。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)有

7、多達(dá)2000個(gè)左右的蛋白質(zhì)激酶和1000個(gè)左右的蛋白質(zhì)磷酸酶基因。蛋白質(zhì)的磷酸化是指由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的過(guò)程，其逆轉(zhuǎn)過(guò)程是由蛋白質(zhì)磷酸酶催化的，稱為蛋白質(zhì)脫磷酸化。 1 蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用蛋白質(zhì)磷酸化在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用(1). 在胞內(nèi)介導(dǎo)胞外信號(hào)時(shí)具有專一應(yīng)答特點(diǎn)。與信號(hào)傳遞有關(guān)的蛋白激酶類主要受控于胞內(nèi)信使，如cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油，diacyl glycerol）等，這種共價(jià)修飾調(diào)節(jié)方式顯然比變構(gòu)調(diào)節(jié)較少受胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的影響。 (2).蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化控制了細(xì)胞內(nèi)已有的酶“活性”。與酶的重新合成

8、及分解相比，這種方式能對(duì)外界刺激做出更迅速的反應(yīng)。(3).對(duì)外界信號(hào)具有級(jí)聯(lián)放大作用；(4).蛋白質(zhì)的磷酸化與脫磷酸化保證了細(xì)胞對(duì)外界信號(hào)的持續(xù)反應(yīng)。被磷酸化的主要氨基酸殘基：絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。組氨酸和賴氨酸殘基也可能被磷酸化。2. 真核細(xì)胞主要跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑真核細(xì)胞主要跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 3. 蛋白激酶的種類與功能蛋白激酶的種類與功能 根據(jù)底物蛋白質(zhì)被磷酸化的氨基酸殘基的種類可分為三大類： 第一類為絲氨酸/蘇氨酸型。這類蛋白激酶使底物蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化第二類為酪氨酸型。被磷酸化的是底物的酪氨酸殘基。第三類是雙重底物特異性蛋白激酶（dual-specificity prot

9、ein kinase），既可使絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化又可使酪氨酸殘基磷酸化。 根據(jù)是否有調(diào)節(jié)物來(lái)分又可分成兩大類： 信使依賴性蛋白質(zhì)激酶（messenger-dependent protein kinase），包括胞內(nèi)第二信使或調(diào)節(jié)因子依賴性蛋白激酶及激素（生長(zhǎng)因子）依賴性激酶兩個(gè)亞類； 非信使依賴型蛋白激酶。4. 受受cAMP調(diào)控的調(diào)控的A激酶激酶 被A激酶磷酸化的蛋白質(zhì)其N端上游往往存在兩個(gè)或兩個(gè)以上堿性氨基酸，特異氨基酸的磷酸化（X-Arg-Arg-X-Ser-X）改變了這一蛋白的酶活性。這一酶活性代表了絕大多數(shù)細(xì)胞中cAMP所引起的全部反應(yīng)。PKA全酶由4個(gè)亞基組成(R2C2）包括兩

10、個(gè)相同的調(diào)節(jié)亞基（R）和兩個(gè)相同的催化亞基（C）。全酶的分子量為150-170kD。 C亞基具有催化活性，R亞基具有調(diào)節(jié)功能，有兩個(gè)cAMP結(jié)合位點(diǎn)。R亞基對(duì)C亞基具有抑制作用，所以，R和C聚合后的全酶（R2C2）無(wú)催化活性。R亞基與cAMP的結(jié)合導(dǎo)致C亞基解離并表現(xiàn)出催化活性。 激素與其受體在肌肉細(xì)胞外表面相結(jié)合，誘發(fā)細(xì)胞質(zhì)cAMP的合成并活化A激酶，再將活化磷酸基團(tuán)傳遞給無(wú)活性的磷酸化酶激酶，活化糖原磷酸化酶，最終將糖原磷酸化，進(jìn)入糖酵解并提供ATP。5. C激酶與激酶與PIP2、IP3和和DAG 磷酸肌醇級(jí)聯(lián)放大的細(xì)胞內(nèi)信使是磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）的兩個(gè)酶解 產(chǎn)物：肌醇1

11、，4，5-三磷酸（IP3）和二?；视停―AG）。C激酶（PKC）是依賴于Ca2+的蛋白質(zhì)激酶。由于IP3所引起的細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度升高，導(dǎo)致C激酶從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到靠原生質(zhì)膜內(nèi)側(cè)處，并被DAG和Ca2+的雙重影響所激活。 C激酶的活性也受磷脂酰絲氨酸的影響，原因是后者大大提高了C激酶對(duì)于Ca2+的親和力，從而使得C激酶能被生理水平的Ca2+離子所活化。C激酶主要實(shí)施對(duì)絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化，它具有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)調(diào)節(jié)結(jié)域。6. CaM激酶及激酶及MAP激酶激酶 Ca2+的細(xì)胞學(xué)功能主要通過(guò)鈣調(diào)蛋白激酶（CaM-kinase）來(lái)實(shí)現(xiàn)，它們也是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，但僅應(yīng)答于細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。

12、MAP激酶（mitogen-activated proteinkinase, MAP-kinase，又稱為extracellular-signal-regulated kinase，ERKS）活性受許多外源 細(xì)胞生長(zhǎng)、分化因子的誘導(dǎo)，也受到酪氨酸蛋白激酶及G蛋白受體系統(tǒng)的調(diào)控。MAP-激酶的活性取決于該蛋白中僅有一個(gè)氨基酸之隔的酪氨酸、絲氨酸殘基是否都被磷酸化?？茖W(xué)家把能同時(shí)催化這兩個(gè)氨基酸殘基磷酸化的酶稱為MAP-激酶-激酶，它的反應(yīng)底物是MAP激酶。MAP-激酶-激酶本身能被MAP-激酶-激酶-激酶所磷酸化激活，后者能同時(shí)被C激酶或酪氨酸激酶家族的Ras蛋白等激活，從而在信息傳導(dǎo)中發(fā)揮功能

13、。7. 酪氨酸蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶 對(duì)于許多生長(zhǎng)因子受體的研究表明，跨膜的酪氨酸蛋白激酶在信息傳遞過(guò)程中起著重要作用。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）受體都擁有定位于胞內(nèi)的酪氨酸激酶功能區(qū)域和膜外區(qū)。 具有受體功能的酪氨酸 蛋白激酶 (receptor protein tyrosine kinase, RPTK)。包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域：胞外的配體結(jié)合區(qū)，細(xì)胞內(nèi)部具有酪氨酸蛋白激酶活性的區(qū)域和連接這兩個(gè)區(qū)域的跨膜結(jié)構(gòu)。胞外配體結(jié)合區(qū)：RPTK的N端大約500-85

14、0個(gè)氨基酸組成親水性胞外配體結(jié)合區(qū)域，氨基酸序列變化較大，是不同RPTK與相應(yīng)配體特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)：是連接受體細(xì)胞內(nèi)、外兩部分，鑲嵌在細(xì)胞膜中的結(jié)構(gòu)，在靠近膜內(nèi)側(cè)C端常常是由堿性氨基酸形成簇狀結(jié)構(gòu)。胞內(nèi)活性區(qū)：保守性較高，由三個(gè)不同的部分組成。與跨膜區(qū)相連的近膜區(qū)包括41-50個(gè)氨基酸，可能是RPTK活性的功能的調(diào)節(jié)部位。第二部分為活性位點(diǎn)所在的催化區(qū)，其氨基酸組成具有很高的保守性。該區(qū)含有ATP結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)，可能是不同類型RPTK底物特異性的決定區(qū)域。第三部分是多變的C末端，包括70-200個(gè)氨基酸，主要是由小分子量氨基酸組成的親水性結(jié)構(gòu)，具有高度的可塑性。 沒(méi)有

15、Cyclin，CDK無(wú)活性。 Cyclin的合成和積累。 形成Cyclin和CDK復(fù)合物。Tyr磷酸化阻礙了ATP的結(jié)合，CDK仍然無(wú)活性。 T-環(huán)中的Thr被磷酸化，Tyr上的磷酸基團(tuán)被去掉，CDK活性大為增強(qiáng)。 CDK使磷酸酯酶磷酸化，進(jìn)一步提高其活性。 CDK使DBRP磷酸化，具有酶活性。 在DBRP的幫助下，泛素連接酶把泛素加到Cyclin上。 Cyclin被降解，CDK失活。見Lehninger, figure 13-33。 CDK通過(guò)蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程控制細(xì)胞分裂。沒(méi)有被磷酸化的PRb能與轉(zhuǎn)錄因子E2F相結(jié)合并使后者不能激活一系列與DNA合成有關(guān)的酶，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法由G1進(jìn)入S。 er

16、bB原癌基因其實(shí)編碼了一個(gè)突變的EGF受體蛋白，它的胞內(nèi)激酶活性區(qū)被永久性激活（相當(dāng)于EGF到正常EGF受體上）。因此，erbB導(dǎo)致了細(xì)胞的永久型分裂。8. 蛋白磷酸酯酶蛋白磷酸酯酶 Ser/Thr蛋白磷酸酯酶主要包括：PP-1，PP-2A，PP-2B和PP-2C四類。 PP-1是糖代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶，具有很高的活性，其催化亞基為38kDa，可以與其它組分或調(diào)節(jié)亞基組成全酶。PP-2A全酶包括一個(gè)36kDa的催化亞基和一個(gè)65kDa的調(diào)節(jié)亞基。PP-2B是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca和CaM調(diào)節(jié)的蛋白磷酸酶,催化了磷酸化酶激酶亞基的脫磷酸化作用。由61kDa的A亞基和16kDa的B亞基組成。A為催化

17、亞基。PP-2C的分子量為43-48kDa，其活性需要mmol/L水平的Mg2+，現(xiàn)對(duì)其參與調(diào)節(jié)的生理過(guò)程知之甚少。 酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP）主要有:胞內(nèi)型，跨膜受體型。兩類PTP的共同點(diǎn)是它們 的催化域中氨基酸順序極為相似，共有240個(gè)氨基酸，內(nèi)含-HCXGXXR（S/T）G-的signature motif。胞內(nèi)型PTP只有一個(gè)催化域。受體型中常有兩個(gè)催化區(qū)，其不同類型的胞外結(jié)構(gòu)往往不同。PTP1B（胞內(nèi)型）是一個(gè)37kDa的胞內(nèi)酶，在氨基酸水平上與CD45（跨膜受體型）的胞內(nèi)部分有很高的同源性。 CD45是一類在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的，高分子量（150-280kD）跨膜蛋白，具有與受體極為相似的

18、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在免疫T細(xì)胞和B細(xì)胞中含量極高。 9.蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸化與基因表達(dá) 處于信號(hào)傳遞鏈終端的蛋白質(zhì)磷酸化既能對(duì)許多酶蛋白及生理代謝過(guò)程起直接的調(diào)節(jié)作用，又能通過(guò)使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)基因活性。a. 對(duì)轉(zhuǎn)錄因子核定位的調(diào)節(jié) SV40抗原未磷酸化時(shí)存在于胞質(zhì)，其111和112位殘基被酪蛋白激酶II（CKII）磷酸化后，其分子內(nèi)的核轉(zhuǎn)位信號(hào)結(jié)構(gòu)域(nuclear transport signal，NTS)變構(gòu)而易于進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。 轉(zhuǎn)錄因子SWI5只在G1期存在于細(xì)胞核內(nèi)，激活核酸內(nèi)切酶基因轉(zhuǎn)錄。在其它時(shí)期則以磷酸化的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。CdC2使其核轉(zhuǎn)位信號(hào)結(jié)構(gòu)域附近的3

19、個(gè)Ser殘基磷酸化，使之無(wú)法進(jìn)入核內(nèi)，失去激活基因轉(zhuǎn)錄功能。 有時(shí)轉(zhuǎn)錄因子上存在一種抑制結(jié)構(gòu)（R），掩蓋了它的NTS功能區(qū)， 從而不能進(jìn)入核內(nèi)；磷酸化使該區(qū)暴露，從而易于進(jìn)入核內(nèi)。有時(shí)，非磷酸化狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄因子與胞質(zhì)錨定或抑制亞基結(jié)合，掩蓋其NTS結(jié)構(gòu)使之不能進(jìn)入核內(nèi)。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子本身或者其抑制亞基被磷酸化，使NTS結(jié)構(gòu)暴露，進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮功能。轉(zhuǎn)錄因子NF-KB常與IKB結(jié)合成復(fù)合體存在于胞質(zhì)中。只有在被各種刺激因子或佛波脂（PKC激活劑）作用后IKB磷酸化并與NF-KB解離，后者才能進(jìn)入核內(nèi)。b. 對(duì)轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合活性的調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)錄因子上的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）或其附近殘基被磷酸化后，由于負(fù)電荷增加而減弱了轉(zhuǎn)錄因子DBD和DNA序列的靜電相互作用。 靜止態(tài)細(xì)胞中，AP-1復(fù)合體中轉(zhuǎn)錄因子c-Jun DBD附近的3個(gè)氨基酸殘基（Thr231，Ser243和Ser249）被Gsk-3和CKII磷酸化，不能與DNA結(jié)合。受到生長(zhǎng)因子等刺激