食品生產(chǎn)企業(yè)微生物檢驗(yàn)知識(shí)分享

1、食品生產(chǎn)企業(yè)微生物檢驗(yàn)nGB 4789.26-2013食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 商業(yè)無菌檢驗(yàn)nGB 4789.4-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)nGB 4789.10-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)nGB 4789.40-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)二、 GB 4789.1-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則n3.1 環(huán)境 n3.1.1 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不應(yīng)影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 n3.1.2 實(shí)驗(yàn)室的工作區(qū)域應(yīng)與辦公室區(qū)域明顯分開。 n3.1.3 實(shí)驗(yàn)室工作面積和總體布局應(yīng)能滿足從事檢驗(yàn)

2、工作的需要， 實(shí)驗(yàn)室布局應(yīng)采用單方向工作流程，n避免交叉污染。 n3.1.4 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境的溫度、濕度、照度、噪聲和潔凈度等應(yīng)符合工作要求。 n3.1.5 一般樣品檢驗(yàn)應(yīng)在潔凈區(qū)域包括超凈工作臺(tái)或潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，潔凈區(qū)域應(yīng)有明顯的標(biāo)示。 n3.1.6 病原微生物分離鑒定工作應(yīng)在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室（ Biosafety level 2, BSL-2 ）進(jìn)行。 n3.2 人員 n3.2.1 檢驗(yàn)人員應(yīng)具有相應(yīng)的教育、微生物專業(yè)培訓(xùn)經(jīng)歷，具備相應(yīng)的資質(zhì)，能夠理解并正確實(shí)施檢驗(yàn)。 n3.2.2 檢驗(yàn)人員應(yīng)掌握實(shí)驗(yàn)室生物檢驗(yàn)安全操作知識(shí)和消毒知識(shí)。 n3.2.3 檢驗(yàn)人員應(yīng)在檢驗(yàn)過程中保持個(gè)人整潔與衛(wèi)生

3、，防止人為污染樣品。 n3.2.4 檢驗(yàn)人員應(yīng)在檢驗(yàn)過程中遵守相關(guān)預(yù)防措施的規(guī)定，保證自身安全。 n3.2.5 有顏色視覺障礙的人員不能執(zhí)行涉及到辨色的實(shí)驗(yàn)。 n3.3 設(shè)備 n3.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)滿足檢驗(yàn)工作的需要。 n3.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)放置于適宜的環(huán)境條件下，便于維護(hù)、清潔、消毒與校準(zhǔn)，并保持整潔與良好的工n作狀態(tài)。 n3.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行檢查、檢定（加貼標(biāo)識(shí)）、維護(hù)和保養(yǎng)，以確保工作性能和操作安全。 n3.3.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)有日常性監(jiān)控記錄和使用記錄。 n3.4 檢驗(yàn)用品 n3.4.1 常規(guī)檢驗(yàn)用品主要有接種環(huán)（針）、酒精燈、鑷子、剪刀、藥匙、消毒棉球、硅膠（棉）塞、微量

4、移液器、吸管、吸球、試管、平皿、微孔板、廣口瓶、量筒、玻棒及L形玻棒等。 n3.4.2 檢驗(yàn)用品在使用前應(yīng)保持清潔和/或無菌。常用的滅菌方法包括濕熱法、干熱法、化學(xué)法等。 n3.4.3 需要滅菌的檢驗(yàn)用品應(yīng)放置在特定容器內(nèi)或用合適的材料（如專用包裝紙、鋁箔紙等）包裹或加塞，應(yīng)保證滅菌效果。 n3.4.4 可選擇適用于微生物檢驗(yàn)的一次性用品來替代反復(fù)使用的物品與材料（如培養(yǎng)皿、吸管、吸頭、試管、接種環(huán)等）。 n3.4.5 檢驗(yàn)用品的儲(chǔ)存環(huán)境應(yīng)保持干燥和清潔,已滅菌與未滅菌的用品應(yīng)分開存放并明確標(biāo)識(shí)。 n3.4.6 滅菌檢驗(yàn)用品應(yīng)記錄滅菌/消毒的溫度與持續(xù)時(shí)間。 n3.5 培養(yǎng)基和試劑 n3.5.

5、1 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的制備和質(zhì)量控制按照GB/T 4789.28 的規(guī)定執(zhí)行。 n3.5.2 試劑 檢驗(yàn)試劑的質(zhì)量及配制應(yīng)適用于相關(guān)檢驗(yàn)。對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果有重要影響的關(guān)鍵試劑應(yīng)進(jìn)行適用性驗(yàn)證。 n4.2 采樣方案 n4.2.1 類型 n 采樣方案分為二級(jí)和三級(jí)采樣方案。二級(jí)采樣方案設(shè)有n 、c 和m值，三級(jí)采樣方案設(shè)有n 、c 、m和M 值。 nn ：同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù)； nc ：最大可允許超出m值的樣品數(shù)； nm：微生物指標(biāo)可接受水平的限量值； nM： 微生物指標(biāo)的最高安全限量值。 n注1： 按照二級(jí)采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在n個(gè)樣品中，允許有c 個(gè)樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值大于m值。 n注2

6、： 按照三級(jí)采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在n 個(gè)樣品中，允許全部樣品中相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值小于或等于m 值；允許有c 個(gè)樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值在m 值和M值之間；不允許有樣品相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值大于M值。n例如：n=5 ，c=2 ，m=100 CFU/g ，M=1 000 CFU/g。n含義是從一批產(chǎn)品中采集5 個(gè)樣品，若5 個(gè)樣品的檢驗(yàn)結(jié)果均小于或等于m值（100 CFU/g ），則這種情況是允許的；若2 個(gè)樣品的結(jié)果（X）位于m值和M 值之間（100 CFU/g 1 000 CFU/g ），則這種情況也是不允許的。三、GB 4789.2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定

7、可能存在的共性問題：環(huán)境條件不達(dá)標(biāo)沒有均質(zhì)設(shè)備缺少必要的培養(yǎng)設(shè)備n高壓滅菌器n干熱滅菌器n恒溫培養(yǎng)箱生理鹽水中氯化鈉的濃度沒有微生物專用移液裝置梯度稀釋中忽略細(xì)節(jié)6.1.3 用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。 6.1.4 按6.1.3 操作程序，制備 10 倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用 1 次1 mL無菌吸管或吸頭?？赡艽嬖诘奶囟▎栴}：培養(yǎng)基的選擇和有效期n商品化干粉培養(yǎng)基保質(zhì)期一般為三年，超過

8、保質(zhì)期或鄰近保質(zhì)期都可能有問題。培養(yǎng)基的選擇應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)要求。忽略空白對(duì)照n6.1.5 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇 2 個(gè)3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10 倍遞增稀釋時(shí)，吸取 1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。沒有培養(yǎng)基的保溫設(shè)備n6.1.6 及時(shí)將15 mL 20 mL 冷卻至46 的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于 46 1 恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。培養(yǎng)皿的放置n6.2.1 待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 1 培養(yǎng)48 h2 h 。水產(chǎn)品 30 1 培養(yǎng)72

9、 h3 h 。n一般培養(yǎng)皿的疊放不超過兩個(gè)。不清楚菌落計(jì)數(shù)的原則6.3 菌落計(jì)數(shù) 可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units ，CFU ）表示。 6.3.1 選取菌落數(shù)在30 CFU300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于 30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU 的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。 6.3.2 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中

10、菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2 ，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。 6.3.3 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。 6.3.2的情況不清楚菌落總數(shù)報(bào)告原則7.2 菌落總數(shù)的報(bào)告 7.2.1 菌落數(shù)小于100 CFU 時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。 7.2.2 菌落數(shù)大于或等于100 CFU 時(shí)，第 3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前 2 位數(shù)字，后面用0 代替位數(shù)；也可用 10 的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。 7.2.3 若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。 7.2.4 若空白對(duì)照上有菌落生長

11、，則此次檢測結(jié)果無效。 7.2.5 稱重取樣以CFU/g 為單位報(bào)告，體積取樣以 CFU/mL 為單位報(bào)告。補(bǔ)充：液體樣品未檢出為1，固體樣品為10。四、GB/T 4789.3-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測定、 GB 4789.3-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)可能存在的問題-方法的選擇n當(dāng)計(jì)量單位為MPN/100 mL（g）時(shí)，應(yīng)選擇GB/T 4789.3-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測定；n當(dāng)計(jì)量單位為MPN/mL（g）時(shí)，應(yīng)選擇GB 4789.3-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)的第一法；n當(dāng)計(jì)量單位為CFU/mL（

12、g）時(shí)，應(yīng)選擇GB 4789.3-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)的第二法。培養(yǎng)基的選擇nGB/T 4789.3-2003：乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、革蘭氏染色液；nGB 4789.3-2010：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）缺少必要的檢測設(shè)備結(jié)果報(bào)告不合理n當(dāng)計(jì)量單位為MPN/100 mL（g）時(shí)，液體樣品未檢出為3，固體樣品為30；n當(dāng)計(jì)量單位為MPN/mL（g）時(shí)，液體樣品未檢出為0.03，固體樣品為0.3 ；n當(dāng)計(jì)量單位為CFU/mL（g）時(shí)，液體樣品未檢出為1，固體樣品為1

13、0沒有選擇正確的連續(xù)三個(gè)梯度不了解平板計(jì)數(shù)的注意事項(xiàng)五、GB 4789.15-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)可能存在的問題：忽略樣品稀釋液忽略空白對(duì)照n5.1.5 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇 2 個(gè)3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10 倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液于2 個(gè)無菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1 mL樣品稀釋液加入2 個(gè)無菌平皿作空白對(duì)照?；煜囵B(yǎng)條件和培養(yǎng)設(shè)備n待瓊脂凝固后，將平板倒置，281培養(yǎng)5d ，觀察并記錄。n一般情況下使用霉菌培養(yǎng)箱，而非生化培養(yǎng)箱，普通恒溫培養(yǎng)箱更不適用。六、GB 4789.4-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)可能存在的問題：試劑不全nBPWnTTB、SCnBS、XLD（或HE或沙門氏菌顯色培養(yǎng)基）七、GB 4789.10-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)可能存在的問題：方法選擇錯(cuò)誤n本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn)；第二