實(shí)驗(yàn)八DN重組子構(gòu)建和鑒定

1、實(shí)驗(yàn)八DN重組子構(gòu)建和鑒定獲得目的基因片段，選擇好適當(dāng)?shù)妮d體，獲得目的基因片段，選擇好適當(dāng)?shù)妮d體， 并確定重組方案后，接下來要進(jìn)行的就是并確定重組方案后，接下來要進(jìn)行的就是片段之間的體外連接了（即片段之間的體外連接了（即DNA重組）重組），從而獲得，從而獲得DNA重組體又叫重組體又叫DNA重組子。重組子。 DNA重組子需轉(zhuǎn)移入相應(yīng)的受體細(xì)胞中用于重組子需轉(zhuǎn)移入相應(yīng)的受體細(xì)胞中用于對(duì)目的基因的擴(kuò)增及目的基因的蛋白表達(dá)。對(duì)目的基因的擴(kuò)增及目的基因的蛋白表達(dá)。DNA重組技術(shù)的操作過程重組技術(shù)的操作過程3 A-A 3 PCR product3 A-A 3 PCR productMCSPCR produ

2、ctT-A cloning重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞可能的情況重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞可能的情況由于重組體由于重組體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的比分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的比例通常較低，只有極少數(shù)受體細(xì)胞接受到例通常較低，只有極少數(shù)受體細(xì)胞接受到重組體重組體DNA分子，能實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)分子，能實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移；絕大部分仍是原來的受體細(xì)胞，或者移；絕大部分仍是原來的受體細(xì)胞，或者是不含目的基因的轉(zhuǎn)化子。所以必須從大是不含目的基因的轉(zhuǎn)化子。所以必須從大量的培養(yǎng)細(xì)胞中初步篩選出含有目的基因量的培養(yǎng)細(xì)胞中初步篩選出含有目的基因重組體的受體細(xì)胞并作進(jìn)一步的鑒定。重組體的受體細(xì)胞并作進(jìn)一步的鑒定。重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率較低重

3、組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率較低重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞后的篩選培養(yǎng)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞后的篩選培養(yǎng)大部分是含空載體的大部分是含空載體的轉(zhuǎn)化子（非重組子）轉(zhuǎn)化子（非重組子）少部分是含目的基因少部分是含目的基因的轉(zhuǎn)化子（重組子）的轉(zhuǎn)化子（重組子）少數(shù)是不含載體的受少數(shù)是不含載體的受體細(xì)胞（非轉(zhuǎn)化子）體細(xì)胞（非轉(zhuǎn)化子）常用鑒定方法常用鑒定方法n小規(guī)模制備質(zhì)粒小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析進(jìn)行限制酶切分析n 互補(bǔ)互補(bǔ)n雜交篩選雜交篩選酶切和電泳方法酶切和電泳方法 瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：32P標(biāo)記的DNA分子探針 雜交 放射自顯影法 DNADNA雜交直接鑒定雜交直接鑒定Ampr抗性篩選和互

4、補(bǔ)(藍(lán)白斑)篩選n本實(shí)驗(yàn)所使用的載體質(zhì)粒DNA為pUCm-T載體，由于其上帶有Ampr 和lacZ基因，故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。 Ampr抗性篩選n因pUCm-T載體帶有Ampr基因，而外源片段上不帶該基因，故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pUCm-T的受體菌（轉(zhuǎn)化子）才能在含有Amp的LB平板上存活；只帶有自身環(huán)化外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。-互補(bǔ)互補(bǔ) -互補(bǔ)的插入失活互補(bǔ)的插入失活pUC載體上LacZ基因的5端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ（ -片段）片段）的合成，但插入外源目的基因后就會(huì)阻止LacZ的合成，使不能互補(bǔ) l

5、acZ 5 3 肽互補(bǔ)MCS肽移碼突變lacZ 5 3 不互補(bǔ)外源DNA 藍(lán)白斑篩選示意圖藍(lán)白斑篩選示意圖npUCm-T上帶有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和-半乳糖苷酶N端146個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），但并沒有破壞lacZ的閱讀框架，不影響其正常功能。E. coli DH5菌株帶有-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下，pUCm-T和DH5編碼的-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pUCm-T重組子和DH5融為一體時(shí)形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。n這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酸陰性

6、突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫-互補(bǔ)。n由-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+ 細(xì)菌較易識(shí)別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(異丙基-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。n當(dāng)外源片段插入到pUCm-T質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會(huì)導(dǎo)致讀碼框架改變， 表達(dá)蛋白失活，產(chǎn)生的氨基酸片段失去-互補(bǔ)能力，因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。此為-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選。n外源外源DNA片段片段: 帶帶A粘性末端的粘性末端的purified PCR productnT-載體載體DNA: pUCm-T質(zhì)粒質(zhì)粒(Ampr ，lacZ)nT 4 DNA ligase, 5U/uln T4 DNA ligase buffernSterilized ddH2On宿主菌宿主菌: 具有具有-互補(bǔ)能力的互補(bǔ)能力的E. coli DH5菌株菌株nAmp/X-gal LB plate及及取取5l連接產(chǎn)物連接產(chǎn)物 加入置于冰上的加入置于冰上的100l感受態(tài)感受態(tài)細(xì)菌（在細(xì)菌（在1.5 ml管）中管）中 置冰上置冰上30分鐘分鐘 42oC熱休克熱休克90秒秒 置冰上置冰上2分鐘分鐘 加入加入0.5ml LB液液體體 在在37oC 于于120rpm復(fù)蘇復(fù)蘇40分鐘分鐘 5000rpm離離心心2分鐘分鐘 除去除去400l 上清，留下的上清，留下