(5) 離心技術(shù)

1、離心技術(shù)離心技術(shù)1離離 心心 技技 術(shù)術(shù) 離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動的離心力，以離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動的離心力，以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差別及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差別進(jìn)行分離、濃縮和提純的一項操作技進(jìn)行分離、濃縮和提純的一項操作技術(shù)。術(shù)。2主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容3一、離心的基本原理一、離心的基本原理利用轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時所產(chǎn)生的強(qiáng)大離心力，加快利用轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時所產(chǎn)生的強(qiáng)大離心力，加快顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)的或浮顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)的或浮力密度差的物質(zhì)分離開。力密度差的物質(zhì)分離開。4離心力離心力離心力（離心力（F）：當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)子以一定的角速度）：當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)子以一定的角

2、速度（弧度（弧度/秒）旋轉(zhuǎn)，秒）旋轉(zhuǎn)，顆粒的旋轉(zhuǎn)半徑為顆粒的旋轉(zhuǎn)半徑為r（厘米）時，顆粒所受的向外的力即離心力。（厘米）時，顆粒所受的向外的力即離心力。52Fmamr: : 旋轉(zhuǎn)角速度旋轉(zhuǎn)角速度 r r：旋轉(zhuǎn)體離旋轉(zhuǎn)軸的距離：旋轉(zhuǎn)體離旋轉(zhuǎn)軸的距離2/sec60nrad相對離心力（相對離心力（RCFRCF）：又稱分離因數(shù)，是衡量離心程度的）：又稱分離因數(shù)，是衡量離心程度的參數(shù)，參數(shù)，是指在離心力場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地是指在離心力場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球引力的倍數(shù)，單位是重力加速度球引力的倍數(shù)，單位是重力加速度g g（980cm/980cm/秒秒2 2）。）。RCF=RCF=2

3、 2r/980 = 4r/980 = 42 2n n2 2r/3600r/3600* *980 = 1.119980 = 1.119* *1010-5-5n n2 2r r低速離心時常以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)低速離心時常以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)rpm（即（即n）來作為離心力單）來作為離心力單位；而高速離心則以位；而高速離心則以g表示。表示。2225241.119 109803600 980rn rRCFn rn n：轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（：轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpmrpm）6半徑半徑相對離心力相對離心力轉(zhuǎn)數(shù)轉(zhuǎn)數(shù)7沉降系數(shù)沉降系數(shù) Sedimentation coefficient (S) 離心沉降和重力沉降只是對沉降的

4、作用力不同，離心沉降離心沉降和重力沉降只是對沉降的作用力不同，離心沉降的速度的速度v 其中其中S即為沉降系數(shù)。即為沉降系數(shù)。 S表示單位離心場中粒子的移動速度。表示單位離心場中粒子的移動速度。 r1:離心前粒子距離轉(zhuǎn)軸的距離離心前粒子距離轉(zhuǎn)軸的距離 r2:離心后粒子距離轉(zhuǎn)軸的距離離心后粒子距離轉(zhuǎn)軸的距離82vSr212221loglog2.303()rrvSrtt沉降速度單位離心力 S S在實際應(yīng)用時常在在實際應(yīng)用時常在1010-13-13秒左右，故把秒左右，故把沉降系數(shù)沉降系數(shù)1010-13-13秒稱為一個秒稱為一個SvedbergSvedberg單位，單位，簡寫簡寫S S，量綱為秒。，量綱

5、為秒。9 樣品顆粒的大小樣品顆粒的大小 形狀形狀 密度密度 溶劑的粘度、密度溶劑的粘度、密度 離心加速度離心加速度1011沉降速度沉降速度 sedimentation velocity(1)(1)定義：定義： 指在強(qiáng)大的離心作用下，單位時間內(nèi)物指在強(qiáng)大的離心作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動的距離。質(zhì)運(yùn)動的距離。2222()218pmdrdxvxxdtpm（-）9 r r： 球形粒子的半徑球形粒子的半徑 d d： 球形粒子的直徑球形粒子的直徑： 流體介質(zhì)的粘度流體介質(zhì)的粘度 p p：粒子的密度：粒子的密度m m：介質(zhì)的密度：介質(zhì)的密度1213沉降時間沉降時間(Sedimentation Time, T

6、s)(Sedimentation Time, Ts)22/vdx dtSxx21dxdtSx21212ln/1sxxTttS公式變換得公式變換得上式積分得上式積分得X X2 2為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離; ;X X1 1為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離；為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離；TsTs以小時為單位以小時為單位,S,S以以SvedbergSvedberg為單位。為單位。1415 分類標(biāo)準(zhǔn)多種多樣：分類標(biāo)準(zhǔn)多種多樣：（一）根據(jù)轉(zhuǎn)速分類：低速、高速、超速（一）根據(jù)轉(zhuǎn)速分類：低速、高速、超速16項目項目低速離心機(jī)低速離心機(jī)高速離心機(jī)高速離心機(jī)

7、超速離心機(jī)超速離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)(rpm)2000-600010000-2600030000-120000離心力(rcf)2000-7000g8000-80000g100000-6000000g適用范圍細(xì)胞適用適用適用細(xì)胞核適用適用適用細(xì)胞器-適用適用蛋白質(zhì)-適用1 1. .低速離心機(jī)低速離心機(jī) (2000-6000rpm) 轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)子 電動機(jī)電動機(jī) 轉(zhuǎn)子帶有放置離心管的孔轉(zhuǎn)子帶有放置離心管的孔轉(zhuǎn)子的中央位于離心機(jī)的驅(qū)動軸上轉(zhuǎn)子的中央位于離心機(jī)的驅(qū)動軸上離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和溫度控制不夠準(zhǔn)確離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和溫度控制不夠準(zhǔn)確 一般最高轉(zhuǎn)速在一般最高轉(zhuǎn)速在6,000rpm6,000rpm以下以下實驗室中常用于分離制備

8、。實驗室中常用于分離制備。 17 2.2.高速離心機(jī)高速離心機(jī) (10000-26000rpm)(10000-26000rpm) 制冷設(shè)備溫度控制在制冷設(shè)備溫度控制在0-40-4范圍內(nèi)范圍內(nèi) 制動器（剎車）制動器（剎車） 實際速度和溫度可通過儀表顯示實際速度和溫度可通過儀表顯示 配有一定類型及規(guī)格的轉(zhuǎn)子配有一定類型及規(guī)格的轉(zhuǎn)子 最高轉(zhuǎn)速在最高轉(zhuǎn)速在26,000rpm26,000rpm以下以下 常用于生物大分子的分離制備常用于生物大分子的分離制備 183.3.超速離心機(jī)超速離心機(jī) 驅(qū)動和速度控制驅(qū)動和速度控制 溫度控制溫度控制 真空系統(tǒng)真空系統(tǒng) 轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)子常用于分離亞細(xì)胞器、病毒粒子、常用于分離亞

9、細(xì)胞器、病毒粒子、DNADNA、RNARNA和蛋白質(zhì)分子。和蛋白質(zhì)分子。在分離時無須加入可能引起被分離物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的物質(zhì)。在分離時無須加入可能引起被分離物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的物質(zhì)。1920（二）（二）. .根據(jù)轉(zhuǎn)子形式分類根據(jù)轉(zhuǎn)子形式分類(Rotor)(Rotor) 固定角式轉(zhuǎn)子固定角式轉(zhuǎn)子(fixed-angle rotor)(fixed-angle rotor) 水平轉(zhuǎn)子水平轉(zhuǎn)子(swing-out rotor)(swing-out rotor) 垂直轉(zhuǎn)子垂直轉(zhuǎn)子(vertical rotor)(vertical rotor) 帶狀轉(zhuǎn)子帶狀轉(zhuǎn)子(zonal rotor)(zonal rotor)

10、連續(xù)轉(zhuǎn)子連續(xù)轉(zhuǎn)子(continuous rotor) (continuous rotor) 轉(zhuǎn)子的材質(zhì)：轉(zhuǎn)子的材質(zhì)：鋁質(zhì)鋁質(zhì) 較輕較輕, ,耐受強(qiáng)度較弱耐受強(qiáng)度較弱, ,適合在較低適合在較低 的轉(zhuǎn)速下使用的轉(zhuǎn)速下使用; ;不銹鋼不銹鋼 耐受強(qiáng)度最好耐受強(qiáng)度最好, ,但材質(zhì)本身太重；但材質(zhì)本身太重； 鈦合金鈦合金 耐受強(qiáng)度不錯耐受強(qiáng)度不錯, ,重量也比不銹鋼輕。重量也比不銹鋼輕。 2122 常見的角度常見的角度 2020 28 28 34 34 40 40 沉降界面沉降界面沉淀沉淀232425角式轉(zhuǎn)子的特點：角式轉(zhuǎn)子的特點： （1 1）重心低重心低, ,轉(zhuǎn)速可較高；轉(zhuǎn)速可較高； （2 2）樣品粒

11、子穿過溶劑層的距離略大于）樣品粒子穿過溶劑層的距離略大于 離心管的直徑離心管的直徑; ; （3 3）“管壁效應(yīng)管壁效應(yīng)” ： 有一定的角度有一定的角度, , 在離心過程中撞到在離心過程中撞到 離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形 成沉淀成沉淀, , 此效應(yīng)使最后在管底聚成的沉此效應(yīng)使最后在管底聚成的沉 淀較緊密。淀較緊密。 26521.119 10RCFn rR1R2R3272.2.水平轉(zhuǎn)子水平轉(zhuǎn)子 （1 1）轉(zhuǎn)子靜止時）轉(zhuǎn)子靜止時, ,處在轉(zhuǎn)子中的離心管中處在轉(zhuǎn)子中的離心管中 心線與旋轉(zhuǎn)軸平行心線與旋轉(zhuǎn)軸平行, ,（2 2）轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時）轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)加速時, ,

12、離心管中心線由平離心管中心線由平 行位置逐漸過渡到垂直位置行位置逐漸過渡到垂直位置, ,即與旋即與旋 轉(zhuǎn)軸成轉(zhuǎn)軸成9090角角, ,（3 3）粒子的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基本）粒子的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基本 一致，有少量的一致，有少量的“管壁效應(yīng)管壁效應(yīng)”。 2829303.3.垂直轉(zhuǎn)子垂直轉(zhuǎn)子 離心管垂直插入轉(zhuǎn)子孔內(nèi)離心管垂直插入轉(zhuǎn)子孔內(nèi), ,在離心過程在離心過程中始終與旋轉(zhuǎn)軸平行中始終與旋轉(zhuǎn)軸平行, ,而離心時而離心時液層液層發(fā)生發(fā)生9090角的變化角的變化, ,從開始的水平方向改成垂直從開始的水平方向改成垂直方向方向, ,當(dāng)轉(zhuǎn)子降速時當(dāng)轉(zhuǎn)子降速時, ,垂直分布的液層又逐漸垂直分布的液層

13、又逐漸趨向水平趨向水平, ,待旋轉(zhuǎn)停止后待旋轉(zhuǎn)停止后, ,液面又完全恢復(fù)成液面又完全恢復(fù)成水平方向。水平方向。31區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的樣品及介質(zhì)與轉(zhuǎn)頭直接接觸，要求轉(zhuǎn)子耐腐蝕，區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的樣品及介質(zhì)與轉(zhuǎn)頭直接接觸，要求轉(zhuǎn)子耐腐蝕，并且操作復(fù)雜。并且操作復(fù)雜。缺點缺點：323334自動排出沉渣的離心澄清機(jī)自動排出沉渣的離心澄清機(jī)35分批自動排出沉渣的離心澄清機(jī)分批自動排出沉渣的離心澄清機(jī)36（三）根據(jù)用途分類：（三）根據(jù)用途分類：實驗室或工廠、分析或制備實驗室或工廠、分析或制備37（四）根據(jù)離心形式分類：（四）根據(jù)離心形式分類：離心離心過濾過濾：指在有孔轉(zhuǎn)鼓的離心機(jī)中通過過濾介質(zhì)分離懸浮：指在有孔轉(zhuǎn)鼓的離心

14、機(jī)中通過過濾介質(zhì)分離懸浮液的過程。液的過程。離心離心沉降沉降：利用固液兩相比重的差異在離心機(jī)無孔轉(zhuǎn)鼓或離：利用固液兩相比重的差異在離心機(jī)無孔轉(zhuǎn)鼓或離心管中進(jìn)行懸浮液沉降的過程。心管中進(jìn)行懸浮液沉降的過程。離心離心分離分離：利用不同溶質(zhì)顆粒在液體各部分分布的差異，分：利用不同溶質(zhì)顆粒在液體各部分分布的差異，分離不同比重的液體的過程。離不同比重的液體的過程。38（五）根據(jù)結(jié)構(gòu)特點分類：（五）根據(jù)結(jié)構(gòu)特點分類：轉(zhuǎn)子形狀：角式、外擺、管式、碟片式轉(zhuǎn)子形狀：角式、外擺、管式、碟片式轉(zhuǎn)軸位置：直立、水平、傾斜轉(zhuǎn)軸位置：直立、水平、傾斜驅(qū)動方式：手搖、氣動、磁懸、驅(qū)動方式：手搖、氣動、磁懸、電動電動39操作

15、方式：連續(xù)、半連續(xù)、間歇操作方式：連續(xù)、半連續(xù)、間歇卸料方法：人工、重力、刮刀、振動、蠕動卸料方法：人工、重力、刮刀、振動、蠕動泵、噴嘴、螺旋等泵、噴嘴、螺旋等使用溫度：冷凍和常溫使用溫度：冷凍和常溫40三三. .離心分離方法離心分離方法 根據(jù)離心原理根據(jù)離心原理, ,按照實際工作的需要，目按照實際工作的需要，目前已有可設(shè)計出各種離心方法綜合起來大致可前已有可設(shè)計出各種離心方法綜合起來大致可分三類分三類41421.1.平衡離心法平衡離心法 根據(jù)粒子大小、形狀不同進(jìn)行分離。根據(jù)粒子大小、形狀不同進(jìn)行分離。 差速離心法差速離心法(differential velocity centrifugati

16、on)(differential velocity centrifugation) 速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法(rate zonal centrifugation)(rate zonal centrifugation)。43( (一一).).差速離心法差速離心法1 1、原理原理 利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別, ,在同一離在同一離心條件下心條件下, ,沉降速度不同沉降速度不同, ,通過不斷增加相對離心力通過不斷增加相對離心力, ,使一使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分步沉淀。個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分步沉淀。 44 例用差速離

17、心法分離已破碎的細(xì)胞各組份例用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份 已破碎的細(xì)胞已破碎的細(xì)胞 500g,10500g,10分鐘分鐘 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (細(xì)胞核）細(xì)胞核） 10,000g,1010,000g,10分鐘分鐘 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (細(xì)胞膜碎片細(xì)胞膜碎片, ,線粒體線粒體,) 100,000g,3,) 100,000g,3小時小時 溶酶體溶酶體 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (核糖核蛋白體）核糖核蛋白體） ( (可溶性成份可溶性成份) ) 45( (二二).).速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法1 1. .原理原理 離心前離心管內(nèi)先離心前離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)裝入密度梯度介質(zhì)

18、, ,形成密度梯度形成密度梯度，介，介質(zhì)最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。樣品鋪放在梯度溶液質(zhì)最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。樣品鋪放在梯度溶液表面，離心后不同大小、形狀，有一定沉降系數(shù)差異的顆粒形表面，離心后不同大小、形狀，有一定沉降系數(shù)差異的顆粒形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。46( (三三).).等密度離心法等密度離心法1 1原理原理 預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度（包含了被分離樣品中所有預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度（包含了被分離樣品中所有粒子的密度），樣品鋪在梯度液粒子的密度），樣品鋪在梯度液頂上或混合頂上或混合, ,離心開始后離心開始后, , 梯度液受離心力的作用逐

19、漸形成底濃而管頂稀的密度梯度梯度液受離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度, ,與此同時原來分布均勻的樣品粒子也發(fā)生重新分布。各種與此同時原來分布均勻的樣品粒子也發(fā)生重新分布。各種顆粒移動到與它們各自密度恰好相等的位置上形成區(qū)帶。顆粒移動到與它們各自密度恰好相等的位置上形成區(qū)帶。472 2. .注意點注意點：離心時間要長離心時間要長可用角式轉(zhuǎn)頭或水平式轉(zhuǎn)頭可用角式轉(zhuǎn)頭或水平式轉(zhuǎn)頭粒子密度相近或相等時不宜用粒子密度相近或相等時不宜用密度梯度溶液中要包含所有粒子密度密度梯度溶液中要包含所有粒子密度不能用剎車不能用剎車48分離法分離法速度區(qū)帶離心法速度區(qū)帶離心法平衡密度梯度離心法平衡密度梯度離心

20、法原理原理沉降與顆粒質(zhì)量成正比，以沉降與顆粒質(zhì)量成正比，以物質(zhì)沉降速度的不同進(jìn)行分物質(zhì)沉降速度的不同進(jìn)行分離離沉降與顆粒的密度成正比，以物質(zhì)沉降與顆粒的密度成正比，以物質(zhì)的浮密度不同進(jìn)行分離的浮密度不同進(jìn)行分離介質(zhì)介質(zhì)密度小，如蔗糖、甘油、聚密度小，如蔗糖、甘油、聚蔗糖，蔗糖濃度蔗糖，蔗糖濃度10% 67%，密，密度度11.3286預(yù)制梯度，不連預(yù)制梯度，不連續(xù)續(xù)密度大，如密度大，如CsCl,Cs2SO4，CsCl濃度濃度01355，密度為，密度為11.9025，自成，自成連續(xù)梯度連續(xù)梯度離心力場離心力場強(qiáng)，離心速度高，使被分離強(qiáng)，離心速度高，使被分離物質(zhì)易沉降物質(zhì)易沉降稍強(qiáng)，速度相對低，使稍

21、強(qiáng)，速度相對低，使CsCl形成梯形成梯度，建立沉降擴(kuò)散平衡度，建立沉降擴(kuò)散平衡離心過程離心過程樣品向離心管底沉降樣品向離心管底沉降不論樣品起始時在什么位置，離心不論樣品起始時在什么位置，離心中樣品停留于介質(zhì)的等密度部位中樣品停留于介質(zhì)的等密度部位離心時間離心時間較短，一般為幾小時到幾十較短，一般為幾小時到幾十小時小時較長，十幾小時到數(shù)天較長，十幾小時到數(shù)天49密度梯度離心操作步驟密度梯度離心操作步驟505152常用的梯度材料：常用的梯度材料：糖類糖類: : 蔗糖、甘油、聚蔗糖蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)(Ficoll)、右糖酐、糖原、右糖酐、糖原 無機(jī)鹽類無機(jī)鹽類:CsCl(:CsCl(

22、氯化銫氯化銫) )、RbCl(RbCl(氯化銣氯化銣) )、NaClNaCl、KBrKBr等等 有機(jī)碘化物有機(jī)碘化物: :三碘苯甲酰匍萄糖胺等三碘苯甲酰匍萄糖胺等 硅溶膠硅溶膠: : 如如PercollPercoll。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì): :如牛血清白蛋白如牛血清白蛋白重水重水 非水溶性有機(jī)物非水溶性有機(jī)物: :如氟代碳等如氟代碳等 53 ( (二二).).梯度材料的應(yīng)用范圍梯度材料的應(yīng)用范圍 1.1.蔗糖蔗糖: : 水溶性大水溶性大 性質(zhì)穩(wěn)定性質(zhì)穩(wěn)定 滲透壓較高滲透壓較高 最高密度可達(dá)最高密度可達(dá)1.33g/ml,1.33g/ml, 價格低價格低 容易制備容易制備, , 常用于細(xì)胞器、病毒、常用于細(xì)胞器、病毒、RNARNA分離的梯度材料分離的梯度材料 有較大的滲透壓有較大的滲透壓, ,不宜用于細(xì)胞的分離不宜用于細(xì)胞的分離。 54 2. 2.聚蔗糖聚蔗糖: : 商品名商品名Ficoll, Ficoll, 滲透壓低滲透壓低 粘度卻特別高粘度卻特別高, ,為