核酸綜合實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1核酸核酸(h sun)綜合實(shí)驗(yàn)綜合實(shí)驗(yàn)第一頁(yè)，共31頁(yè)。1.質(zhì)粒質(zhì)粒 DNA 的小量制備的小量制備(zhbi)提取與純化提取與純化第1頁(yè)/共30頁(yè)第二頁(yè)，共31頁(yè)。第2頁(yè)/共30頁(yè)第三頁(yè)，共31頁(yè)。第3頁(yè)/共30頁(yè)第四頁(yè)，共31頁(yè)。第4頁(yè)/共30頁(yè)第五頁(yè)，共31頁(yè)。溶液I 懸浮細(xì)胞(xbo)EDTA 破壞細(xì)胞(xbo)壁和細(xì)胞(xbo)外膜NaOH提高(t go)PH值，破壞堿基對(duì)，使染色體DNA變性成單鏈，閉環(huán)狀質(zhì)粒DNA處于纏繞狀堿變性(binxng)（裂解）恢復(fù)中性環(huán)境，質(zhì)粒DNA迅速?gòu)?fù)性，上清中含質(zhì)粒DNA與小分子RNA出現(xiàn)大量白色沉淀出現(xiàn)大量白色沉淀(染色體染色體DNA，大分

2、，大分子子RNA、蛋白、蛋白-SDS等雜質(zhì)等雜質(zhì))溶液溶液、 的作用說(shuō)明的作用說(shuō)明第5頁(yè)/共30頁(yè)第六頁(yè)，共31頁(yè)。淀質(zhì)粒淀質(zhì)粒 DNA，低離子強(qiáng)度的，低離子強(qiáng)度的TE 緩沖液溶緩沖液溶解后，加適量解后，加適量 RNase A 降解殘留的小分降解殘留的小分子子RNA 。第6頁(yè)/共30頁(yè)第七頁(yè)，共31頁(yè)。第7頁(yè)/共30頁(yè)第八頁(yè)，共31頁(yè)。加入加入(jir)150uL(jir)150uL溶液溶液IIIIII（輕輕混勻），冰上靜置（輕輕混勻），冰上靜置10min10min質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA復(fù)性復(fù)性15000rpm15000rpm，離心，離心5min5min，取上清，取上清400ul400ul到一新

3、管到一新管加加240ul240ul異丙醇，混勻，室溫靜置異丙醇，混勻，室溫靜置10min10min15000rpm15000rpm，離心，離心10min10min，棄上清，棄上清50ul TE50ul TE溶解沉淀，加入溶解沉淀，加入(jir)50ul (jir)50ul 冰預(yù)冷的冰預(yù)冷的5M LiCl5M LiCl，混勻，冰浴，混勻，冰浴 10min 10min 15000rpm 15000rpm，離心，離心10min10min，取上清，取上清100ul100ul到一新管到一新管 （可省略）上清加等體積的氯仿：異戊醇（振蕩混勻）（可省略）上清加等體積的氯仿：異戊醇（振蕩混勻）上清加上清加2

4、2倍體積（倍體積（200ul200ul）的無(wú)水乙醇（充分混勻），）的無(wú)水乙醇（充分混勻），-20 10min-20 10min第8頁(yè)/共30頁(yè)第九頁(yè)，共31頁(yè)。15000rpm15000rpm，離心，離心10min10min（可省略（可省略(shngl)(shngl)）沉淀用）沉淀用75%75%乙醇乙醇1mL1mL洗滌兩次（輕彈混勻、離心）洗滌兩次（輕彈混勻、離心）（可省略（可省略(shngl)(shngl)） 15000rpm 15000rpm，離心，離心10min10min晾干沉淀晾干沉淀沉淀用沉淀用20ul TE20ul TE溶解，溶解，-200C-200C保存保存第9頁(yè)/共30頁(yè)第十頁(yè)

5、，共31頁(yè)。第10頁(yè)/共30頁(yè)第十一頁(yè)，共31頁(yè)。載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒DNADNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)(jigu)(jigu)的三大要素：的三大要素： 多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn) 選擇標(biāo)記（耐藥性，選擇標(biāo)記（耐藥性，LacZLacZ） 獨(dú)立的復(fù)制單位獨(dú)立的復(fù)制單位【原理【原理(yunl)】 第11頁(yè)/共30頁(yè)第十二頁(yè)，共31頁(yè)。 限制性內(nèi)切酶（限制性內(nèi)切酶（restriction endonucleaserestriction endonuclease）指能識(shí)別堿基構(gòu)）指能識(shí)別堿基構(gòu)成特異的一段（成特異的一段（48 bp48 bp）雙鏈核酸序列，并從中將核酸的磷酸）雙鏈核酸序列，并從中將核酸的磷酸二酯鍵斷裂的一種蛋

6、白酶。二酯鍵斷裂的一種蛋白酶。 每種酶有特異的識(shí)別核酸序列，稱為酶切位點(diǎn)，一般每種酶有特異的識(shí)別核酸序列，稱為酶切位點(diǎn)，一般(ybn)(ybn)為為回文序列。回文序列。酶切可能產(chǎn)生酶切可能產(chǎn)生(chnshng)三種切口三種切口：平端切口：平端切口：Hae III5末端突出的粘端切口末端突出的粘端切口: Bam HI3末端突出的粘端切口末端突出的粘端切口: EcoR I第12頁(yè)/共30頁(yè)第十三頁(yè)，共31頁(yè)。載體載體(zit)的酶切與載體的酶切與載體(zit)的構(gòu)建的構(gòu)建第13頁(yè)/共30頁(yè)第十四頁(yè)，共31頁(yè)?！緦?shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟】步驟】第14頁(yè)/共30頁(yè)第十五頁(yè)，共31頁(yè)。第15頁(yè)/共30頁(yè)第十六頁(yè)，共31頁(yè)。第16頁(yè)/共30頁(yè)第十七頁(yè)，共31頁(yè)。第17頁(yè)/共30頁(yè)第十八頁(yè)，共31頁(yè)。第18頁(yè)/共30頁(yè)第十九頁(yè)，共31頁(yè)。而造成。第19頁(yè)/共30頁(yè)第二十頁(yè)，共31頁(yè)。核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離(fnl)(fnl)的關(guān)的關(guān)系系 第20頁(yè)/共30頁(yè)第二十一頁(yè)，共31頁(yè)?！緦?shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟】步驟】第21頁(yè)/共30頁(yè)第二十二頁(yè)，共31頁(yè)。第22頁(yè)/共30頁(yè)第二十三頁(yè)，共31頁(yè)。第23頁(yè)/共30頁(yè)第二十四頁(yè)，共31頁(yè)。第24頁(yè)/共30頁(yè)第二十五頁(yè)，共31頁(yè)。第25頁(yè)/共30頁(yè)第二十六頁(yè)，共31頁(yè)。第26頁(yè)/共30頁(yè)第