化學發(fā)光免疫分析技術 (4)

1、關于化學發(fā)光免疫分析技術 (4)現在學習的是第一頁，共31頁一、一、化學發(fā)光免疫技術的概念化學發(fā)光免疫技術的概念二、二、化學發(fā)光免疫分析基本原理化學發(fā)光免疫分析基本原理三、三、化學發(fā)光免疫分析的類型化學發(fā)光免疫分析的類型四、臨床應用四、臨床應用五、發(fā)展與展望五、發(fā)展與展望現在學習的是第二頁，共31頁一、化學發(fā)光免疫技術的概念 化學發(fā)光免疫技術化學發(fā)光免疫技術：化學發(fā)光分析是根據化學反應產生的輻射光的強度來確定物化學發(fā)光分析是根據化學反應產生的輻射光的強度來確定物質含量的分析方法?；瘜W發(fā)光免疫分析是將化學發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應相結合，用化質含量的分析方法?；瘜W發(fā)光免疫分析是將化學發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應相

2、結合，用化學發(fā)光相關的物質標記抗體或抗原，與待測的抗原或抗體反應后，經過分離游離態(tài)學發(fā)光相關的物質標記抗體或抗原，與待測的抗原或抗體反應后，經過分離游離態(tài)的化學發(fā)光標記物，加入化學發(fā)光系統(tǒng)的其它相關物產生化學發(fā)光，進行抗原或抗的化學發(fā)光標記物，加入化學發(fā)光系統(tǒng)的其它相關物產生化學發(fā)光，進行抗原或抗體的定量或定性檢測。體的定量或定性檢測。 現在學習的是第三頁，共31頁 化學發(fā)光免疫測定是目前世界公認先進的標記免疫測定技術，化學發(fā)光免疫分析技術具有高度的準確性和特異性，成為檢驗方法中最為重要的技術之一。化學發(fā)光免疫分析技術作為疾病診斷的主要手段已被廣泛用于機體免疫功能、傳染性疾病、內分泌功能、腫瘤

3、標志物、性激素、甲狀腺功能等方面的體外診斷實驗中。現在學習的是第四頁，共31頁化學發(fā)光免疫分析的優(yōu)勢靈敏度高靈敏度高 靈敏度高是化學發(fā)光免疫分析關鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達 10-22 mol/L （ RIA 為 10 -12 mol/L ）?；瘜W發(fā)光免疫分析能夠檢出放射免疫分析和酶聯免疫分析等方法無法檢出的物質，對疾病的早期診斷具有十分重要的意義。 現在學習的是第五頁，共31頁寬的線性動力學范圍寬的線性動力學范圍 發(fā)光強度在 4 6 個量級之間與測定物質濃度間呈線性關系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（ OD 值）為 2.0 的范圍相比，優(yōu)勢明顯。雖然 RIA 也有較寬的線性動力學范圍，但放射性限

4、制了其應用。 光信號持續(xù)時間長光信號持續(xù)時間長輝光型的 CLIA 產生的光信號持續(xù)時間可達數小時甚至一天。簡化了實驗操作及測量。 現在學習的是第六頁，共31頁分析方法簡便快速分析方法簡便快速絕大多數分析測定均為僅需加入一種試劑（或復合試劑）的一步模式。 結果穩(wěn)定、誤差小結果穩(wěn)定、誤差小樣品系直接自己發(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等）給分析帶來的影響，使分析結果靈敏穩(wěn)定可靠。 安全性好及使用期長安全性好及使用期長免除了使用放射性物質。到目前為止，還未發(fā)現其危害性；試劑穩(wěn)定，保存期可達一年。 現在學習的是第七頁，共31頁二、化學發(fā)光免疫分析基本原理 化

5、學發(fā)光免疫分析包含兩個部分, 即免疫反應系統(tǒng)和化學發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應系統(tǒng)是將標記物質標記在抗原或抗體上, 經過特異性免疫反應后,形成抗原2抗體復合物。然后進行對標記物進行檢測, 來測定待檢物?；瘜W發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學發(fā)光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化, 形成一個激發(fā)態(tài)的中間體, 當這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時, 同時發(fā)射出光子, 利用發(fā)光信號測量儀器光量子產率?，F在學習的是第八頁，共31頁2.1 免疫分析原理 免疫分析是利用抗原與抗體特異性結合形成抗原2抗體復合物而建立起來的一種高選擇性的分析方法, 根據其檢測方法可分為非標記免疫分析和標記免疫分析。非標記免疫分析是利用抗原與抗體結

6、合形成抗原2抗體復合物后, 其理化性質發(fā)生改變,出現肉眼可見的沉淀、凝集等現象,利用這些現象來檢測待檢物。標記免疫分析是在不影響抗原、抗體生物活性的基礎上將標記物質標記在抗原或抗體上, 然后進行免疫反應形成抗原2抗體復合物, 再對標記質進行檢測, 從而間接檢測待檢物的方法 。目前常用的標記物有放射性的125 I, 非放射性的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶, 鑭系稀土元素等?，F在學習的是第九頁，共31頁2.2 化學發(fā)光原理 化學發(fā)光(Chemiluminescence, CL)是化學物質在特定化學反應中產生的光輻射。通過高能中間體的分解在化學反應中激發(fā)單態(tài)分子形成,分子被激發(fā)后是不穩(wěn)定的,它要釋放出

7、多余的能量而回到基態(tài),其中部分的能量以發(fā)光形式釋放出來。因此,任何一個化學發(fā)光反應包括兩個過程:激發(fā)和發(fā)光過程。一些激發(fā)態(tài)分子能量也會通過系間串躍和系內串躍而消失。因此,化學發(fā)光反應的效率是:現在學習的是第十頁，共31頁 CL =CEEM (1) 式中,CL為化學發(fā)光效率,CE為生成激發(fā)態(tài)的效率, EM為激發(fā)態(tài)的發(fā)光效率。CE和EM分別定義為：CE = 生成激發(fā)態(tài)的分子數/ 參加反應的分子數 (2)EM = 發(fā)光的分子數/ 生成激發(fā)態(tài)的分子數 (3) 從(1) 、(2) 、(3) 式得化學發(fā)光的效率CL等價于生成熒光和磷光的量子效率。即: CL = 發(fā)光的分子數/ 參加反應的分子數 (4)現在

8、學習的是第十一頁，共31頁2.3 化學發(fā)光免疫分析的原理 化學發(fā)光免疫分析法是化學發(fā)光和免疫分析結合的產物。它同時具有化學發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性?；瘜W發(fā)光免疫分析是用化學發(fā)光反應的試劑標記抗原或抗體, 標記后的抗原和抗體與待測物經過一系列的免疫反應和理化步驟,最后以測定發(fā)光強度形式測定待測物的含量?，F在學習的是第十二頁，共31頁三、化學發(fā)光免疫分析的類型 化學發(fā)光免疫分析法根據其標記物的不同可分為三大類,即化直接化學發(fā)光免疫分析、化學發(fā)光酶免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析法。現在學習的是第十三頁，共31頁 用吖啶酯直接標記抗體用吖啶酯直接標記抗體( (抗原抗原) )，與待測標本中相

9、應，與待測標本中相應的抗原的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體- -待測抗原待測抗原- -吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（劑（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產生的由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待

10、測抗原的含量。曲線上計算出待測抗原的含量。3.1 3.1 直接化學發(fā)光免疫分析直接化學發(fā)光免疫分析現在學習的是第十四頁，共31頁發(fā)光發(fā)光YYY磁微粒磁微粒被測抗原被測抗原+抗體抗體+帶帶吖吖啶酯標啶酯標記物抗體記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后沖洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化學發(fā)光的機理直接化學發(fā)光的機理現在學習的是第十五頁，共31頁磁磁微粒微粒模式圖模式圖Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y Y Y Y Y Y Y Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY

11、YY YY Y特點特點 抗原和抗體結抗原和抗體結合與未合與未結合部結合部分分的的易易分離分離磁微粒磁微粒技術技術現在學習的是第十六頁，共31頁 化學發(fā)光酶免疫分析化學發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學發(fā)光反應的酶如辣）是用參與催化某一化學發(fā)光反應的酶如辣根過氧化物酶（根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶或堿性磷酸酶(ALP)(ALP)來標記抗原或抗體，在與待測來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗原標本中相應的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體- -待測

12、抗原待測抗原- -酶標記抗體復合物，經洗滌后，加入底物酶標記抗體復合物，經洗滌后，加入底物( (發(fā)光劑發(fā)光劑) )，酶催化和分解，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦诺孜锇l(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數據處理系統(tǒng)，計算出測定物號并加以放大，再把它們傳送至計算機數據處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。的濃度。3.23.2、化學發(fā)光酶免疫分析、化學發(fā)光酶免疫分析現在學習的是第十七頁，共31頁該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標記）標記抗體抗體(或抗原或抗原)，在與反應體系中的

13、待測標本和，在與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶（酶（HRP）標記抗體復合物，這時）標記抗體復合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學發(fā)光增強劑使和化學發(fā)光增強劑使產生化學發(fā)光。產生化學發(fā)光。 辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析現在學習的是第十八頁，共31頁辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖 現在學習的是第十九頁，共31頁該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標記抗體標記抗體(或抗原或抗原)，

14、在，在與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體應后，形成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶標記抗體復酶標記抗體復合物，這時加入合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發(fā)光。脫去磷酸根基團而發(fā)光。 堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光免疫分析現在學習的是第二十頁，共31頁堿性磷酸酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖堿性磷酸酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖 現在學習的是第二十一頁，共31頁分配樣品分配樣品,磁顆粒磁顆粒和試劑和試劑孵育孵育使反應物使反應物結合結合在磁場中在磁場

15、中清洗去除清洗去除未結合物質未結合物質加入加入底物底物產生產生信號信號孵育孵育,促使信號促使信號的產生的產生信號信號檢測檢測現在學習的是第二十二頁，共31頁電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以電化學發(fā)光劑三聯吡啶釕標記是以電化學發(fā)光劑三聯吡啶釕標記 抗體抗體( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)為電子供體，為電子供體， 在電場中因電子轉移而發(fā)生特異性化學發(fā)光在電場中因電子轉移而發(fā)生特異性化學發(fā)光 反應，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。反應，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。 3.3

16、 3.3 電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光免疫分析現在學習的是第二十三頁，共31頁在電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗在電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體體( (抗原抗原) )，用三聯吡啶釕標記抗體，用三聯吡啶釕標記抗體( (抗原抗原) )，在反應體系內，在反應體系內待測標本與相應的抗原待測標本與相應的抗原 ( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應后，形成磁發(fā)生免疫反應后，形成磁性微粒包被抗體性微粒包被抗體- -待測抗原待測抗原- -三聯吡啶釕標記抗體復合物，三聯吡啶釕標記抗體復合物，這時將上述復合物吸入流動室，同時引人這時將上述復合物吸入流動室，同時引人TPATPA緩沖

17、液。緩沖液。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此吸引住，而未結合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學發(fā)光反應，使三聯吡啶釕和同時電極加壓，啟動電化學發(fā)光反應，使三聯吡啶釕和TPATPA在電極表面進行電子轉移，產生電化學發(fā)光，光的強度在電極表面進行電子轉移，產生電化學發(fā)光，光的強度與待測抗原的濃度成正比。與待測抗原的濃度成正比?，F在學習的是第二十四頁，共31頁電化學發(fā)光免疫分析示意圖電化學發(fā)光免疫分析示意圖現在學習的是第二十五頁，共31頁電化學發(fā)光免疫測定示意圖

18、電化學發(fā)光免疫測定示意圖現在學習的是第二十六頁，共31頁標記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖標記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖現在學習的是第二十七頁，共31頁 四四、臨床應用臨床應用 1.1.甲狀腺激素甲狀腺激素 2.2.生殖激素生殖激素 3.3.腎上腺腎上腺/ /垂體激素垂體激素 4.4.貧血因子貧血因子 5.5.腫瘤標記物腫瘤標記物 6.6.感染性疾病感染性疾病 7.7.糖尿病糖尿病 8.8.心血管系統(tǒng)心血管系統(tǒng) 9.9.病毒標記物病毒標記物 10.10.骨代謝骨代謝 11.11.過敏性疾病過敏性疾病 12.12.治療藥物監(jiān)測治療藥物監(jiān)測 現在學習的是第二十八頁，共31頁五、發(fā)展與展望 化學發(fā)光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、設備簡單等優(yōu)點，近年來在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測中得到了廣泛運用。實際檢測常常需要對大量、復雜、低豐度的樣品進行測定，因而化學發(fā)光免疫分析法逐漸向快速、高通量、高靈敏檢測的方向發(fā)展。近幾年化學發(fā)光免疫分析法的研究方向主要涉及到降低溫育時間，多組分檢測，以及信號放大技術等。這些例子都證明了化學發(fā)光免疫分析法具有廣泛的應用前景和可操作性?，F在學習的是第二十九頁，共31