化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) (4)

1、關(guān)于化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) (4)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁，共31頁一、一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念二、二、化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理三、三、化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型四、臨床應(yīng)用四、臨床應(yīng)用五、發(fā)展與展望五、發(fā)展與展望現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁，共31頁一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光的強(qiáng)度來確定物化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光的強(qiáng)度來確定物質(zhì)含量的分析方法。化學(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化質(zhì)含量的分析方法。化學(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相

2、結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與待測的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過分離游離態(tài)學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與待測的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過分離游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，加入化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，加入化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗體的定量或定性檢測。體的定量或定性檢測。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁，共31頁 化學(xué)發(fā)光免疫測定是目前世界公認(rèn)先進(jìn)的標(biāo)記免疫測定技術(shù)，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有高度的準(zhǔn)確性和特異性，成為檢驗方法中最為重要的技術(shù)之一?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)作為疾病診斷的主要手段已被廣泛用于機(jī)體免疫功能、傳染性疾病、內(nèi)分泌功能、腫瘤

3、標(biāo)志物、性激素、甲狀腺功能等方面的體外診斷實驗中。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁，共31頁化學(xué)發(fā)光免疫分析的優(yōu)勢靈敏度高靈敏度高 靈敏度高是化學(xué)發(fā)光免疫分析關(guān)鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達(dá) 10-22 mol/L （ RIA 為 10 -12 mol/L ）?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析能夠檢出放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析等方法無法檢出的物質(zhì)，對疾病的早期診斷具有十分重要的意義。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁，共31頁寬的線性動力學(xué)范圍寬的線性動力學(xué)范圍 發(fā)光強(qiáng)度在 4 6 個量級之間與測定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（ OD 值）為 2.0 的范圍相比，優(yōu)勢明顯。雖然 RIA 也有較寬的線性動力學(xué)范圍，但放射性限

4、制了其應(yīng)用。 光信號持續(xù)時間長光信號持續(xù)時間長輝光型的 CLIA 產(chǎn)生的光信號持續(xù)時間可達(dá)數(shù)小時甚至一天。簡化了實驗操作及測量。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁，共31頁分析方法簡便快速分析方法簡便快速絕大多數(shù)分析測定均為僅需加入一種試劑（或復(fù)合試劑）的一步模式。 結(jié)果穩(wěn)定、誤差小結(jié)果穩(wěn)定、誤差小樣品系直接自己發(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等）給分析帶來的影響，使分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠。 安全性好及使用期長安全性好及使用期長免除了使用放射性物質(zhì)。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)其危害性；試劑穩(wěn)定，保存期可達(dá)一年。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁，共31頁二、化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理 化

5、學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個部分, 即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或抗體上, 經(jīng)過特異性免疫反應(yīng)后,形成抗原2抗體復(fù)合物。然后進(jìn)行對標(biāo)記物進(jìn)行檢測, 來測定待檢物。化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化, 形成一個激發(fā)態(tài)的中間體, 當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時, 同時發(fā)射出光子, 利用發(fā)光信號測量儀器光量子產(chǎn)率?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁，共31頁2.1 免疫分析原理 免疫分析是利用抗原與抗體特異性結(jié)合形成抗原2抗體復(fù)合物而建立起來的一種高選擇性的分析方法, 根據(jù)其檢測方法可分為非標(biāo)記免疫分析和標(biāo)記免疫分析。非標(biāo)記免疫分析是利用抗原與抗體結(jié)

6、合形成抗原2抗體復(fù)合物后, 其理化性質(zhì)發(fā)生改變,出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集等現(xiàn)象,利用這些現(xiàn)象來檢測待檢物。標(biāo)記免疫分析是在不影響抗原、抗體生物活性的基礎(chǔ)上將標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或抗體上, 然后進(jìn)行免疫反應(yīng)形成抗原2抗體復(fù)合物, 再對標(biāo)記質(zhì)進(jìn)行檢測, 從而間接檢測待檢物的方法 。目前常用的標(biāo)記物有放射性的125 I, 非放射性的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶, 鑭系稀土元素等?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁，共31頁2.2 化學(xué)發(fā)光原理 化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence, CL)是化學(xué)物質(zhì)在特定化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的光輻射。通過高能中間體的分解在化學(xué)反應(yīng)中激發(fā)單態(tài)分子形成,分子被激發(fā)后是不穩(wěn)定的,它要釋放出

7、多余的能量而回到基態(tài),其中部分的能量以發(fā)光形式釋放出來。因此,任何一個化學(xué)發(fā)光反應(yīng)包括兩個過程:激發(fā)和發(fā)光過程。一些激發(fā)態(tài)分子能量也會通過系間串躍和系內(nèi)串躍而消失。因此,化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率是:現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁，共31頁 CL =CEEM (1) 式中,CL為化學(xué)發(fā)光效率,CE為生成激發(fā)態(tài)的效率, EM為激發(fā)態(tài)的發(fā)光效率。CE和EM分別定義為：CE = 生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù)/ 參加反應(yīng)的分子數(shù) (2)EM = 發(fā)光的分子數(shù)/ 生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù) (3) 從(1) 、(2) 、(3) 式得化學(xué)發(fā)光的效率CL等價于生成熒光和磷光的量子效率。即: CL = 發(fā)光的分子數(shù)/ 參加反應(yīng)的分子數(shù) (4)現(xiàn)在

8、學(xué)習(xí)的是第十一頁，共31頁2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理 化學(xué)發(fā)光免疫分析法是化學(xué)發(fā)光和免疫分析結(jié)合的產(chǎn)物。它同時具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性。化學(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試劑標(biāo)記抗原或抗體, 標(biāo)記后的抗原和抗體與待測物經(jīng)過一系列的免疫反應(yīng)和理化步驟,最后以測定發(fā)光強(qiáng)度形式測定待測物的含量?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁，共31頁三、化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 化學(xué)發(fā)光免疫分析法根據(jù)其標(biāo)記物的不同可分為三大類,即化直接化學(xué)發(fā)光免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁，共31頁 用吖啶酯直接標(biāo)記抗體用吖啶酯直接標(biāo)記抗體( (抗原抗原) )，與待測標(biāo)本中相

9、應(yīng)，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體- -待測抗原待測抗原- -吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化劑（劑（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出待

10、測抗原的含量。曲線上計算出待測抗原的含量。3.1 3.1 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析直接化學(xué)發(fā)光免疫分析現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁，共31頁發(fā)光發(fā)光YYY磁微粒磁微粒被測抗原被測抗原+抗體抗體+帶帶吖吖啶酯標(biāo)啶酯標(biāo)記物抗體記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后沖洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁，共31頁磁磁微粒微粒模式圖模式圖Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y Y Y Y Y Y Y Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY

11、YY YY Y特點特點 抗原和抗體結(jié)抗原和抗體結(jié)合與未合與未結(jié)合部結(jié)合部分分的的易易分離分離磁微粒磁微粒技術(shù)技術(shù)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十六頁，共31頁 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶或堿性磷酸酶(ALP)(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原標(biāo)本中相應(yīng)的抗原( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體- -待測

12、抗原待測抗原- -酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物( (發(fā)光劑發(fā)光劑) )，酶催化和分解，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦诺孜锇l(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯螅侔阉鼈儌魉椭劣嬎銠C(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物號并加以放大，再把它們傳送至計算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。的濃度。3.23.2、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁，共31頁該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記）標(biāo)記抗體抗體(或抗原或抗原)，在與反應(yīng)體系中的

13、待測標(biāo)本和，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶（酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁，共31頁辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁，共31頁該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體(或抗原或抗原)，

14、在，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時加入合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。 堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁，共31頁堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁，共31頁分配樣品分配樣品,磁顆粒磁顆粒和試劑和試劑孵育孵育使反應(yīng)物使反應(yīng)物結(jié)合結(jié)合在磁場中在磁場

15、中清洗去除清洗去除未結(jié)合物質(zhì)未結(jié)合物質(zhì)加入加入底物底物產(chǎn)生產(chǎn)生信號信號孵育孵育,促使信號促使信號的產(chǎn)生的產(chǎn)生信號信號檢測檢測現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁，共31頁電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記 抗體抗體( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)為電子供體，為電子供體， 在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光 反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。 3.3

16、 3.3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁，共31頁在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體體( (抗原抗原) )，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體( (抗原抗原) )，在反應(yīng)體系內(nèi)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗原待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗原 ( (抗體抗體) )發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體性微粒包被抗體- -待測抗原待測抗原- -三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時將上述復(fù)合物吸入流動室，同時引人這時將上述復(fù)合物吸入流動室，同時引人TPATPA緩沖

17、液。緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和同時電極加壓，啟動電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPATPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測抗原的濃度成正比。與待測抗原的濃度成正比。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十四頁，共31頁電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁，共31頁電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖

18、電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十六頁，共31頁標(biāo)記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖標(biāo)記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十七頁，共31頁 四四、臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用 1.1.甲狀腺激素甲狀腺激素 2.2.生殖激素生殖激素 3.3.腎上腺腎上腺/ /垂體激素垂體激素 4.4.貧血因子貧血因子 5.5.腫瘤標(biāo)記物腫瘤標(biāo)記物 6.6.感染性疾病感染性疾病 7.7.糖尿病糖尿病 8.8.心血管系統(tǒng)心血管系統(tǒng) 9.9.病毒標(biāo)記物病毒標(biāo)記物 10.10.骨代謝骨代謝 11.11.過敏性疾病過敏性疾病 12.12.治療藥物監(jiān)測治療藥物監(jiān)測 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十八頁，共31頁五、發(fā)展與展望 化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、設(shè)備簡單等優(yōu)點，近年來在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測中得到了廣泛運用。實際檢測常常需要對大量、復(fù)雜、低豐度的樣品進(jìn)行測定，因而化學(xué)發(fā)光免疫分析法逐漸向快速、高通量、高靈敏檢測的方向發(fā)展。近幾年化學(xué)發(fā)光免疫分析法的研究方向主要涉及到降低溫育時間，多組分檢測，以及信號放大技術(shù)等。這些例子都證明了化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有廣泛的應(yīng)用前景和可操作性?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十九頁，共31