14可見(jiàn)分光光度法ppt課件

1、第六章第六章 儀器分析儀器分析上海市醫(yī)藥學(xué)校上海市醫(yī)藥學(xué)校Office:Office:藥物分析課題組藥物分析課題組2模塊一模塊一 紫外分光光度法紫外分光光度法第二節(jié)第二節(jié) 分光光度法分光光度法學(xué)習(xí)內(nèi)容：學(xué)習(xí)內(nèi)容： 了解比色法和分光光度法的根本原理；了解比色法和分光光度法的根本原理；了解紫外分光光度計(jì)的根本原理了解紫外分光光度計(jì)的根本原理 學(xué)會(huì)紫外分光光度計(jì)的保養(yǎng)；學(xué)會(huì)紫外分光光度計(jì)的保養(yǎng)；任務(wù)內(nèi)容：任務(wù)內(nèi)容：規(guī)范操作規(guī)范操作722s分光光度計(jì)分光光度計(jì) 規(guī)范操作規(guī)范操作755B紫外分光光度計(jì)紫外分光光度計(jì)3任務(wù)義務(wù)一任務(wù)義務(wù)一v運(yùn)用運(yùn)用722S722S型分光光度計(jì)測(cè)定高錳酸鉀的吸收光線型分光光

2、度計(jì)測(cè)定高錳酸鉀的吸收光線v運(yùn)用運(yùn)用722S722S型分光光度計(jì)測(cè)定高錳酸鉀溶液的濃度型分光光度計(jì)測(cè)定高錳酸鉀溶液的濃度v繪制規(guī)范曲線繪制規(guī)范曲線v測(cè)定未知樣品的吸光度測(cè)定未知樣品的吸光度v求算未知樣品的濃度求算未知樣品的濃度v思索題的討論思索題的討論v完成實(shí)訓(xùn)報(bào)告書(shū)完成實(shí)訓(xùn)報(bào)告書(shū)4義務(wù)一：義務(wù)一： 722S 722S型分光光度計(jì)的操作步驟型分光光度計(jì)的操作步驟v 開(kāi)機(jī)、預(yù)熱開(kāi)機(jī)、預(yù)熱 v 確定濾光片位置確定濾光片位置v 本儀器備有減少雜散光，提高本儀器備有減少雜散光，提高340380nm340380nm波段光度準(zhǔn)確性的波段光度準(zhǔn)確性的濾光片，位于樣品室內(nèi)側(cè)，用一撥桿來(lái)改動(dòng)位置。濾光片，位于樣

3、品室內(nèi)側(cè)，用一撥桿來(lái)改動(dòng)位置。v 當(dāng)測(cè)試波長(zhǎng)在當(dāng)測(cè)試波長(zhǎng)在340380nm340380nm波段內(nèi)如作高精度測(cè)試可將撥桿推波段內(nèi)如作高精度測(cè)試可將撥桿推向前，向前，v 通?？刹贿\(yùn)用此濾光片，可將撥桿置在通?？刹贿\(yùn)用此濾光片，可將撥桿置在4001000nm4001000nm位置。位置。5v 調(diào)整波長(zhǎng)調(diào)整波長(zhǎng)v 運(yùn)用儀器上波長(zhǎng)調(diào)理旋鈕，即可方便地調(diào)整儀器當(dāng)前測(cè)試運(yùn)用儀器上波長(zhǎng)調(diào)理旋鈕，即可方便地調(diào)整儀器當(dāng)前測(cè)試波長(zhǎng)，詳細(xì)波長(zhǎng)由旋鈕左側(cè)的顯示窗顯示，讀波長(zhǎng)數(shù)時(shí)目波長(zhǎng)，詳細(xì)波長(zhǎng)由旋鈕左側(cè)的顯示窗顯示，讀波長(zhǎng)數(shù)時(shí)目光垂直察看。光垂直察看。v 調(diào)整功能鍵調(diào)整功能鍵 v TRANS.TRANS.透射比透射比v

4、 ABS.ABS.吸光度吸光度v FACT.FACT.濃度因子濃度因子v CONC.CONC.濃度直讀濃度直讀義務(wù)一：義務(wù)一： 722S 722S型分光光度計(jì)的操作步驟型分光光度計(jì)的操作步驟6v 調(diào)整透光率調(diào)整透光率v 功能鍵放置于功能鍵放置于“T Tv 調(diào)調(diào)100%100%：將用作背景的空白：將用作背景的空白樣品置入樣品室光路中蓋下樣品置入樣品室光路中蓋下試樣蓋同時(shí)翻開(kāi)光門(mén)，試樣蓋同時(shí)翻開(kāi)光門(mén)，按下按下“100%T100%T鍵即能自動(dòng)調(diào)鍵即能自動(dòng)調(diào)整整100%T100%T一次有誤差時(shí)可加一次有誤差時(shí)可加按一次。按一次。v 調(diào)調(diào)0%0%：翻開(kāi)試樣蓋封鎖光：翻開(kāi)試樣蓋封鎖光門(mén)或用不透光資料在樣品

5、門(mén)或用不透光資料在樣品室中遮斷光路，然后按室中遮斷光路，然后按“0%0%鍵，即能自動(dòng)調(diào)整零位。鍵，即能自動(dòng)調(diào)整零位。 義務(wù)一：義務(wù)一： 722S 722S型分光光度計(jì)的操作步驟型分光光度計(jì)的操作步驟7v 測(cè)定吸光度測(cè)定吸光度v 功能鍵放置于功能鍵放置于“A Av 改動(dòng)試樣槽位置讓不同樣品進(jìn)入光路改動(dòng)試樣槽位置讓不同樣品進(jìn)入光路v 儀器規(guī)范配置中試樣槽架是四位置的，用儀器前面的試樣儀器規(guī)范配置中試樣槽架是四位置的，用儀器前面的試樣槽拉桿來(lái)改動(dòng)，翻開(kāi)樣品室蓋以便察看樣品槽中的樣檔次槽拉桿來(lái)改動(dòng)，翻開(kāi)樣品室蓋以便察看樣品槽中的樣檔次置最接近測(cè)試者的為置最接近測(cè)試者的為“0 0位置，依次向外拉出相應(yīng)的

6、為位置，依次向外拉出相應(yīng)的為“1 1“2 2“3 3位置，當(dāng)拉桿到位時(shí)有定位感，到位時(shí)請(qǐng)前后位置，當(dāng)拉桿到位時(shí)有定位感，到位時(shí)請(qǐng)前后悄然推進(jìn)一下以確定定位正確。悄然推進(jìn)一下以確定定位正確。v 讀取數(shù)值并記錄。讀取數(shù)值并記錄。義務(wù)一：義務(wù)一： 722S 722S型分光光度計(jì)的操作步驟型分光光度計(jì)的操作步驟8義務(wù)二：吸收光譜曲線的繪制義務(wù)二：吸收光譜曲線的繪制教師演示教師演示v 規(guī)范溶液的配制規(guī)范溶液的配制v 準(zhǔn)確稱(chēng)取高錳酸鉀基準(zhǔn)準(zhǔn)確稱(chēng)取高錳酸鉀基準(zhǔn)0.125g,0.125g,在小燒杯中溶解，定量移在小燒杯中溶解，定量移入入1000mL1000mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。容量瓶中，加蒸

7、餾水稀釋至刻度，搖勻。v 試樣預(yù)備試樣預(yù)備v 汲取上述規(guī)范溶液汲取上述規(guī)范溶液20mL20mL于于50mL50mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻度，搖勻v 測(cè)定測(cè)定v 1cm 1cm比色皿，以蒸餾水作空白比色皿，以蒸餾水作空白v 波長(zhǎng)選擇：波長(zhǎng)選擇：450450、460460、480480、500500、520520、v 525525此處多項(xiàng)選擇幾點(diǎn)、此處多項(xiàng)選擇幾點(diǎn)、530530、540540、560560、580580、600600v 分別測(cè)定個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度分別測(cè)定個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度A A。v 繪制吸收光譜曲線繪制吸收光譜曲線v 以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸收度為縱坐

8、標(biāo)，繪制曲線以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸收度為縱坐標(biāo)，繪制曲線v 找出最大波長(zhǎng)找出最大波長(zhǎng)maxmax。0(nm)525A9義務(wù)三：規(guī)范曲線的繪制義務(wù)三：規(guī)范曲線的繪制學(xué)生分組實(shí)訓(xùn)學(xué)生分組實(shí)訓(xùn)v規(guī)范系列溶液規(guī)范系列溶液v取取6 6只只25ml25ml的容量瓶，分別精細(xì)參與高錳酸鉀規(guī)范的容量瓶，分別精細(xì)參與高錳酸鉀規(guī)范溶液溶液0.000.00、1.001.00、2.002.00、3.003.00、4.004.00、5.00ml,5.00ml,加加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻蒸餾水稀釋至刻度，搖勻v測(cè)定測(cè)定v波長(zhǎng)選定為波長(zhǎng)選定為maxmax，以，以1 1號(hào)為空白號(hào)為空白v依次測(cè)定依次測(cè)定2626號(hào)規(guī)范系列比色液

9、的吸光度號(hào)規(guī)范系列比色液的吸光度A A值。值。v繪制規(guī)范曲線繪制規(guī)范曲線v以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)v準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)曲線。10義務(wù)四：樣品的測(cè)定義務(wù)四：樣品的測(cè)定學(xué)生分組實(shí)訓(xùn)學(xué)生分組實(shí)訓(xùn)v樣品試液的配制樣品試液的配制v取取1 1只只25ml25ml的容量瓶，精細(xì)參與高錳酸鉀樣品液的容量瓶，精細(xì)參與高錳酸鉀樣品液5.00ml,5.00ml,約含約含KMnO40.5mgKMnO40.5mg, ,加蒸餾水稀釋至刻度加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。，搖勻。v測(cè)定吸光度測(cè)定吸光度v在一樣條件下，測(cè)定樣品的吸光度在一樣條件下，測(cè)定樣品的吸光度v計(jì)算計(jì)算v從規(guī)范曲線上

10、查出相應(yīng)濃度的從規(guī)范曲線上查出相應(yīng)濃度的KMnO4KMnO4v濃度，即為樣品比色液的濃度。濃度，即為樣品比色液的濃度。11概述概述v光譜分析光譜分析v含義：根據(jù)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收及光的吸收含義：根據(jù)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收及光的吸收定律對(duì)物質(zhì)進(jìn)展定性和定量分析的分析方法。定律對(duì)物質(zhì)進(jìn)展定性和定量分析的分析方法。 v分類(lèi)：比色法、分光光度法分類(lèi)：比色法、分光光度法v比色法比色法v含義：比色分析法簡(jiǎn)稱(chēng)比色法就是經(jīng)過(guò)比含義：比色分析法簡(jiǎn)稱(chēng)比色法就是經(jīng)過(guò)比較有色物質(zhì)溶液顏色深淺測(cè)定物質(zhì)含量的分析較有色物質(zhì)溶液顏色深淺測(cè)定物質(zhì)含量的分析方法。方法。v分類(lèi)：目視比色法、光電比色法分類(lèi)：目視比色法、光電比色法

11、12v目視比色法目視比色法v規(guī)范系列比色液規(guī)范系列比色液v樣品液與規(guī)范液比色樣品液與規(guī)范液比色概述概述一致一致13v 分光光度法分光光度法v 含義：根據(jù)物質(zhì)對(duì)一定波長(zhǎng)光線的吸收程度已確定物質(zhì)含量含義：根據(jù)物質(zhì)對(duì)一定波長(zhǎng)光線的吸收程度已確定物質(zhì)含量的分析方法。運(yùn)用棱鏡或光柵作為分光器，用光電管和檢流的分析方法。運(yùn)用棱鏡或光柵作為分光器，用光電管和檢流計(jì)丈量溶液透射光的強(qiáng)度，并直接表示出透光率和吸收度，計(jì)丈量溶液透射光的強(qiáng)度，并直接表示出透光率和吸收度，從而求得被測(cè)液濃度或含量。從而求得被測(cè)液濃度或含量。v 分類(lèi)：紫外可見(jiàn)分光光度法、紅外分光光度法分類(lèi)：紫外可見(jiàn)分光光度法、紅外分光光度法一、概述一

12、、概述14一、比色法和分光光度法特點(diǎn)一、比色法和分光光度法特點(diǎn)v靈敏度高靈敏度高v 適用于丈量微量物質(zhì)，最低濃度為適用于丈量微量物質(zhì)，最低濃度為10-5-10-10-5-10-7mol/L7mol/L，v有一定的準(zhǔn)確度有一定的準(zhǔn)確度v 比色法相對(duì)誤差為比色法相對(duì)誤差為5-20%5-20%，分光光度法的相對(duì)誤差，分光光度法的相對(duì)誤差為為2%-5%2%-5%v操作簡(jiǎn)便，測(cè)定快速操作簡(jiǎn)便，測(cè)定快速v 只需求幾分鐘到十幾分鐘，甚至更短只需求幾分鐘到十幾分鐘，甚至更短v運(yùn)用范圍廣運(yùn)用范圍廣v 幾乎一切的無(wú)機(jī)離子和許多有機(jī)化合物均可直接幾乎一切的無(wú)機(jī)離子和許多有機(jī)化合物均可直接或間接地用比色法或分光光度法

13、測(cè)定或間接地用比色法或分光光度法測(cè)定15二、比色法和分光光度法的原理二、比色法和分光光度法的原理比色法和分光光度法的根據(jù)是物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收比色法和分光光度法的根據(jù)是物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收光的根本性質(zhì)光的根本性質(zhì)光的波長(zhǎng)與其能量或頻率成反比關(guān)系光的波長(zhǎng)與其能量或頻率成反比關(guān)系 光的波長(zhǎng)越短，頻率或能量越高光的波長(zhǎng)越短，頻率或能量越高光的波長(zhǎng)越長(zhǎng)，頻率或能量越低光的波長(zhǎng)越長(zhǎng)，頻率或能量越低波粒二象性波粒二象性ChhEE光子的能量；h普朗克常數(shù)；C光的傳播速度光的頻率，Hz；光的波長(zhǎng)，nm16二、比色法和分光光度法的原理二、比色法和分光光度法的原理v 常用波長(zhǎng)來(lái)表示各種不同的電磁輻射v 人眼睛能覺(jué)察到

14、的波段稱(chēng)為可見(jiàn)光，波長(zhǎng)范圍400-760nmv 紅外線(760nm)、紫外線400nm、X射線v 按照電磁波波長(zhǎng)大小順序可把電磁波劃分成幾個(gè)區(qū)域，叫做光譜區(qū)域，由各光譜區(qū)域按順序排成的系列叫做電磁波譜17電磁波譜電磁波譜181.1.光的性質(zhì)光的性質(zhì)v 單一波長(zhǎng)的光稱(chēng)為單色光單一波長(zhǎng)的光稱(chēng)為單色光v 由不同波長(zhǎng)的光混合而成的光稱(chēng)為復(fù)由不同波長(zhǎng)的光混合而成的光稱(chēng)為復(fù)合光合光v 讓一束白光經(jīng)過(guò)棱鏡，可分解為紅、讓一束白光經(jīng)過(guò)棱鏡，可分解為紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫七種顏色的橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫七種顏色的光，這種景象稱(chēng)為光的色散光，這種景象稱(chēng)為光的色散v 將兩種適當(dāng)顏色的單色光按一定強(qiáng)度將兩種適當(dāng)顏

15、色的單色光按一定強(qiáng)度比例混合可成為白光，這兩種單色光比例混合可成為白光，這兩種單色光稱(chēng)為互補(bǔ)色光。稱(chēng)為互補(bǔ)色光。19互補(bǔ)色光互補(bǔ)色光202.2.吸收光譜吸收光譜v 吸收光譜曲線吸收光譜曲線v 將不同波長(zhǎng)的單色光依次經(jīng)過(guò)一定濃度的溶液，丈量每一將不同波長(zhǎng)的單色光依次經(jīng)過(guò)一定濃度的溶液，丈量每一波長(zhǎng)下溶液對(duì)各種單色光的吸收程度吸收度波長(zhǎng)下溶液對(duì)各種單色光的吸收程度吸收度A A，然后，然后以波長(zhǎng)以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)、吸收度為橫坐標(biāo)、吸收度A A為縱坐標(biāo)作圖，即為縱坐標(biāo)作圖，即得一吸收光譜曲線。得一吸收光譜曲線。v 吸收度最大處所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱(chēng)為最大吸收波長(zhǎng)，吸收度最大處所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱(chēng)為最大吸收波長(zhǎng)，maxm

16、ax物質(zhì)吸收不同波長(zhǎng)的光的特性物質(zhì)吸收不同波長(zhǎng)的光的特性只與溶液中物質(zhì)的構(gòu)造有關(guān)只與溶液中物質(zhì)的構(gòu)造有關(guān), ,與溶液的濃度無(wú)關(guān)與溶液的濃度無(wú)關(guān). .不同物質(zhì)的光譜曲線不同不同物質(zhì)的光譜曲線不同吸收光譜曲線作為定性的根據(jù)吸收光譜曲線作為定性的根據(jù)A/nm525021 將不同波長(zhǎng)的單色光依將不同波長(zhǎng)的單色光依次經(jīng)過(guò)一定濃度的溶液，次經(jīng)過(guò)一定濃度的溶液，丈量每一波長(zhǎng)下溶液對(duì)丈量每一波長(zhǎng)下溶液對(duì)各種單色光的吸收程度各種單色光的吸收程度A A，以波長(zhǎng)，以波長(zhǎng)為為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)得到的一條曲線。標(biāo)得到的一條曲線。濃度越大，吸收峰越高無(wú)關(guān)與溶液濃度Cmax峰谷吸收光譜曲線吸收光譜曲

17、線max22LI0ItIa I0 = Ia + I0 = Ia + ItIt透光率透光率吸光度吸光度%1000IITtTATAlg 1lg或或3.3.光的吸收定律光的吸收定律23朗伯朗伯- -比爾定律比爾定律v 含義含義v 當(dāng)一束平行的單色光經(jīng)過(guò)均勻、無(wú)散射景象的溶液時(shí)，在當(dāng)一束平行的單色光經(jīng)過(guò)均勻、無(wú)散射景象的溶液時(shí)，在單色光強(qiáng)度、溶液溫度等條件不變的情況下，溶液的吸光度單色光強(qiáng)度、溶液溫度等條件不變的情況下，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比。與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比。v 運(yùn)用范圍運(yùn)用范圍v 適用于單色光和一定范圍的低濃度溶液適用于單色光和一定范圍的低濃度溶液v

18、溶液濃度過(guò)大，透光性質(zhì)發(fā)生變化，吸光度與濃度不成正溶液濃度過(guò)大，透光性質(zhì)發(fā)生變化，吸光度與濃度不成正比關(guān)系比關(guān)系v 波長(zhǎng)較寬的混合光影響光的互補(bǔ)吸收，也會(huì)使測(cè)定產(chǎn)生誤波長(zhǎng)較寬的混合光影響光的互補(bǔ)吸收，也會(huì)使測(cè)定產(chǎn)生誤差差A(yù) = KcL24v吸收系數(shù)吸收系數(shù)(K)(K)也稱(chēng)吸光系數(shù)也稱(chēng)吸光系數(shù)v百分吸收系數(shù)比吸收系數(shù)百分吸收系數(shù)比吸收系數(shù)v摩爾吸收系數(shù)摩爾吸收系數(shù) v = = v= = A = K c L=c(g/100mL) L(cm)AA c(mol/L) L(cm)10M濃度為濃度為1%(g/100mL)的溶液的溶液厚度為厚度為1cm時(shí)的吸光度，時(shí)的吸光度，單位是單位是mL/(gcm)濃度

19、為濃度為1mol/L的溶液的溶液厚度為厚度為1cm時(shí)的吸光度，時(shí)的吸光度，單位是單位是L/(molcm)25v吸收系數(shù)在一定條件下是常數(shù)吸收系數(shù)在一定條件下是常數(shù)v與入射光的波長(zhǎng)、物質(zhì)的性質(zhì)、溶劑、溫度及儀與入射光的波長(zhǎng)、物質(zhì)的性質(zhì)、溶劑、溫度及儀器的質(zhì)量等要素有關(guān)器的質(zhì)量等要素有關(guān)v數(shù)值越大，闡明有色溶液對(duì)光越容易吸收，測(cè)定數(shù)值越大，闡明有色溶液對(duì)光越容易吸收，測(cè)定的靈敏度越高的靈敏度越高v普通普通值在值在103103以上，即可進(jìn)展分光光度測(cè)定以上，即可進(jìn)展分光光度測(cè)定v吸收系數(shù)是定性和定量分析的重要根據(jù)吸收系數(shù)是定性和定量分析的重要根據(jù)26運(yùn)用運(yùn)用v氯霉素氯霉素M=323.15g/molM=323.15g/mol的水溶液，在的水溶液，在278nm278nm處有最處有最大吸收，設(shè)用純品配制大吸收，設(shè)用純品配制100mL100mL含氯霉素含氯霉素2.00mg2.00mg的溶液的溶液，以，以1cm1cm的吸收池，在的吸收池，在278nm278nm處測(cè)得吸光度為處測(cè)得吸光度為0.6140.614，求求和和v有一濃度一定的溶液