食品化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、目的掌握Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法，熟悉分光光度計(jì)的操作。二、原理Folin-酚試劑法包括兩步反響：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑Folin試劑復(fù)原，產(chǎn)生深藍(lán)色磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物，顏色深一、目的掌握Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法，熟悉分光光度計(jì)的操作。二、原理Foli n-酚試劑法包括兩步反響：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑Folin試劑復(fù)原，產(chǎn)生深藍(lán)色磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此

2、法操作簡(jiǎn)便，靈敏度比雙縮脲法高 100倍，定量范圍為5100卩g蛋白質(zhì)。Folin試劑顯色反響由酪氨酸、色氨酸和半胱氨 酸引起，因此樣品中假設(shè)含有酚類(lèi)、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白 質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑1 .實(shí)驗(yàn)材料綠豆芽下胚軸也可用其它材料如面粉2 .儀器1722型或721型分光光度計(jì)24 000r/min 的離心機(jī)3丨分析天平4丨容量瓶50mL5丨量筒6移液管0.5mL、1mL、5mL3 .試劑純度均為分析純10. 5mol/L NaOH(2)試劑甲：A稱(chēng)取10g Na2CO3, 2g NaOH和0.25g酒石酸鉀鈉

3、，溶解后用蒸餾水定容至 500mL。B稱(chēng)取0.5g CuSO4 5H2O,溶解后用蒸餾水定容至 100mL。每次使用前將A液50份 與B液1份，即為試劑甲，其有效期為1d，過(guò)期失效。3丨試劑乙：在1.5L容積的磨口回流器中參加100g鎢酸鈉Na2WO4 2H2O和700mL蒸餾水，再加50mL 85 %磷酸和100mL濃鹽酸充分混勻，接上回流冷凝管，以小火回流10h?；亓鹘Y(jié)束后，參加150g硫酸鋰和50mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15min，驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后溶液呈黃色倘假設(shè)仍呈綠色，再滴加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)沸騰15min丨。然后稀釋至1L ,過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存，使用前大約

4、加水1倍，使最終濃度相當(dāng)于1mol/L。四、操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1配制標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精確稱(chēng)取0.0250g結(jié)晶牛血清白蛋白，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，燒杯內(nèi)的殘液用少量蒸餾水沖洗數(shù)次，沖洗液一并倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，那么配成250卩g/mL的牛血清白蛋白溶液。2丨系列標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普通試管，按表1參加標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛血清白蛋白溶液和蒸餾水， 配成一系列不同濃度的牛血清白蛋白溶液。然后各加試劑甲5mL,混合后在室溫下放置 10min，再各加0.5試劑乙，立即混合均勻這一步速度要快，否那么 會(huì)使顯色程度減弱。

5、30min后，以不含蛋白質(zhì)的 1號(hào)試管為對(duì)照，用 722型分光光度 計(jì)于650nm波長(zhǎng)下測(cè)定各試管中溶液的光密度并記錄結(jié)果。表i牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制作試列管號(hào)1234S600.20 40.*5QS1.01.00 80.60.40.2C蛋白頂含星(U酌0501001502002501標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以牛血清白蛋白含量(ig為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 樣品的提取及測(cè)定1準(zhǔn)確稱(chēng)取綠豆芽下胚軸1g，放入研缽中，加蒸餾水 2mL，研磨勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)入離心管，并用 6mL蒸餾水分次將研缽中的殘?jiān)慈腚x心管，離心4 000r/min、20min。將上清液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容到

6、刻度，作為待測(cè)液備用。2取普通試管2支，各參加待測(cè)溶液1mL ,分別參加試劑甲5mL ,混勻后放置10min , 再各加試劑乙0.5mL，迅速混勻，室溫放置 30min，于650nm 波長(zhǎng)下測(cè)定光密度，并記 錄結(jié)果。五、結(jié)果計(jì)算計(jì)算出兩重復(fù)樣品光密度的平均值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量X yg ,再按以下公式計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的百分含量。X世£廠稀I樣站中蛋白質(zhì)含量俠=100六、附注1進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加 Folin試劑要特別小心，因?yàn)?Folin試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定, 但此實(shí)驗(yàn)的反響只是在pH10的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加試劑乙Folin試劑時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸

7、試劑被破壞之前即能發(fā)生復(fù)原反響，否那么會(huì)使顯色程度減 弱。2丨本法也可用于游離酪氨酸和色氨酸含量測(cè)定。七、思考題1 .含有什么氨基酸的蛋白質(zhì)能與Foli n-酚試劑呈藍(lán)色反響？2 測(cè)定蛋白質(zhì)含量除 Foli n-酚試劑顯色法以外，還可以用什么方法？參考答案1 .含有酚基的氨基酸酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸能與Foli n-酚試劑反響呈藍(lán)色，因?yàn)镕oli n-酚試劑在堿性溶液中極不穩(wěn)定，易被酚類(lèi)化合物復(fù)原為藍(lán)色化合物鉬蘭和鎢蘭混 合物。2除 Folin- 酚試劑顯色法以外， 紫外吸收法也可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。 蛋白質(zhì)在 280nm 下具有最大的吸收值，這是由于含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的

8、。假設(shè)將不 同濃度的蛋白質(zhì)在 280nm 處測(cè)定，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求得未知溶液的蛋白質(zhì)濃度。蛋白酶活力的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解堿性蛋白酶活力測(cè)定的原理；2、掌握堿性蛋白酶活力測(cè)定的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白酶在一定條件下不僅能夠水解蛋白質(zhì)中的肽鍵， 也能夠水解酰胺鍵和酯 鍵，因此可用蛋白質(zhì)或人工合成的酰胺及酯類(lèi)化合物作為底物來(lái)測(cè)定蛋白酶的活 力。本實(shí)驗(yàn)選用酪蛋白為底物， 測(cè)定微生物蛋白酶水解肽鍵的活力。 酪蛋白經(jīng)蛋 白酶作用后， 降解成相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸， 在反響混合物中參加三氯 醋酸溶液， 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和肽就沉淀下來(lái)， 相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽 和氨基酸仍留在溶液中， 溶解

9、于三氯醋酸溶液中的肽的數(shù)量正比于酶的數(shù)量和反 應(yīng)時(shí)間。在 280nm 波長(zhǎng)下測(cè)定溶液吸光度的增加，就可計(jì)算酶的活力。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、將5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37 C下保溫。2、取四支 15ml 具塞試管，分別標(biāo)上記號(hào) A1,A0,B1 和 B0 。在 A1 和 A0 試管 中各吸入 0.20ml 酶液，在 B1 和 B0 試管中各吸入 0.40ml 酶液，分別用 0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液定容至2.00ml。在A0和B0試管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶 液，上述四支試管都置于37 C水浴中保溫。3、在各試管中吸入2.00ml1%酪蛋白溶液，在37 C下保溫10min(準(zhǔn)確計(jì)

10、時(shí)) 后，再向 A1 和 B1 試管中吸入 6.00ml5% 三氯醋酸溶液。4、獎(jiǎng)試管從水浴中取出，在室溫下放置1h，用少量上清液潤(rùn)濕濾紙后過(guò)濾，保 留濾出液。5、在280nm波長(zhǎng)下，分別以A0和B0濾液為空白，測(cè)定A1和B1濾液的吸 光度。三、實(shí)驗(yàn)試劑 微生物蛋白酶萃取液0.01g/ml：稱(chēng)取1.0g酶制劑，加100ml蒸餾水?dāng)嚢?30min，在4 °C下離心別離后，將上層清夜置于冰箱中保存，使用前稀釋一定倍 數(shù)； 0.02mol/L 磷酸鹽緩沖液 PH7.5 ； 1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液PH7.5,加熱并攪拌使它完全分散，然后

11、置于冰箱中保存； 5%三氯醋酸TCA溶液。四、計(jì)算1 、在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下，以每分鐘增加 0.001 吸光度定義為一個(gè)酶單位。2、每克酶制劑中沒(méi)活力的計(jì)算：?A X 1000 / (t X w)酶活力單位/克酶制劑式中，？ A樣品與空白吸光度差值即 A1和B1的吸光值；酶作用時(shí)間本實(shí)驗(yàn)為10min丨；w反響中酶的用量，g五、說(shuō)明1、微生物蛋白酶粗提取液在較寬廣的 PH 范圍表現(xiàn)出活力，但是在接近中性條 件下最有最高活力。2、微生物蛋白酶在45 C以下可保持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性。六、數(shù)據(jù)記錄與處理酶活力 1 = ?A X 1000 / (t X w)XX105酶活力單位/克酶制劑酶活力 2= ?A

12、X 1000 / (t X w)XX105 酶活力單位 /克酶制劑X105X105=141375 酶活力單位 /克酶制劑平均相對(duì)相差 = 143250 - 139500 /141375 X 100%=2.65%七、思考題1 、蛋白酶有哪幾類(lèi)？答：按蛋白酶水解蛋白質(zhì)的方式：A內(nèi)肽酶：切開(kāi)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵， 生成相對(duì)分子質(zhì)量較小的多肽類(lèi)； B 外肽酶： 切開(kāi)蛋白質(zhì)或多肽分子氨基或羧基 末端的肽鍵，而游離出氨基酸的酶類(lèi)；C水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵；D水解蛋白 質(zhì)或多肽的酰胺鍵。按酶的來(lái)源可分為：動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋 白酶 微生物蛋白酶又可分為： 細(xì)菌蛋白酶、 霉菌蛋白酶、 酵母蛋白酶和放

13、線菌蛋白 酶 按蛋白酶作用的最適 PH 可以分為 APH2.55.0 的酸性蛋白酶， BPH9.510.5 的堿性蛋白酶， CPH78 的中性蛋白酶 2、影響酶活力的因素有哪些？ 答：酶活力是酶催化某一化學(xué)反響的速率來(lái)表示的。 酶活力的大小即酶含量 的多少，可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來(lái)表示， 酶活力的測(cè) 定也就是測(cè)定酶促反響的速率。 酶濃度對(duì)酶活力的影響： 酶促反響速率與酶分子的濃度呈正比， 在一定范 圍內(nèi)，當(dāng)?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r(shí)，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。 底物濃度對(duì)酶活力的影響： 假設(shè)酶的濃度為定值， 底物的起始濃度越低時(shí)， 酶促反響速度與底物濃度呈正比， 即隨地物濃度的增加而增加。 當(dāng)所有的酶與底 物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后， 即使再增加底物濃度， 中間產(chǎn)物濃度也不會(huì)增加， 酶促 反響速度也不會(huì)增加。 溫度對(duì)酶活力的影響： 在適宜的溫度范圍內(nèi)， 酶促反響速度隨溫度升高而 增加，超過(guò)最適反響溫度，酶活力將會(huì)下降。 PH對(duì)酶活力的影響：酶在最適 PH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適 PH，都會(huì)降低酶活性。 激活劑對(duì)酶活力的影響： 某些無(wú)機(jī)陽(yáng)離子、 陰離子、有機(jī)化合物可作為激 活劑，能夠激活酶，使其表現(xiàn)出催化活性或強(qiáng)化其催化活性。 抑制劑對(duì)酶活力的影