反向遺傳學(xué)及其相關(guān)技術(shù)

1、現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁，共75頁一、概述一、概述（一）遺傳研究的二條途徑（一）遺傳研究的二條途徑1、表、表里：里：正向遺傳學(xué)研究正向遺傳學(xué)研究雜交或誘變雜交或誘變表型觀察表型觀察遺傳規(guī)律遺傳規(guī)律確定存在的基確定存在的基因及數(shù)目因及數(shù)目基因的功能及作用性質(zhì)。基因的功能及作用性質(zhì)。這一途徑是從生物體的性狀、表型變化來研究遺傳這一途徑是從生物體的性狀、表型變化來研究遺傳物質(zhì)的組成、分布與傳遞規(guī)律，屬于正向遺傳學(xué)采物質(zhì)的組成、分布與傳遞規(guī)律，屬于正向遺傳學(xué)采用的研究方法。用的研究方法?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁，共75頁2、里里表：表：反向遺傳學(xué)研究反向遺傳學(xué)研究在已知在已知DNA序列的基礎(chǔ)上，通過序列的基礎(chǔ)上，

2、通過DNA重組、定重組、定點突變、插入點突變、插入/缺失等缺失等遺傳修飾遺傳修飾手段創(chuàng)造突變體手段創(chuàng)造突變體并研究突變所造成的表型效應(yīng)，從而研究基因的生并研究突變所造成的表型效應(yīng)，從而研究基因的生物學(xué)功能，闡明生命的本質(zhì)現(xiàn)象與規(guī)律。物學(xué)功能，闡明生命的本質(zhì)現(xiàn)象與規(guī)律。與反向遺傳學(xué)相關(guān)的遺傳操作技術(shù)為反向遺傳與反向遺傳學(xué)相關(guān)的遺傳操作技術(shù)為反向遺傳學(xué)技術(shù)。學(xué)技術(shù)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁，共75頁（二）（二）RNA病毒的反向遺傳學(xué)病毒的反向遺傳學(xué) n 采用病毒的遺傳材料，在培養(yǎng)細胞或易感宿主中重新采用病毒的遺傳材料，在培養(yǎng)細胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或類似病毒物質(zhì)。拯救出活病毒或類似病毒物質(zhì)。 n

3、 能夠拯救病毒的遺傳材料稱為能夠拯救病毒的遺傳材料稱為感染性克隆感染性克隆，一般是在，一般是在細菌質(zhì)粒中含有整個病毒基因組的細菌質(zhì)粒中含有整個病毒基因組的cDNA拷貝拷貝，使得，使得cDNA本身或從本身或從cDNA體外轉(zhuǎn)錄所得的體外轉(zhuǎn)錄所得的RNA具有感染性具有感染性。 n RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)通過定向修飾病毒的基因組序列病毒的反向遺傳系統(tǒng)通過定向修飾病毒的基因組序列，檢測被拯救的人工改造病毒的表型，可以在體內(nèi)，檢測被拯救的人工改造病毒的表型，可以在體內(nèi)(in vivo)有效地研究病毒基因結(jié)構(gòu)、功能和病毒有效地研究病毒基因結(jié)構(gòu)、功能和病毒-宿主相宿主相互作用?；プ饔?。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁，

4、共75頁nRNA病毒的反向遺傳操作病毒的反向遺傳操作 RT-PCR構(gòu)建構(gòu)建RNA病毒的全長病毒的全長cDNA，并進行遺傳修飾，并進行遺傳修飾 與與RNA聚合酶啟動子結(jié)合聚合酶啟動子結(jié)合 體外轉(zhuǎn)錄病毒體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA 轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄物RNA感染哺乳動物細胞感染哺乳動物細胞 拯救到活病毒拯救到活病毒 拯救病毒的表型變化拯救病毒的表型變化 病毒基因組的表達、調(diào)控、致病機理、病毒基因組的表達、調(diào)控、致病機理、 病毒與宿主細胞互作、疫苗制造等病毒與宿主細胞互作、疫苗制造等現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁，共75頁單正股單正股RNA病毒：病毒：RNA聚合酶聚合酶+mRNA + +中間型中間型 結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白+子代正股子

5、代正股RNA單負股單負股RNA病毒：病毒：RNA聚合酶聚合酶 +結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白子代負股子代負股RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNARNA/DNA中間體中間體逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA/DNA宿主宿主子代子代RNA正股正股RNA與負股與負股RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒?現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁，共75頁（三）真核生物的反向遺傳學(xué)（三）真核生物的反向遺傳學(xué)采用反向遺傳學(xué)鑒定基因功能是真核生物功能采用反向遺傳學(xué)鑒定基因功能是真核生物功能基因組學(xué)的主要內(nèi)容?；蚪M學(xué)的主要內(nèi)容。研究手段包括基因的互補實驗、超表達、反義研究手段包括基因的互補實驗、超表達、反義抑制、基因敲除抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷

6、阱、基因基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。激活等手段。利用基因敲除或基因沉默而產(chǎn)生的功能變化研利用基因敲除或基因沉默而產(chǎn)生的功能變化研究基因功能是主要的反向遺傳學(xué)技術(shù)。究基因功能是主要的反向遺傳學(xué)技術(shù)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁，共75頁二、反向遺傳學(xué)相關(guān)技術(shù)二、反向遺傳學(xué)相關(guān)技術(shù)1、基因的同源重組、基因的同源重組2、基因的位點突變、基因的位點突變3、基因沉默、基因沉默基因敲除基因敲除現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁，共75頁利用利用DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)，將含有目的基因和靶基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，將含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體導(dǎo)入靶細胞，通過載體與同源片段的重組載體導(dǎo)入靶細胞，通過載體與靶細胞染色體上同源序列間的重組，

7、將外源基靶細胞染色體上同源序列間的重組，將外源基因整合入內(nèi)源基因組內(nèi)，使外源基因得以表達因整合入內(nèi)源基因組內(nèi)，使外源基因得以表達。通過研究靶細胞或者個體在目的基因插入前后遺傳通過研究靶細胞或者個體在目的基因插入前后遺傳特性的改變，達到研究基因功能的目的。特性的改變，達到研究基因功能的目的。1、基因的同源重組、基因的同源重組現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁，共75頁 完全敲除：通過同源重組直接將靶基因在細完全敲除：通過同源重組直接將靶基因在細胞或者動物個體中的活性完全消除。胞或者動物個體中的活性完全消除。 條件敲除：將某個基因的修飾限制于特定類條件敲除：將某個基因的修飾限制于特定類型的細胞或個體發(fā)育特定的階段

8、。型的細胞或個體發(fā)育特定的階段。完全敲除完全敲除條件敲除條件敲除特定組織特定組織/時間基因敲除時間基因敲除基因敲除基因敲除現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁，共75頁1）通過同源重組的基因敲除步驟）通過同源重組的基因敲除步驟構(gòu)建重組載體構(gòu)建重組載體 重組重組DNA轉(zhuǎn)入受體細轉(zhuǎn)入受體細胞核內(nèi)胞核內(nèi) 篩選目的細胞篩選目的細胞 轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)基因生物重組載體的類型：重組載體的類型：a)替換性載體系統(tǒng)：替換性載體系統(tǒng)：包括同源序列片段、替換包括同源序列片段、替換基因的啟動子、報道基因基因的啟動子、報道基因等成分。等成分。b)插入性載體系統(tǒng)：插入性載體系統(tǒng)：插入基因片段插入基因片段(目的基因目的基因)、同源序列片段、標志

9、基因、同源序列片段、標志基因片段。片段?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁，共75頁用替換型（用替換型（a）或插入型（）或插入型（b）載體進行完全基因敲除）載體進行完全基因敲除實驗實驗現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁，共75頁2）Res同源重組系統(tǒng)同源重組系統(tǒng)源于源于噬菌體噬菌體Res重組酶的重組系統(tǒng)重組酶的重組系統(tǒng)Ha 和和Hb: 同源重組區(qū)域同源重組區(qū)域 Pa 和和Pb: 引物位點引物位點sm: 篩選標記篩選標記Red 同源重組技術(shù)用于基因打靶同源重組技術(shù)用于基因打靶現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁，共75頁3）Cre-LoxP同源重組系統(tǒng)同源重組系統(tǒng) 源自源自P1噬菌體的重組系統(tǒng)噬菌體的重組系統(tǒng) 屬于傳統(tǒng)的同源重組載體，但具

10、有時空調(diào)控的功能。屬于傳統(tǒng)的同源重組載體，但具有時空調(diào)控的功能。該系統(tǒng)由該系統(tǒng)由P1噬菌體的噬菌體的Cre重組酶和重組酶和LoxP位點兩部分組位點兩部分組成。成。nCre重組酶：重組酶：由Cre基因編碼，識別LoxP位點，介導(dǎo)兩介導(dǎo)兩個個LoxPLoxP位點（序列）之間的特異性重組，使位點（序列）之間的特異性重組，使LoxPLoxP位點間位點間的基因序列被刪除或重組。的基因序列被刪除或重組。n LoxP位點：位點：由2個13bp的反向重復(fù)序列和1個8bp的間隔區(qū)域構(gòu)成?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁，共75頁Cre酶 Cre酶 Cre酶 CreCre重組酶重組酶13bp的反向重復(fù)序列的反向重復(fù)序列 現(xiàn)在

11、學(xué)習(xí)的是第十五頁，共75頁Cre-LoxP 重組系統(tǒng)的特點重組系統(tǒng)的特點 Cre 重組酶所催化的是一個可逆的重組事件重組酶所催化的是一個可逆的重組事件 Cre催化重組不需要任何輔助因子的參與催化重組不需要任何輔助因子的參與介導(dǎo)兩個同向介導(dǎo)兩個同向LoxP位點之間序列的插入位點之間序列的插入/缺失（下左）缺失（下左） 介導(dǎo)兩個反向介導(dǎo)兩個反向LoxP位點之間序列顛倒（下右）位點之間序列顛倒（下右） 介導(dǎo)兩條含介導(dǎo)兩條含LoxP位點位點DNA鏈的交換或染色體易位。鏈的交換或染色體易位。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十六頁，共75頁Cre-Loxp gene knock-out system現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁，

12、共75頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁，共75頁模式動物小模式動物小鼠中完全基鼠中完全基因敲除的步因敲除的步聚聚近交系，白色近交系，白色，易產(chǎn)生免疫，易產(chǎn)生免疫缺陷缺陷 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁，共75頁2、基因的位點突變、基因的位點突變1）點突變）點突變TILLING技術(shù)技術(shù)TILLING (targeting induced local lesions in genomes) 定向誘導(dǎo)基因組局部突變定向誘導(dǎo)基因組局部突變，是一種快速有效地從由化學(xué)誘變劑，是一種快速有效地從由化學(xué)誘變劑(EMS)誘變過的突變?nèi)后w中鑒定出點突變的方法。誘變過的突變?nèi)后w中鑒定出點突變的方法。 先用化學(xué)誘變劑先用化學(xué)誘變劑(甲基

13、磺酸乙酯，甲基磺酸乙酯，EMS)誘發(fā)產(chǎn)生一系列誘發(fā)產(chǎn)生一系列的的點突變點突變，再用設(shè)計的特異性引物進行，再用設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增，擴增，然后將然后將PCR擴增產(chǎn)物變性和退火形成異源雙鏈核酸分子擴增產(chǎn)物變性和退火形成異源雙鏈核酸分子，再用特異切割錯配的內(nèi)切酶，再用特異切割錯配的內(nèi)切酶CELl酶切，最后變性處理酶切，最后變性處理后采用雙色聚丙烯酰胺凝膠后采用雙色聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳檢測分析。電泳檢測分析?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁，共75頁（建池）（建池）現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁，共75頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁，共75頁TILLING特點：特點： TILLING技術(shù)屬于高頻率點突變和技

14、術(shù)屬于高頻率點突變和PCR篩選相結(jié)合的篩選相結(jié)合的技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)基因的錯義突變、基因截短型損傷等突變類技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)基因的錯義突變、基因截短型損傷等突變類型。型。u可獲得大量的等位基因系列，對長度很小基因，復(fù)等位基可獲得大量的等位基因系列，對長度很小基因，復(fù)等位基因等具有獨特的技術(shù)優(yōu)勢。因等具有獨特的技術(shù)優(yōu)勢。u可誘導(dǎo)產(chǎn)生高頻率的點突變，篩選目的基因需要較小可誘導(dǎo)產(chǎn)生高頻率的點突變，篩選目的基因需要較小的突變?nèi)后w。的突變?nèi)后w。u不依賴于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標簽系統(tǒng)，無需耗時的不依賴于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或內(nèi)源標簽系統(tǒng)，無需耗時的轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因和復(fù)雜的組織培養(yǎng)。u需要知道所研究基因的序列。

15、需要知道所研究基因的序列?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁，共75頁2）隨機插入突變）隨機插入突變T-DNA插入突變插入突變 以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的一種插入突變研究方法，根以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的一種插入突變研究方法，根據(jù)插入位點的基因序列與植物表型變異等的相互關(guān)系可以據(jù)插入位點的基因序列與植物表型變異等的相互關(guān)系可以從基因組中分離出相應(yīng)的基因并鑒定其功能。從基因組中分離出相應(yīng)的基因并鑒定其功能。構(gòu)建構(gòu)建T-DNA載體載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化突變體的篩選及遺傳分析突變體的篩選及遺傳分析分離分離T-DNA 插入位點的側(cè)翼序列插入位點的側(cè)翼序列基因的定位、結(jié)基因的定位、結(jié)構(gòu)與功能分析。構(gòu)與功能分析?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第

16、二十四頁，共75頁T-DNA法敲除植物基因及法敲除植物基因及突變體篩選：突變體篩選： a.引物設(shè)計。引物設(shè)計。LP和和RP分別分別代表插入基因兩端的引物，代表插入基因兩端的引物，LB是指載體上的一段是指載體上的一段 引物。引物。旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的DNA序列。序列。 b. PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。分產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和純合別代表野生型、雜合子和純合子子PCR條帶。條帶。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁，共75頁T-DNA插入特點：插入特點：n 不能控制其在生物體基因組中的插入位點。在植物中用不能控制其在生物體基因組中的插入位點。在植物中用T-DNA 插入來敲除一

17、個特定基因仍需要運氣。插入來敲除一個特定基因仍需要運氣。n 隱性突變與顯性突變：隱性隱性突變與顯性突變：隱性表型的變化只能在轉(zhuǎn)表型的變化只能在轉(zhuǎn)化體的部分后代中體現(xiàn)出來（基因敲除）；顯性化體的部分后代中體現(xiàn)出來（基因敲除）；顯性可以在轉(zhuǎn)化體中直接觀察到（基因激活）?？梢栽谵D(zhuǎn)化體中直接觀察到（基因激活）。n 某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不體現(xiàn)出功某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不體現(xiàn)出功能的喪失。原因：重要的功能基因突變致死和冗余基因能的喪失。原因：重要的功能基因突變致死和冗余基因。n 染色體重排：突變體表型與染色體重排：突變體表型與T-DNA 插入無關(guān)。插入無關(guān)。n 效率不高，

18、工作量大。建立飽和的突變體庫。效率不高，工作量大。建立飽和的突變體庫?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十六頁，共75頁轉(zhuǎn)座子插入突變轉(zhuǎn)座子插入突變利用某些能隨機插入基因序列的轉(zhuǎn)座子，在目標細胞基因組中利用某些能隨機插入基因序列的轉(zhuǎn)座子，在目標細胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應(yīng)的標記進行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細胞。后通過相應(yīng)的標記進行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細胞。由轉(zhuǎn)座子引起的突變可以轉(zhuǎn)座子由轉(zhuǎn)座子引起的突變可以轉(zhuǎn)座子DNA為探針，從突變體的為探針，從突變體的基因組基因組DNA文庫中篩選到突變的基因，再利用這部分序文庫

19、中篩選到突變的基因，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因。列從野生型基因文庫中獲得完整的基因。也可以利用也可以利用PCR的方法擴增轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列，進而得的方法擴增轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列，進而得到完整的基因信息。到完整的基因信息?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十七頁，共75頁轉(zhuǎn)座子插入特點：轉(zhuǎn)座子插入特點： 插入的是完整的元件，便于分析。插入的是完整的元件，便于分析。 可從插入位點切除，產(chǎn)生回復(fù)突變，因此不僅可以據(jù)此確可從插入位點切除，產(chǎn)生回復(fù)突變，因此不僅可以據(jù)此確認真正由轉(zhuǎn)座子引起的突變，還可以進一步驗證突變基因認真正由轉(zhuǎn)座子引起的突變，還可以進一步驗證突變基因的功能。的功能。 轉(zhuǎn)座子傾向于插入轉(zhuǎn)

20、座子的臨近區(qū)域，可以用來研究轉(zhuǎn)座子傾向于插入轉(zhuǎn)座子的臨近區(qū)域，可以用來研究基因組某一局部區(qū)域的結(jié)構(gòu)?；蚪M某一局部區(qū)域的結(jié)構(gòu)。 通過不斷跳動產(chǎn)生新的突變，相對較少的起始轉(zhuǎn)化系通過不斷跳動產(chǎn)生新的突變，相對較少的起始轉(zhuǎn)化系就可以獲得整個基因組的飽和突變，大大減少了工作就可以獲得整個基因組的飽和突變，大大減少了工作量。量?？梢詰?yīng)用于轉(zhuǎn)化效率不高的植物?？梢詰?yīng)用于轉(zhuǎn)化效率不高的植物?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十八頁，共75頁轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng) Ac/ Ds 系統(tǒng)系統(tǒng) 由自主性元件（由自主性元件（Ac）和非自主性元件（）和非自主性元件（Ds）構(gòu)成）構(gòu)成。Ds元件能夠在元件能夠在Ac編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下移動，去

21、除編碼的轉(zhuǎn)座酶的作用下移動，去除Ac元件可使其自身不能轉(zhuǎn)座。元件可使其自身不能轉(zhuǎn)座。I. 通過遺傳雜交引入自主性元件，轉(zhuǎn)座子插入序列通過遺傳雜交引入自主性元件，轉(zhuǎn)座子插入序列可以重新移動。因此，可以重新移動。因此，Ac/Ds 轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)只需轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)只需要少量的轉(zhuǎn)基因品系（啟動品系）作為轉(zhuǎn)座源即可要少量的轉(zhuǎn)基因品系（啟動品系）作為轉(zhuǎn)座源即可?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十九頁，共75頁在真核系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)座插入事件常不能產(chǎn)生可見在真核系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)座插入事件常不能產(chǎn)生可見的表型，這是因為功能基因的冗余或在早期產(chǎn)的表型，這是因為功能基因的冗余或在早期產(chǎn)生致死效應(yīng)。采用經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)座子可克服這些生致死效應(yīng)。采用

22、經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)座子可克服這些困難。困難。修飾：轉(zhuǎn)座因子后帶一個報告基因，報告基因修飾：轉(zhuǎn)座因子后帶一個報告基因，報告基因的表達只有在轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的情況下才能獲得的表達只有在轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的情況下才能獲得，這樣就可以通過報告基因來檢測轉(zhuǎn)座子的表，這樣就可以通過報告基因來檢測轉(zhuǎn)座子的表達情況。達情況。修飾的修飾的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十頁，共75頁n增強子陷阱增強子陷阱( enhancer trap )：轉(zhuǎn)座子含有：轉(zhuǎn)座子含有一個具弱小啟動子驅(qū)動的報告基因。報告基因的一個具弱小啟動子驅(qū)動的報告基因。報告基因的表達只有在轉(zhuǎn)座發(fā)生在內(nèi)源增強子附近時才能獲表達只有在轉(zhuǎn)座發(fā)生在內(nèi)源增強子

23、附近時才能獲得。得。n啟動子陷阱啟動子陷阱(promoter trap)：轉(zhuǎn)座子帶有一：轉(zhuǎn)座子帶有一個無啟動子的報告基因，這個基因只有在轉(zhuǎn)座個無啟動子的報告基因，這個基因只有在轉(zhuǎn)座子插入一個植物活躍的內(nèi)源啟動子下游時才能子插入一個植物活躍的內(nèi)源啟動子下游時才能表達。表達。修飾的方法修飾的方法-增強子陷阱與啟動子陷阱增強子陷阱與啟動子陷阱現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十一頁，共75頁Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)n 轉(zhuǎn)座子打靶載體是以兩種噬菌體轉(zhuǎn)座子打靶載體是以兩種噬菌體Mu為基礎(chǔ)的為基礎(chǔ)的mini-Mu轉(zhuǎn)座子，每個轉(zhuǎn)座子上都攜帶標記基因。轉(zhuǎn)座子，每個轉(zhuǎn)座子上都攜帶標記基因。n 可以在擬刪除基因兩側(cè)各插入一個可以在

24、擬刪除基因兩側(cè)各插入一個mini-Mu轉(zhuǎn)座子，轉(zhuǎn)座子，然后在兩個插入位點之間制造缺失。然后在兩個插入位點之間制造缺失。n 這種缺失可以使兩個轉(zhuǎn)座子加上靶區(qū)之間的部分基因轉(zhuǎn)這種缺失可以使兩個轉(zhuǎn)座子加上靶區(qū)之間的部分基因轉(zhuǎn)移。移。n 特點：特點：u 不需要知道基因組序列，僅已知外顯子即可不需要知道基因組序列，僅已知外顯子即可u 載體構(gòu)建迅速，技術(shù)簡單載體構(gòu)建迅速，技術(shù)簡單u 載體可以攜帶多種不同抗性基因，可以同時處理多載體可以攜帶多種不同抗性基因，可以同時處理多基因?；颉，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十二頁，共75頁三、基因沉默技術(shù)三、基因沉默技術(shù) 反義反義RNA RNA干擾干擾（RNAi）現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十

25、三頁，共75頁 反義反義RNA技術(shù)技術(shù)反義反義RNA技術(shù)是根據(jù)技術(shù)是根據(jù)RNA序列人工合成的互補序列人工合成的互補RNA。根據(jù)反義根據(jù)反義RNA的作用機制可將其分為三類：的作用機制可將其分為三類：1、反義、反義RNA是直接作用于靶是直接作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點或與靶的核蛋白體結(jié)合位點或與靶mRNA直接結(jié)合形成雙鏈直接結(jié)合形成雙鏈RNA，從而直接抑制，從而直接抑制mRNA的翻譯的翻譯或被或被RNA酶酶識別降解。識別降解。2、反義、反義RNA是與是與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象構(gòu)象的變化，從而抑制其翻譯。的變化，從而抑制其翻譯。3、反義、反義RNA是作用于

26、基因的啟動子，直接抑制靶是作用于基因的啟動子，直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十四頁，共75頁RNA干擾干擾(RNA interference，RNAi)與靶基因序列同源的雙鏈與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導(dǎo)的一所誘導(dǎo)的一種序列特異性轉(zhuǎn)錄后種序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默基因沉默現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 RNA干擾干擾現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十五頁，共75頁基因沉默基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PT

27、GS)基因沉默基因沉默現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十六頁，共75頁 轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（TGSTGS）是指基因在細胞核內(nèi)是指基因在細胞核內(nèi)RNARNA合成受合成受到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。到了阻止而導(dǎo)致基因沉默。轉(zhuǎn)錄水平基因沉默可以通過有性世代轉(zhuǎn)錄水平基因沉默可以通過有性世代傳遞，表現(xiàn)為減數(shù)分裂的可遺傳性。傳遞，表現(xiàn)為減數(shù)分裂的可遺傳性。 引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的機制主要有以下幾種：引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的機制主要有以下幾種： 基因及其啟動子甲基化基因及其啟動子甲基化：通常發(fā)生在通常發(fā)生在DNADNA的的CGCG序列的堿基上，該序列的堿基上，該區(qū)域堿基甲基化往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受抑制區(qū)域堿基甲基化往

28、往導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受抑制。 同源基因間的反式失活同源基因間的反式失活：擁有同源序列的沉默位點和其他位點的擁有同源序列的沉默位點和其他位點的DNADNA的相互作用而引起的基因沉默的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的基因能作為一甲基化并失活的基因能作為一種種“沉默子沉默子”，對其他具有同源性的靶基因施加一種反式作用，使，對其他具有同源性的靶基因施加一種反式作用，使具有同源序列的靶基因發(fā)生甲基化并導(dǎo)致失活。反式失活的靶基具有同源序列的靶基因發(fā)生甲基化并導(dǎo)致失活。反式失活的靶基因既可以與沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。因既可以與沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十七頁，共

29、75頁后成修飾作用導(dǎo)致的基因沉默后成修飾作用導(dǎo)致的基因沉默：指轉(zhuǎn)基因的序列和堿基組成不指轉(zhuǎn)基因的序列和堿基組成不發(fā)生改變，但是其功能卻在個體發(fā)育的某一階段受到細胞內(nèi)因發(fā)生改變，但是其功能卻在個體發(fā)育的某一階段受到細胞內(nèi)因子的修飾作用后而關(guān)閉。子的修飾作用后而關(guān)閉。這種修飾作用所造成的轉(zhuǎn)基因沉默是可以這種修飾作用所造成的轉(zhuǎn)基因沉默是可以隨著修飾作用的解除而被消除。隨著修飾作用的解除而被消除。后成修飾作用導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默與后成修飾作用導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因沉默與受體植物的核型構(gòu)成有關(guān)。受體植物的核型構(gòu)成有關(guān)。重復(fù)序列重復(fù)序列：外源基因如果以多拷貝形式整合到同一位點上，形成外源基因如果以多拷貝形式整合到同一位

30、點上，形成首尾相連的正向重復(fù)或頭對頭、尾對尾的反向重復(fù)，則不能表達首尾相連的正向重復(fù)或頭對頭、尾對尾的反向重復(fù)，則不能表達，而且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象越嚴重。這種重復(fù)序列誘導(dǎo)的，而且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象越嚴重。這種重復(fù)序列誘導(dǎo)的基因沉默可能是重復(fù)序列間自發(fā)配對，甲基化酶特異性識別這種基因沉默可能是重復(fù)序列間自發(fā)配對，甲基化酶特異性識別這種配對結(jié)構(gòu)而使其甲基化，從而抑制其表達。配對結(jié)構(gòu)而使其甲基化，從而抑制其表達?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十八頁，共75頁 轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默（PTGSPTGS）則是指基因能夠在細胞核則是指基因能夠在細胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的里被穩(wěn)

31、定地轉(zhuǎn)錄，但在細胞質(zhì)里卻無相應(yīng)的mRNAmRNA存在的存在的現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制主要有以下幾種：引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制主要有以下幾種： 共抑制共抑制：由由NapoliNapoli在轉(zhuǎn)在轉(zhuǎn)CHSCHS基因的矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)，普遍存基因的矮牽牛花中發(fā)現(xiàn)，普遍存在于轉(zhuǎn)基因植物中。其發(fā)生是由于外源基因編碼區(qū)與受體在于轉(zhuǎn)基因植物中。其發(fā)生是由于外源基因編碼區(qū)與受體細胞基因間存在同源性而導(dǎo)致外源基因與內(nèi)源基因的表達細胞基因間存在同源性而導(dǎo)致外源基因與內(nèi)源基因的表達同時受到抑制。同時受到抑制。 具有同源性的外基因和內(nèi)源基因在細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄速具有同源性的外基因和內(nèi)源基因在細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)

32、錄速率很高，但在細胞質(zhì)內(nèi)無率很高，但在細胞質(zhì)內(nèi)無mRNAmRNA積累，是典型的轉(zhuǎn)錄后水積累，是典型的轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。共抑制的產(chǎn)生不僅同內(nèi)、外源基因間編碼平基因沉默。共抑制的產(chǎn)生不僅同內(nèi)、外源基因間編碼區(qū)的同源性有關(guān)，還與控制外源基因的啟動子的強度等區(qū)的同源性有關(guān)，還與控制外源基因的啟動子的強度等因素有關(guān)。因素有關(guān)。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十九頁，共75頁 基因壓制基因壓制：CogoniCogoni等首先在粗糙脈孢霉的轉(zhuǎn)化實驗中等首先在粗糙脈孢霉的轉(zhuǎn)化實驗中發(fā)現(xiàn)，外源基因可以抑制自身和相應(yīng)內(nèi)源基因的表達，發(fā)現(xiàn)，外源基因可以抑制自身和相應(yīng)內(nèi)源基因的表達，他們把這一現(xiàn)象定為基因壓制?；驂褐剖强赡娴?，

33、而他們把這一現(xiàn)象定為基因壓制?；驂褐剖强赡娴?，而且這種逆轉(zhuǎn)會伴隨有外源拷貝的丟失?；驂褐瓢l(fā)生在且這種逆轉(zhuǎn)會伴隨有外源拷貝的丟失。基因壓制發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，導(dǎo)致已復(fù)制的穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)錄后水平，導(dǎo)致已復(fù)制的穩(wěn)定態(tài)mRNAmRNA大量減少。大量減少。 RNARNA干擾干擾：指將與靶基因的指將與靶基因的mRNAmRNA同源互補的雙鏈同源互補的雙鏈RNA (dsRNA) RNA (dsRNA) 導(dǎo)入細胞后并被切割成導(dǎo)入細胞后并被切割成21212323個核個核苷酸長度的短核苷酸雙鏈，在其它作用因子的參苷酸長度的短核苷酸雙鏈，在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的與下能夠特異地與其同源的mRNAmRNA結(jié)

34、合并導(dǎo)致其降結(jié)合并導(dǎo)致其降解，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。解，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十頁，共75頁RNAi是植物、果蠅、線蟲和包括哺乳動物在內(nèi)的許多是植物、果蠅、線蟲和包括哺乳動物在內(nèi)的許多生物抵抗病毒感染和限制轉(zhuǎn)座子運動的一種自然存在的生物抵抗病毒感染和限制轉(zhuǎn)座子運動的一種自然存在的防御機制。防御機制。RNAi可以作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺可以作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，來制備特定基因缺失表型的個體，從而研傳工具，來制備特定基因缺失表型的個體，從而研究該基因的功能究該基因的功能. 這項技術(shù)在疾病的基因治療上也有光明的應(yīng)用前景。特別這項技術(shù)在疾

35、病的基因治療上也有光明的應(yīng)用前景。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達，或者由蛋白過量表達可以用于阻斷某些突變基因的表達，或者由蛋白過量表達引起的疾病。引起的疾病?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十一頁，共75頁( (二二) )、RNARNA干擾的發(fā)現(xiàn)干擾的發(fā)現(xiàn) 19941994年年 CogoniCogoni等證明真菌中亦有類等證明真菌中亦有類似現(xiàn)象，此稱為似現(xiàn)象，此稱為基因壓制基因壓制(quelling)(quelling)。共抑制現(xiàn)象共抑制現(xiàn)象(cosuppression)(cosuppression)上世紀上世紀9090年代初，年代初，美國和荷蘭的兩美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實驗組在對矮牽牛個轉(zhuǎn)基因植物實

36、驗組在對矮牽牛( (petuniaspetunias) )的研究中發(fā)現(xiàn)的研究中發(fā)現(xiàn): :轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒有新基因表達，反而使原有的色素基因也受到了，反而使原有的色素基因也受到了抑制。抑制?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十二頁，共75頁19951995年，康乃爾大學(xué)的年，康乃爾大學(xué)的Su GuoSu Guo博士在試圖阻博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)(C.elegans)的的par-1par-1基基因?qū)嶒炛邪l(fā)現(xiàn)：因?qū)嶒炛邪l(fā)現(xiàn)：反義反義RNARNA與正義與正義RNARNA（對照）都能切斷（對照）都能切斷par-1par-1基因的表達。該研究小組一

37、直未能給這基因的表達。該研究小組一直未能給這個意外以合理解釋。個意外以合理解釋。 Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620.秀麗新小桿線蟲轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炐沱愋滦U線蟲轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灧戳x反義RNA與正義與正義RNA？反義RNA -與靶核酸與靶核酸(如如mRNA或有義或有義DNA)鏈互補的鏈互補的RNA分子，分子，可抑制靶核酸的功能?？梢种瓢泻怂岬墓δ堋?正義正義RNA-與與mRNA對應(yīng)的對應(yīng)的RNA分子。分子。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十三頁，共75頁RNARNA干擾的發(fā)現(xiàn)干擾的發(fā)現(xiàn) 19981998年，年，F(xiàn)ireFire和和MelloMello（美）首次

38、在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象（美）首次在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默基因沉默。他們發(fā)現(xiàn)。他們發(fā)現(xiàn)Su GuoSu Guo博士遇到的正義博士遇到的正義RNARNA抑抑制基因表達的現(xiàn)象，以及過去的反義制基因表達的現(xiàn)象，以及過去的反義RNARNA技術(shù)對基因表達的阻斷，都技術(shù)對基因表達的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNARNA中污染了中污染了微量雙鏈微量雙鏈RNARNA而引起：而引起：將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNARNA純化后注射線蟲，基因抑制效應(yīng)變得十分純化后注射線蟲，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈微弱，而經(jīng)過純化

39、的雙鏈RNARNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達，其抑制基因表達的效率比純化后的反義應(yīng)基因的表達，其抑制基因表達的效率比純化后的反義RNARNA至少至少高高2 2個數(shù)量級。該小組將這一現(xiàn)象稱為個數(shù)量級。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNARNA干擾干擾。 Fire A, Xu S, Montgomery ME, et al. Nature. 1998,391:806-811.現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十四頁，共75頁Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization

40、 probe. （對照，缺（對照，缺mex-3 ，不著色），不著色）(B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). （正常野生型，紫）（正常野生型，紫）(C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be

41、somewhat less than wild type. （野生型野生型+反義反義RNA，淺紫），淺紫）(D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.) （野生型（野生型+雙鏈雙鏈RNA，不著色），不著色）Effects of mex-3 RNA

42、interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization （原位雜交）（原位雜交）of 4-cell stage embryos. 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十五頁，共75頁“沉默沉默”是是金金Fire與與Mello獲獲2006年諾貝爾年諾貝爾獎獎現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十六頁，共75頁在在19991999年一年內(nèi)年一年內(nèi), ,發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)RNARNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌、線干擾現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所蟲、昆蟲、

43、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的幾乎所有的真核生物細胞中。有的真核生物細胞中。20002000年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和年，又先后發(fā)現(xiàn)小鼠早期胚胎中和大腸桿菌中也存在大腸桿菌中也存在RNARNA干擾現(xiàn)象。干擾現(xiàn)象。20002000年提出年提出RNAiRNAi作用機制模型。作用機制模型。Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-3320012001年，年，RNAiRNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動物細胞基因沉默現(xiàn)象。技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動物細胞基因沉默現(xiàn)象。Natur

44、eNature，20012001，411411（68366836）：）：494494498498RNAiRNAi技術(shù)被技術(shù)被ScienceScience評為評為20012001年度的十大科技進展之一。年度的十大科技進展之一。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十七頁，共75頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十八頁，共75頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十九頁，共75頁（三）、（三）、RNARNA干擾的機制干擾的機制 dsRNA：雙鏈：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈。，包含正義鏈和反義鏈。 Dicer：屬于：屬于RNase 家族家族的一員的一員，是，是dsRNA的特異性的特異性核酸內(nèi)切酶，核酸內(nèi)切酶，能以一種能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外

45、依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式引入的雙鏈雙鏈RNA。 siRNA (small interfering RNA) ：小干擾：小干擾RNA，是長，是長度為度為21-23個個nt大小的雙鏈大小的雙鏈RNA，為，為RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)分子。分子。名詞解釋：名詞解釋：現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五十頁，共75頁siRNAslong dsRNA現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五十一頁，共75頁siRNA現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五十二頁，共75頁 RISC(RNA-inducing silencing complex)： RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，是一種核蛋白復(fù)合物，具

46、有核酸內(nèi)誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，是一種核蛋白復(fù)合物，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性。切、外切以及解旋酶活性。 RdRP（RNA-dependent RNA polymerases）：）： 依賴依賴RNA的的RNA聚合酶，是聚合酶，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可可以在生物體內(nèi)傳遞。以在生物體內(nèi)傳遞?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五十三頁，共75頁RISC: RNA-Induced Silencing ComplexExonucleaseHomology search activityEndonucleaseHelicase53Target mRNAOH35P核酸外切酶核酸外切酶 解旋酶解旋酶 核酸內(nèi)

47、切酶核酸內(nèi)切酶 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五十四頁，共75頁dsRNA介導(dǎo)的同源性靶介導(dǎo)的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步：降解過程主要分為兩步：第一步（起始階段）第一步（起始階段）較長較長dsRNA在在ATP參與下，被參與下，被RNase的特異核酸酶切割加工成的特異核酸酶切割加工成2123nt的，由正義和反的，由正義和反義鏈組成的義鏈組成的小干擾小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。）。 siRNA的兩條單鏈末端為的兩條單鏈末端為5-磷酸和磷酸和3-羥基，且羥基，且3端均有端均有2個突出個突出的核苷酸。的核苷酸。 Dicer有解旋酶活性并含有有解旋酶活性并含有 ds

48、DNA結(jié)合域和結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域。Dicer的的類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動物等機體中被發(fā)現(xiàn)。類似物相繼在擬南芥、秀麗線蟲及哺乳動物等機體中被發(fā)現(xiàn)。步驟步驟現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五十五頁，共75頁第二步（效應(yīng)階段）第二步（效應(yīng)階段）siRNA 在在ATP參與下被參與下被RNA解旋酶解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)?；罨幕罨腞ISC在單鏈在單鏈siRNA引導(dǎo)下識別互補的引導(dǎo)下識別互補的mRNA，并在并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從

49、中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對引導(dǎo)鏈中心所對應(yīng)的靶基因位置切割靶應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切，最后可能再被核酸外切酶進一步降解，從而干擾基因表達。酶進一步降解，從而干擾基因表達?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五十六頁，共75頁RNAiRNAi的放大效應(yīng)機制的放大效應(yīng)機制siRNA不僅可引導(dǎo)不僅可引導(dǎo)RISC切割靶切割靶RNA，而且可作為引物，而且可作為引物在在RNA依賴的依賴的RNA聚合酶聚合酶(RdRP)作用下以靶作用下以靶mRNA為為模板合成新的模板合成新的dsRNA。新合成的長鏈新合成的長鏈dsRNA同樣可被同樣可被RNase核酸酶切割、降核酸酶切割、降解而生成大量

50、的解而生成大量的次級次級siRNA。次級。次級siRNA又可進入合成又可進入合成-切割的循環(huán)過程，進一步放大切割的循環(huán)過程，進一步放大RNAi作用。這種合成作用。這種合成-切切割的循環(huán)過程稱為割的循環(huán)過程稱為隨機降解性隨機降解性PCR（random degradative PCR）。）?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五十七頁，共75頁Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.異常的單鏈RNA依賴RNA的RNA聚合酶特異性核酸內(nèi)切酶RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五十八頁，共75頁RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制；是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制；RNAiR

51、NAi具有很高的特異性：具有很高的特異性：只有只有dsRNA才能誘導(dǎo)產(chǎn)生才能誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi；只有針對編碼區(qū)的只有針對編碼區(qū)的dsRNA才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾；才能產(chǎn)生有效的和特異性的干擾；注射同源注射同源dsRNA可以引起內(nèi)源性可以引起內(nèi)源性mRNA特異性的降解；特異性的降解； dsRNAdsRNA不得短于不得短于2121個堿基，大于個堿基，大于30bp30bp的的dsRNAdsRNA不能在哺乳動物中誘不能在哺乳動物中誘導(dǎo)特異的導(dǎo)特異的RNARNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑制凋亡干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑制凋亡； RNAi具有具有高效性高效性： RNAi

52、抑制基因表達具有很高的效率，可達到缺失突變體表型抑制基因表達具有很高的效率，可達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的的程度，而且相對很少量的dsRNA分子就能完全抑制相應(yīng)基分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達，這是通過催化放大的方式進行的；因的表達，這是通過催化放大的方式進行的；RNAi干擾的幾個重要生物學(xué)特征干擾的幾個重要生物學(xué)特征現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五十九頁，共75頁RNAi具有很好的具有很好的穩(wěn)定性穩(wěn)定性：siRNA分子分子33端有突出的非配對堿端有突出的非配對堿基的雙鏈分子，在細胞內(nèi)可穩(wěn)定存在基的雙鏈分子，在細胞內(nèi)可穩(wěn)定存在3- 4d3- 4d，以，以33端懸垂端懸垂TTTT堿基的雙鏈堿基的雙

53、鏈RNARNA尤為穩(wěn)定，半衰期遠長于反義寡聚核苷酸。尤為穩(wěn)定，半衰期遠長于反義寡聚核苷酸。 RNAi的的可傳播性和遺傳性可傳播性和遺傳性：RNAi抑制基因表達的效應(yīng)可以長距離抑制基因表達的效應(yīng)可以長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳給傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳給F1，但，但F2往往往恢復(fù)為野生型。往恢復(fù)為野生型。RNAi效應(yīng)的依賴性：只有連續(xù)產(chǎn)生效應(yīng)的依賴性：只有連續(xù)產(chǎn)生dsRNA才能產(chǎn)生長期效應(yīng)才能產(chǎn)生長期效應(yīng)，否則只產(chǎn)生短暫的沉默反應(yīng)。，否則只產(chǎn)生短暫的沉默反應(yīng)。RNAi作用迅速，作用迅速，mRNA快速降解；快速降解；現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六十頁，共75頁miRNA

54、及其作用機制及其作用機制miRNA(microRNA) : 微小微小RNA，指長度約，指長度約2125nt的小分子單鏈的小分子單鏈RNA，位于基因組的非編碼區(qū)，進化上，位于基因組的非編碼區(qū)，進化上高度保守，可在高度保守，可在翻譯水平上翻譯水平上對基因表達進行調(diào)節(jié)的對基因表達進行調(diào)節(jié)的RNA家族。其介導(dǎo)的沉默機制也屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉家族。其介導(dǎo)的沉默機制也屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。默。miRNA基因的表達具有特定模式基因的表達具有特定模式: 階段特異性和組織特階段特異性和組織特異性，在不同組織中表達有不同類型的異性，在不同組織中表達有不同類型的miRNA，在生物，在生物發(fā)育的不同階段里有不同的發(fā)育的

55、不同階段里有不同的miRNA 表達。表達?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六十一頁，共75頁miRNA的的作用機制作用機制現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六十二頁，共75頁相同點相同點:長度都約長度都約22 nt 左右；左右；同是同是Dicer產(chǎn)物，因此具有產(chǎn)物，因此具有Dicer產(chǎn)物的特點；產(chǎn)物的特點；二者生成都需二者生成都需Argonaute 家族蛋白的存在；家族蛋白的存在；同是同是RISC的組分。的組分。miRNA與與siRNA比較比較現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六十三頁，共75頁 來源不同：來源不同：siRNA來源于轉(zhuǎn)基因或病毒來源于轉(zhuǎn)基因或病毒RNA，由長，由長dsRNA轉(zhuǎn)變而轉(zhuǎn)變而來；來；miRNA來源于內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本，是細胞內(nèi)來源于

56、內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本，是細胞內(nèi)RNA的固有組分之的固有組分之一，由具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的一，由具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的pre-miRNA轉(zhuǎn)變而來；轉(zhuǎn)變而來； 結(jié)構(gòu)不同：結(jié)構(gòu)不同：siRNA主要以雙鏈形式存在，其主要以雙鏈形式存在，其3端存在端存在2個非配對的個非配對的堿基，通常為堿基，通常為UU；miRNA主要以單鏈形式存在；主要以單鏈形式存在； 對靶對靶RNA 的特異性不同：的特異性不同： siRNA與靶與靶mRNA完全互補配對結(jié)合完全互補配對結(jié)合；miRNA與靶與靶RNA并不完全互補，存在錯配現(xiàn)象。靶序列有一個并不完全互補，存在錯配現(xiàn)象。靶序列有一個核苷酸突變，就會影響到核苷酸突變，就會影響到siRNA的作用功能

57、，但不會影響到的作用功能，但不會影響到miRNA的功能；的功能； 作用形式不同：作用形式不同：siRNA主要在轉(zhuǎn)錄后通過降解主要在轉(zhuǎn)錄后通過降解mRNA發(fā)揮作用發(fā)揮作用，而，而miRNA只在蛋白質(zhì)翻譯水平上負調(diào)控靶基因的表達。只在蛋白質(zhì)翻譯水平上負調(diào)控靶基因的表達。不同點不同點:現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六十四頁，共75頁（四）、（四）、RNARNA干擾的研究方法干擾的研究方法 一般技術(shù)路線一般技術(shù)路線現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六十五頁，共75頁（五）、（五）、RNARNA干擾的應(yīng)用干擾的應(yīng)用 1.基因功能研究基因功能研究由于由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異具有高度的序列專一性和有效的干擾活

58、力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強有力的研究工具。能基因組學(xué)的一種強有力的研究工具。已有研究表明已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，制作多能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生種表型，而且抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)類似基因敲除的效應(yīng)。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來

59、單等優(yōu)勢，近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型的報道日益增多，標志著多，標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。將成為研究基因功能不可或缺的工具。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六十六頁，共75頁2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療 使用使用RNAi技術(shù)來阻止艾滋病病毒進入人體細胞。某研技術(shù)來阻止艾滋病病毒進入人體細胞。某研究小組設(shè)計合成的究小組設(shè)計合成的lenti病毒載體引入病毒載體引入siRNA，激發(fā)，激發(fā)RNAi使其抑制了使其抑制了HIV-1的的coreceptor-CCR5（化介素受體，（化介素受體， HIV-1的輔因子的輔因子）進入人體外周淋巴細胞，而

60、不影響）進入人體外周淋巴細胞，而不影響另一種另一種HIV-1主要的主要的coreceptor-CCR4，從而使以，從而使以lenti病毒病毒載體為媒介引導(dǎo)載體為媒介引導(dǎo)siRNA進入細胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此進入細胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此治療治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。艾滋病艾滋病現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六十七頁，共75頁2.病毒性疾病的治療病毒性疾病的治療 Shlomai和和Shaul設(shè)計了各針對設(shè)計了各針對HBV基因基因19nt的兩種的兩種pSUPER載體：載體：pSUPER X-siRNA和和pSUPER core-siRNA。已轉(zhuǎn)染含