第四章蛋白質(zhì)考研必備生物化學(xué)筆記1

1、 第四章 蛋白質(zhì) 提要 一. 概念簡(jiǎn)單蛋白、結(jié)合蛋白、基本氨基酸、等電點(diǎn)、甲醛滴定法、Edman降解、一級(jí)結(jié)構(gòu)、肽鍵、構(gòu)型與構(gòu)象、二面角、二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)、亞基、別構(gòu)蛋白、分子病、水化層、雙電層、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性、鹽析與鹽溶二.氨基酸分類(lèi)、基本氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類(lèi)、名稱、符號(hào)、化學(xué)反應(yīng)、鑒定、蛋白質(zhì)的水解三.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、測(cè)定步驟、常用方法、酶二級(jí)結(jié)構(gòu) 四種 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、數(shù)據(jù)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu) 主要靠疏水鍵維持四級(jí)結(jié)構(gòu) 變構(gòu)現(xiàn)象結(jié)構(gòu)與功能的適應(yīng)、結(jié)構(gòu)變化對(duì)功能的影響、典型蛋白質(zhì)四.蛋白質(zhì)的性質(zhì)分子量的測(cè)定方法、酸堿性、溶解性、變性、顏色反應(yīng)第一

2、節(jié) 蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)的功能多樣性蛋白質(zhì)是原生質(zhì)的主要成分，任何生物都含有蛋白質(zhì)。自然界中最小、最簡(jiǎn)單的生物是病毒，它是由蛋白質(zhì)和核酸組成的。沒(méi)有蛋白質(zhì)也就沒(méi)有生命。自然界的生物多種多樣，因而蛋白質(zhì)的種類(lèi)和功能也十分繁多。概括起來(lái)，蛋白質(zhì)主要有以下功能：1.催化功能 生物體內(nèi)的酶都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，它們有機(jī)體新陳代謝的催化劑。沒(méi)有酶，生物體內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)就無(wú)法正常進(jìn)行。例如，沒(méi)有淀粉酶，淀粉就不能被分解利用。2.結(jié)構(gòu)功能 蛋白質(zhì)可以作為生物體的結(jié)構(gòu)成分。在高等動(dòng)物里，膠原是主要的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)蛋白，參與結(jié)締組織和骨骼作為身體的支架，占蛋白總量的1/4。細(xì)胞里的片層結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體

3、和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等都是由不溶性蛋白與脂類(lèi)組成的。動(dòng)物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構(gòu)成的。3.運(yùn)輸功能 脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞中的血紅蛋白和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的血藍(lán)蛋白在呼吸過(guò)程中起著運(yùn)輸氧氣的作用。血液中的載脂蛋白可運(yùn)輸脂肪，轉(zhuǎn)鐵蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)鐵。一些脂溶性激素的運(yùn)輸也需要蛋白，如甲狀腺素要與甲狀腺素結(jié)合球蛋白結(jié)合才能在血液中運(yùn)輸。4.貯存功能 某些蛋白質(zhì)的作用是貯存氨基酸作為生物體的養(yǎng)料和胚胎或幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的原料。此類(lèi)蛋白質(zhì)包括蛋類(lèi)中的卵清蛋白、奶類(lèi)中的酪蛋白和小麥種子中的麥醇溶蛋白等。肝臟中的鐵蛋白可將血液中多余的鐵儲(chǔ)存起來(lái)，供缺鐵時(shí)使用。5.運(yùn)動(dòng)功能 肌肉中的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的必要成分，它們構(gòu)象的改變引

4、起肌肉的收縮，帶動(dòng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)。細(xì)菌中的鞭毛蛋白有類(lèi)似的作用，它的收縮引起鞭毛的擺動(dòng)，從而使細(xì)菌在水中游動(dòng)。6.防御功能 高等動(dòng)物的免疫反應(yīng)是機(jī)體的一種防御機(jī)能，它主要也是通過(guò)蛋白質(zhì)（抗體）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。凝血與纖溶系統(tǒng)的蛋白因子、溶菌酶、干擾素等，也擔(dān)負(fù)著防御和保護(hù)功能。7.調(diào)節(jié)功能 某些激素、一切激素受體和許多其他調(diào)節(jié)因子都是蛋白質(zhì)。8.信息傳遞功能 生物體內(nèi)的信息傳遞過(guò)程也離不開(kāi)蛋白質(zhì)。例如，視覺(jué)信息的傳遞要有視紫紅質(zhì)參與，感受味道需要味覺(jué)蛋白。視桿細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)，只需1個(gè)光子即可被激發(fā)，產(chǎn)生視覺(jué)。9.遺傳調(diào)控功能 遺傳信息的儲(chǔ)存和表達(dá)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。DNA在儲(chǔ)存時(shí)是纏繞在蛋白質(zhì)（組蛋白）上的。

5、有些蛋白質(zhì)，如阻遏蛋白，與特定基因的表達(dá)有關(guān)。半乳糖苷酶基因的表達(dá)受到一種阻遏蛋白的抑制，當(dāng)需要合成半乳糖苷酶時(shí)經(jīng)過(guò)去阻遏作用才能表達(dá)。10.其他功能 某些生物能合成有毒的蛋白質(zhì)，用以攻擊或自衛(wèi)。如某些植物在被昆蟲(chóng)咬過(guò)以后會(huì)產(chǎn)生一種毒蛋白。白喉毒素可抑制生物蛋白質(zhì)合成。二、蛋白質(zhì)的分類(lèi)（一）按分子形狀分類(lèi)1.球狀蛋白 外形近似球體，多溶于水，大都具有活性，如酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白激素、抗體等。球狀蛋白的長(zhǎng)度與直徑之比一般小于10。2.纖維狀蛋白 外形細(xì)長(zhǎng)，分子量大，大都是結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白，彈性蛋白，角蛋白等。纖維蛋白按溶解性可分為可溶性纖維蛋白與不溶性纖維蛋白。前者如血液中的纖維蛋白原、肌肉中

6、的肌球蛋白等，后者如膠原蛋白，彈性蛋白，角蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白。（二）按分子組成分類(lèi)1.簡(jiǎn)單蛋白 完全由氨基酸組成，不含非蛋白成分。如血清清蛋白等。根據(jù)溶解性的不同，可將簡(jiǎn)單蛋白分為以下7類(lèi)：清蛋白、球蛋白、組蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白。2.結(jié)合蛋白 由蛋白質(zhì)和非蛋白成分組成，后者稱為輔基。根據(jù)輔基的不同，可將結(jié)合蛋白分為以下7類(lèi)：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血紅素蛋白、黃素蛋白和金屬蛋白。三、蛋白質(zhì)的元素組成與分子量1.元素組成 所有的蛋白質(zhì)都含有碳?xì)溲醯姆N元素，有些蛋白質(zhì)還含有硫、磷和一些金屬元素。蛋白質(zhì)平均含碳50，氫7，氧23，氮16。其中氮的含量較為恒定，而且在糖和脂類(lèi)中

7、不含氮，所以常通過(guò)測(cè)量樣品中氮的含量來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。如常用的凱氏定氮：蛋白質(zhì)含量蛋白氮×6.25其中6.25是16的倒數(shù)。2.蛋白質(zhì)的分子量 蛋白質(zhì)的分子量變化范圍很大，從6000到100萬(wàn)或更大。這個(gè)范圍是人為規(guī)定的。一般將分子量小于6000的稱為肽。不過(guò)這個(gè)界限不是絕對(duì)的，如牛胰島素分子量為5700，一般仍認(rèn)為是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)煮沸凝固，而肽不凝固。較大的蛋白質(zhì)如煙草花葉病毒，分子量達(dá)4000萬(wàn)。四、蛋白質(zhì)的水解氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，這個(gè)發(fā)現(xiàn)是從蛋白質(zhì)的水解得到的。蛋白質(zhì)的水解主要有三種方法：1.酸水解 用6MHCl或4MH2SO4，105回流20小時(shí)即可完全水解。酸水解

8、不引起氨基酸的消旋，但色氨酸完全被破壞，絲氨酸和蘇氨酸部分破壞，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。如樣品含有雜質(zhì)，在酸水解過(guò)程中常產(chǎn)生腐黑質(zhì)，使水解液變黑。用3mol/L對(duì)甲苯磺酸代替鹽酸，得到色氨酸較多，可像絲氨酸和蘇氨酸一樣用外推法求其含量。2.堿水解 用5MNaOH，水解1020小時(shí)可水解完全。堿水解使氨基酸消旋，許多氨基酸被破壞，但色氨酸不被破壞。常用于測(cè)定色氨酸含量?？杉尤氲矸垡苑乐寡趸?.酶水解 酶水解既不破壞氨基酸，也不引起消旋。但酶水解時(shí)間長(zhǎng)，反應(yīng)不完全。一般用于部分水解，若要完全水解，需要用多種酶協(xié)同作用。第二節(jié) 氨基酸 一、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類(lèi)（一）基本氨基酸組成蛋白質(zhì)的2

9、0種氨基酸稱為基本氨基酸。它們中除脯氨酸外都是-氨基酸，即在-碳原子上有一個(gè)氨基?；景被岫挤贤ㄊ?，都有單字母和三字母縮寫(xiě)符號(hào)。按照氨基酸的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，可分為三類(lèi)：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和雜環(huán)氨基酸。1.脂肪族氨基酸 共15種。側(cè)鏈只是烴鏈：Gly, Ala, Val, Leu, Ile后三種帶有支鏈，人體不能合成，是必需氨基酸。側(cè)鏈含有羥基：Ser, Thr許多蛋白酶的活性中心含有絲氨酸，它還在蛋白質(zhì)與糖類(lèi)及磷酸的結(jié)合中起重要作用。側(cè)鏈含硫原子：Cys, Met兩個(gè)半胱氨酸可通過(guò)形成二硫鍵結(jié)合成一個(gè)胱氨酸。二硫鍵對(duì)維持蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)有重要意義。半胱氨酸也經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活性中心里。

10、甲硫氨酸的硫原子有時(shí)參與形成配位鍵。甲硫氨酸可作為通用甲基供體，參與多種分子的甲基化反應(yīng)。側(cè)鏈含有羧基：Asp（D）, Glu（E）側(cè)鏈含酰胺基：Asn（N）, Gln（Q）側(cè)鏈顯堿性：Arg（R）, Lys（K）2.芳香族氨基酸 包括苯丙氨酸（Phe,F）和酪氨酸(Tyr,Y)兩種。 酪氨酸是合成甲狀腺素的原料。3.雜環(huán)氨基酸 包括色氨酸(Trp,W)、組氨酸(His)和脯氨酸(Pro)三種。其中的色氨酸與芳香族氨基酸都含苯環(huán)，都有紫外吸收(280nm)。所以可通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)的紫外吸收來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。組氨酸也是堿性氨基酸，但堿性較弱，在生理?xiàng)l件下是否帶電與周?chē)鷥?nèi)環(huán)境有關(guān)。它在活性中心常起

11、傳遞電荷的作用。組氨酸能與鐵等金屬離子配位。脯氨酸是唯一的仲氨基酸，是-螺旋的破壞者。B是指Asx，即Asp或Asn；Z是指Glx，即Glu或Gln?；景被嵋部砂磦?cè)鏈極性分類(lèi)：非極性氨基酸：Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro共八種極性不帶電荷：Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr共七種帶正電荷：Arg, Lys, His帶負(fù)電荷：Asp, Glu（二）不常見(jiàn)的蛋白質(zhì)氨基酸某些蛋白質(zhì)中含有一些不常見(jiàn)的氨基酸，它們是基本氨基酸在蛋白質(zhì)合成以后經(jīng)羥化、羧化、甲基化等修飾衍生而來(lái)的。也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。如4-羥脯氨酸、

12、5-羥賴氨酸、鎖鏈素等。其中羥脯氨酸和羥賴氨酸在膠原和彈性蛋白中含量較多。在甲狀腺素中還有3,5-二碘酪氨酸。（三）非蛋白質(zhì)氨基酸自然界中還有150多種不參與構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸。它們大多是基本氨基酸的衍生物，也有一些是D-氨基酸或、-氨基酸。這些氨基酸中有些是重要的代謝物前體或中間產(chǎn)物，如瓜氨酸和鳥(niǎo)氨酸是合成精氨酸的中間產(chǎn)物，-丙氨酸是遍多酸（泛酸，輔酶A前體）的前體，-氨基丁酸是傳遞神經(jīng)沖動(dòng)的化學(xué)介質(zhì)。二、氨基酸的性質(zhì)（一）物理性質(zhì)-氨基酸都是白色晶體，每種氨基酸都有特殊的結(jié)晶形狀，可以用來(lái)鑒別各種氨基酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸和羥脯氨酸還能溶于乙醇或乙醚中。除甘氨酸外，-

13、氨基酸都有旋光性，-碳原子具有手性。蘇氨酸和異亮氨酸有兩個(gè)手性碳原子。從蛋白質(zhì)水解得到的氨基酸都是L-型。但在生物體內(nèi)特別是細(xì)菌中，D-氨基酸也存在，如細(xì)菌的細(xì)胞壁和某些抗菌素中都含有D-氨基酸。三個(gè)帶苯環(huán)的氨基酸有紫外吸收，F(xiàn):257nm,=200; Y:275nm,=1400; W:280nm,=5600。通常蛋白質(zhì)的紫外吸收主要是后兩個(gè)氨基酸決定的，一般在280nm。氨基酸分子中既含有氨基又含有羧基，在水溶液中以偶極離子的形式存在。所以氨基酸晶體是離子晶體，熔點(diǎn)在200以上。氨基酸是兩性電解質(zhì)，各個(gè)解離基的表觀解離常數(shù)按其酸性強(qiáng)度遞降的順序，分別以K1、K2來(lái)表示。當(dāng)氨基酸分子所帶的凈電

14、荷為零時(shí)的pH稱為氨基酸的等電點(diǎn)(pI)。等電點(diǎn)的值是它在等電點(diǎn)前后的兩個(gè)pK值的算術(shù)平均值。氨基酸完全質(zhì)子化時(shí)可看作多元弱酸，各解離基團(tuán)的表觀解離常數(shù)按酸性減弱的順序，以pK1 、pK2 、pK3表示。氨基酸可作為緩沖溶液，在pK處的緩沖能力最強(qiáng)，pI處的緩沖能力最弱。氨基酸的滴定曲線如圖。（二）化學(xué)性質(zhì)1.氨基的反應(yīng)（1）?；被膳c酰化試劑，如酰氯或酸酐在堿性溶液中反應(yīng)，生成酰胺。該反應(yīng)在多肽合成中可用于保護(hù)氨基。（2）與亞硝酸作用氨基酸在室溫下與亞硝酸反應(yīng)，脫氨，生成羥基羧酸和氮?dú)狻Ｒ驗(yàn)椴范加羞@個(gè)反應(yīng)，所以賴氨酸的側(cè)鏈氨基也能反應(yīng)，但速度較慢。常用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾、水解程度測(cè)定及氨

15、基酸的定量。（3）與醛反應(yīng)氨基酸的-氨基能與醛類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)，生成西佛堿-C=N-。西佛堿是氨基酸作為底物的某些酶促反應(yīng)的中間物。賴氨酸的側(cè)鏈氨基也能反應(yīng)。氨基還可以與甲醛反應(yīng)，生成羥甲基化合物。由于氨基酸在溶液中以偶極離子形式存在，所以不能用酸堿滴定測(cè)定含量。與甲醛反應(yīng)后，氨基酸不再是偶極離子，其滴定終點(diǎn)可用一般的酸堿指示劑指示，因而可以滴定，這叫甲醛滴定法，可用于測(cè)定氨基酸。（4）與異硫氰酸苯酯(PITC)反應(yīng)-氨基與PITC在弱堿性條件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-AA），后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-AA）。這些衍生物是無(wú)色的，可用層析法

16、加以分離鑒定。這個(gè)反應(yīng)首先為Edman用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸，在蛋白質(zhì)的氨基酸順序分析方面占有重要地位。（5）磺?；被崤c5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反應(yīng)，生成DNS-氨基酸。產(chǎn)物在酸性條件下(6NHCl)100也不破壞，因此可用于氨基酸末端分析。DNS-氨基酸有強(qiáng)熒光，激發(fā)波長(zhǎng)在360nm左右，比較靈敏，可用于微量分析。（6）與DNFB反應(yīng)氨基酸與2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNP氨基酸）。這一反應(yīng)是定量轉(zhuǎn)變的，產(chǎn)物黃色，可經(jīng)受酸性100高溫。該反應(yīng)曾被英國(guó)的Sanger用來(lái)測(cè)定胰島素的氨基酸順序，也叫桑格爾試劑，現(xiàn)在應(yīng)用

17、于蛋白質(zhì)N-末端測(cè)定。（7）轉(zhuǎn)氨反應(yīng)在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸可脫去氨基，變成相應(yīng)的酮酸。2.羧基的反應(yīng)羧基可與堿作用生成鹽，其中重金屬鹽不溶于水。羧基可與醇生成酯，此反應(yīng)常用于多肽合成中的羧基保護(hù)。某些酯有活化作用，可增加羧基活性，如對(duì)硝基苯酯。將氨基保護(hù)以后，可與二氯亞砜或五氯化磷作用生成酰氯，在多肽合成中用于活化羧基。在脫羧酶的催化下，可脫去羧基，形成伯胺。3茚三酮反應(yīng)氨基酸與茚三酮在微酸性溶液中加熱，最后生成藍(lán)色物質(zhì)。而脯氨酸生成黃色化合物。根據(jù)這個(gè)反應(yīng)可通過(guò)二氧化碳測(cè)定氨基酸含量。4.側(cè)鏈的反應(yīng)絲氨酸、蘇氨酸含羥基，能形成酯或苷。半胱氨酸側(cè)鏈巰基反應(yīng)性高：（1）二硫鍵(disulfid

18、e bond)半胱氨酸在堿性溶液中容易被氧化形成二硫鍵，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫鍵在形成蛋白質(zhì)的構(gòu)象上起很大的作用。氧化劑和還原劑都可以打開(kāi)二硫鍵。在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)，氧化劑過(guò)甲酸可以定量地拆開(kāi)二硫鍵，生成相應(yīng)的磺酸。還原劑如巰基乙醇、巰基乙酸也能拆開(kāi)二硫鍵，生成相應(yīng)的巰基化合物。由于半胱氨酸中的巰基很不穩(wěn)定，極易氧化，因此利用還原劑拆開(kāi)二硫鍵時(shí)，往往進(jìn)一步用碘乙酰胺、氯化芐、N-乙基丁烯二亞酰胺和對(duì)氯汞苯甲酸等試劑與巰基作用，把它保護(hù)起來(lái)，防止它重新氧化。（2）烷化半胱氨酸可與烷基試劑，如碘乙酸、碘乙酰胺等發(fā)生烷化反應(yīng)。半胱氨酸與丫丙啶反應(yīng)，生成帶正電的側(cè)鏈，稱為S-氨乙基半胱氨酸（AEC

19、ys）。（3）與重金屬反應(yīng)極微量的某些重金屬離子，如Ag+、Hg2+，就能與巰基反應(yīng)，生成硫醇鹽，導(dǎo)致含巰基的酶失活。5. 以下反應(yīng)常用于氨基酸的檢驗(yàn)：l 酪氨酸、組氨酸能與重氮化合物反應(yīng)(Pauly反應(yīng))，可用于定性、定量測(cè)定。組氨酸生成棕紅色的化合物，酪氨酸為桔黃色。l 精氨酸在氫氧化鈉中與1-萘酚和次溴酸鈉反應(yīng)，生成深紅色，稱為坂口反應(yīng)。用于胍基的鑒定。l 酪氨酸與硝酸、亞硝酸、硝酸汞和亞硝酸汞反應(yīng)，生成白色沉淀，加熱后變紅，稱為米倫反應(yīng)，是鑒定酚基的特性反應(yīng)。l 色氨酸中加入乙醛酸后再緩慢加入濃硫酸，在界面會(huì)出現(xiàn)紫色環(huán)，用于鑒定吲哚基。在蛋白質(zhì)中，有些側(cè)鏈基團(tuán)被包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部，因而反

20、應(yīng)很慢甚至不反應(yīng)。三、色譜與氨基酸的分析分離1.色譜（chromatography）的發(fā)展史最早的層析實(shí)驗(yàn)是俄國(guó)植物學(xué)家在1903年用碳酸鈣分離葉綠素，屬于吸附層析。40年代出現(xiàn)了分配層析，50年代出現(xiàn)了氣相色譜，60年代出現(xiàn)HPLC，80年代出現(xiàn)了超臨界層析，90年代出現(xiàn)的超微量HPLC可分離ng級(jí)的樣品。2.色譜的分類(lèi)：按流動(dòng)相可分為氣相、液相、超臨界色譜等；按介質(zhì)可分為紙層析、薄層層析、柱層析等；按分離機(jī)制可分為吸附層析、分配層析、分子篩層析等3.色譜的應(yīng)用可用于分離、制備、純度鑒定等。定性可通過(guò)保留值、內(nèi)標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)曲線等方法，定量一般用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。氨基酸的分析分離是測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。

21、在分配層析和離子交換層析法開(kāi)始應(yīng)用于氨基酸成分分析之后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究才取得了顯著的成就?，F(xiàn)在這些方法已自動(dòng)化。氨基酸從強(qiáng)酸型離子交換柱的洗脫順序如下：Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,(NH3),Arg 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是生物大分子，具有明顯的結(jié)構(gòu)層次性，由低層到高層可分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。一、肽鍵和肽一個(gè)氨基酸的羧基與另一個(gè)氨基酸的氨基縮水形成的共價(jià)鍵，稱為肽鍵。在蛋白質(zhì)分子中，氨基酸借肽鍵連接起來(lái)，形成肽鏈。最簡(jiǎn)單的肽由兩個(gè)氨基酸組成，稱為二肽。含有三、四、

22、五個(gè)氨基酸的肽分別稱為三肽、四肽、五肽等。肽鏈中的氨基酸由于形成肽鍵時(shí)脫水，已不是完整的氨基酸，所以稱為殘基。肽的命名是根據(jù)組成肽的氨基酸殘基來(lái)確定的。一般從肽的氨基端開(kāi)始，稱為某氨基酰某氨基酰某氨基酸。肽的書(shū)寫(xiě)也是從氨基端開(kāi)始。肽鍵象酰胺鍵一樣，由于鍵內(nèi)原子處于共振狀態(tài)而表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。在肽鍵中CN單鍵具有約40雙鍵性質(zhì)，而C=O雙鍵具有40單鍵性質(zhì)。這樣就產(chǎn)生兩個(gè)重要結(jié)果：（1）肽鍵的亞氨基在pH 0-14的范圍內(nèi)沒(méi)有明顯的解離和質(zhì)子化的傾向；（2）肽鍵中的CN單鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，使蛋白質(zhì)能折疊成各種三維構(gòu)象。除了蛋白質(zhì)部分水解可以產(chǎn)生各種簡(jiǎn)單的多肽以外，自然界中還有長(zhǎng)短不等的小肽，它們

23、具有特殊的生理功能。動(dòng)植物細(xì)胞中含有一種三肽，稱為谷胱甘肽，即-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。因其含有巰基，故常以GSH來(lái)表示。它在體內(nèi)的氧化還原過(guò)程中起重要作用。腦啡肽是天然止痛劑。肌肉中的鵝肌肽是一個(gè)二肽，即-丙氨酰組氨酸。肌肽可作為肌肉中的緩沖劑，緩沖肌肉產(chǎn)生的乳酸對(duì)pH的影響。一種抗菌素叫做短桿菌酪肽，由12種氨基酸組成，其中有幾種是D-氨基酸。這些天然肽中的非蛋白質(zhì)氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。許多激素也是多肽，如催產(chǎn)素、加壓素、舒緩激肽等。二、肽的理化性質(zhì)小肽的理化性質(zhì)與氨基酸類(lèi)似。許多小肽已經(jīng)結(jié)晶。晶體的熔點(diǎn)很高，說(shuō)明是離子晶體，在水溶液中以偶極離子存在。肽鍵的亞氨基不解離，所以肽的酸堿

24、性取決于肽的末端氨基、羧基和側(cè)鏈上的基團(tuán)。在長(zhǎng)肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈上的。肽中末端羧基的pK比自由氨基酸的稍大，而末端氨基的pK則稍小。側(cè)鏈基團(tuán)變化不大。肽的滴定曲線和氨基酸的很相似。肽的等電點(diǎn)也可以根據(jù)它的pK值確定。一般小肽的旋光度等于各個(gè)氨基酸旋光度的總和，但較大的肽或蛋白質(zhì)的旋光度不等于其組成氨基酸的旋光度的簡(jiǎn)單加和。肽的化學(xué)性質(zhì)和氨基酸一樣，但有一些特殊的反應(yīng)，如雙縮脲反應(yīng)。一般含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物都能與CuSO4堿性溶液發(fā)生雙縮脲反應(yīng)而生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物。利用這個(gè)反應(yīng)可以測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。三、一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指肽鏈的氨基

25、酸組成及其排列順序。氨基酸序列是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，它決定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。一級(jí)結(jié)構(gòu)可用氨基酸的三字母符號(hào)或單字母符號(hào)表示，從N-末端向C-末端書(shū)寫(xiě)。采用三字母符號(hào)時(shí)，氨基酸之間用連字符（）隔開(kāi)。（二）測(cè)定步驟測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，要求樣品必須是均一的（純度大于97）而且是已知分子量的蛋白質(zhì)。一般的測(cè)定步驟是：1.通過(guò)末端分析確定蛋白質(zhì)分子由幾條肽鏈構(gòu)成。2.將每條肽鏈分開(kāi)，并分離提純。3.肽鏈的一部分樣品進(jìn)行完全水解，測(cè)定其氨基酸組成和比例。4.肽鏈的另一部分樣品進(jìn)行N末端和C末端的鑒定。5.拆開(kāi)肽鏈內(nèi)部的二硫鍵。6. 肽鏈用酶促或化學(xué)的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段，并將各個(gè)肽段分

26、離出來(lái)。7.測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序。8.從第二步得到的肽鏈樣品再用另一種部分水解方法水解成另一套肽段，其斷裂點(diǎn)與第五步不同。分離肽段并測(cè)序。比較兩套肽段的氨基酸順序，根據(jù)其重疊部分拼湊出整個(gè)肽鏈的氨基酸順序。9. 測(cè)定原來(lái)的多肽鏈中二硫鍵和酰胺基的位置。（三）常用方法1. 末端分析（1）N末端蛋白質(zhì)的末端氨基與2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白質(zhì)（DNP-蛋白質(zhì)）。產(chǎn)物黃色，可經(jīng)受酸性100高溫。水解時(shí)，肽鏈斷開(kāi)，但DNP基并不脫落。DNP-氨基酸能溶于有機(jī)溶劑（如乙醚）中，這樣可與其他氨基酸和-DNP賴氨酸分開(kāi)。再經(jīng)雙向?yàn)V紙層析或柱層析，可以鑒定黃色的DNP

27、氨基酸。丹磺酰氯法是更靈敏的方法。蛋白質(zhì)的末端氨基與5-(二甲胺基)萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反應(yīng)，生成DNS-蛋白質(zhì)。DNS-氨基酸有強(qiáng)熒光，激發(fā)波長(zhǎng)在360nm左右，比DNFB法靈敏100倍。目前應(yīng)用最廣泛的是異硫氰酸苯酯(PITC)法。末端氨基與PITC在弱堿性條件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物而從肽鏈上掉下來(lái)。產(chǎn)物可用氣-液色譜法進(jìn)行鑒定。這個(gè)方法最大的優(yōu)點(diǎn)是剩下的肽鏈仍是完整的，可依照此法重復(fù)測(cè)定新生的N末端氨基酸?，F(xiàn)在已經(jīng)有全自動(dòng)的氨基酸順序分析儀，可測(cè)定含20個(gè)以上氨基酸的肽段的氨基酸順序。缺點(diǎn)是不如丹磺酰氯靈敏

28、，可與之結(jié)合使用。N末端氨基酸也可用酶學(xué)方法即氨肽酶法測(cè)定。（2）C末端a) C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應(yīng)的氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。有斷裂干擾。b)另一個(gè)方法是肼解法。多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼解下來(lái)的C末端氨基酸可用紙層析鑒定。精氨酸會(huì)變成鳥(niǎo)氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。c) 也可用羧肽酶法鑒定。將蛋白質(zhì)在pH 8.0, 30與羧肽酶一起保溫，按一定時(shí)間間隔取樣，用紙層析測(cè)定釋放出來(lái)的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時(shí)間的關(guān)系，就可以知道C末端氨基酸的排列順序。羧肽酶A水解除精氨酸、賴氨酸和脯

29、氨酸外所有肽鍵，羧肽酶B水解精氨酸和賴氨酸。2.二硫鍵的拆開(kāi)和肽鏈的分離一般情況下，蛋白質(zhì)分子中肽鏈的數(shù)目應(yīng)等于N末端氨基酸殘基的數(shù)目，可根據(jù)末端分析來(lái)確定一種蛋白質(zhì)由幾條肽鏈構(gòu)成。必須設(shè)法把這些肽鏈分離開(kāi)來(lái)，然后測(cè)定每條肽鏈的氨基酸順序。如果這些肽鏈之間不是共價(jià)交聯(lián)的，可用酸、堿、高濃度的鹽或其他變性劑處理蛋白質(zhì)，把肽鏈分開(kāi)。如果肽鏈之間以二硫鍵交聯(lián)，或肽鏈中含有鏈內(nèi)二硫鍵，則必須用氧化或還原的方法將二硫鍵拆開(kāi)。最普遍的方法是用過(guò)量的巰基乙醇處理，然后用碘乙酸保護(hù)生成的半胱氨酸的巰基，防止重新氧化。二硫鍵拆開(kāi)后形成的個(gè)別肽鏈，可用紙層析、離子交換柱層析、電泳等方法進(jìn)行分離。3.肽鏈的完全水解

30、和氨基酸組成的測(cè)定。在測(cè)定氨基酸順序之前，需要知道多肽鏈的氨基酸組成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測(cè)定氨基酸。目前用氨基酸自動(dòng)分析儀，24小時(shí)即可完成。蛋白質(zhì)的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質(zhì)中所含的氨基酸分子數(shù)表示。不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成相差很大。4.肽鏈的部分水解和肽段的分離當(dāng)肽鏈的氨基酸組成及N末端和C末端已知后，隨后的步驟是肽鏈的部分水解。這是測(cè)序工作的關(guān)鍵步驟。這一步通常用專(zhuān)一性很強(qiáng)的蛋白酶來(lái)完成。最常用的是胰蛋白酶（trypsin），它專(zhuān)門(mén)水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵，所以生成的肽段之一的C末端是賴氨酸或精氨酸。用丫丙啶處理，可增加酶切位點(diǎn)（半胱氨酸）；

31、用馬來(lái)酸酐（順丁烯二酸酐）保護(hù)賴氨酸的側(cè)鏈氨基，或用1,2-環(huán)己二酮修飾精氨酸的胍基，可減少酶切位點(diǎn)。經(jīng)常使用的還有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水殘基的羧基形成的肽鍵。其他疏水殘基反應(yīng)較慢。用溴化氰處理，可斷裂甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵。水解后甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)镃末端高絲氨酸殘基。以上三種方法經(jīng)常使用。胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。前者水解疏水殘基之間的肽鍵，后者水解疏水殘基的氨基形成的肽鍵。金葡菌蛋白酶，又稱谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽鍵，但受緩沖液影響。在醋酸緩沖液中只水解谷氨酸，在磷酸緩沖液中還可水解天冬氨酸。梭狀芽孢桿菌蛋白酶，水解精氨酸羧基形成的

32、肽鍵，又稱精氨酸蛋白酶。耐變性劑，可經(jīng)受6M尿素2小時(shí)?？捎糜谒獠灰兹芙獾牡鞍?。凝血酶，水解Arg-Gly肽鍵。羥胺可水解Asn-Gly，但Asn-Leu和 Asn-Ala也能部分裂解。以上方法中，酶不能水解脯氨酸參與形成的肽鍵。多肽部分水解后，降解成長(zhǎng)短不一的小肽段，可用層析或電泳加以分離提純。經(jīng)常用雙向?qū)游龌螂娪痉蛛x，再用茚三酮顯色，所得的圖譜稱為肽指紋譜。5.多肽鏈中氨基酸順序的測(cè)定從多肽鏈中部分水解得到的肽段可用化學(xué)法或酶法測(cè)序，然后比較用不同方法獲得的兩套肽段的氨基酸順序，根據(jù)它們彼此重疊的部分，確定每個(gè)肽段的適當(dāng)位置，拼湊出整個(gè)多肽鏈的氨基酸順序。6.二硫鍵位置的確定一般用蛋白酶

33、水解帶有二硫鍵的蛋白質(zhì)，從部分水解產(chǎn)物中分離出含二硫鍵的肽段，再拆開(kāi)二硫鍵，將兩個(gè)肽段分別測(cè)序，再與整個(gè)多肽鏈比較，即可確定二硫鍵的位置。常用胃蛋白酶，因其專(zhuān)一性低，生成的肽段小，容易分離和鑒定，而且可在酸性條件下作用（pH2），此時(shí)二硫鍵穩(wěn)定。肽段的分離可用對(duì)角線電泳，將混合物點(diǎn)到濾紙的中央，在pH6.5進(jìn)行第一次電泳，然后用過(guò)甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變成一對(duì)含半胱氨磺酸的肽段。將濾紙旋轉(zhuǎn)90度后在相同條件下進(jìn)行第二次電泳，多數(shù)肽段遷移率不變，處于對(duì)角線上，而含半胱氨磺酸的肽段因負(fù)電荷增加而偏離對(duì)角線。用茚三酮顯色，分離，測(cè)序，與多肽鏈比較，即可確定二硫鍵位置。四、多肽合成多肽的

34、人工合成有兩種類(lèi)型，一種是由不同氨基酸按照一定順序排列的控制合成，另一種是由一種或兩種氨基酸聚合或共聚合?？刂坪铣傻囊粋€(gè)困難是進(jìn)行接肽反應(yīng)所需的試劑，能同時(shí)和其他官能團(tuán)反應(yīng)。因此在接肽以前必須首先將這些基團(tuán)加以封閉或保護(hù)，肽鍵形成后再除去保護(hù)基。這樣每連接一個(gè)氨基酸殘基都要經(jīng)過(guò)幾個(gè)步驟，要得到較長(zhǎng)的肽鏈就必須每步都有較高的產(chǎn)率。如果每一步反應(yīng)產(chǎn)率都是90%，那么30次反應(yīng)后總產(chǎn)率只有4.24%。保護(hù)基必須在接肽時(shí)起保護(hù)作用，在接肽后容易除去，又不引起肽鍵斷裂。最常用的氨基保護(hù)基Y是芐氧甲?；?，可用催化加氫或用金屬鈉在液氨中處理除去。其他還有三苯甲基、叔丁氧甲?；龋捎孟←}酸或乙酸在室溫下除去

35、。羧基保護(hù)基Z通常用烷基，如乙基，可在室溫下皂化除去。如用芐基，可用催化加氫除去。肽鍵不能自發(fā)形成，常用縮合劑促進(jìn)肽鍵形成。接肽用的縮合劑最有效的是N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DC CI)。DCCI從兩個(gè)氨基酸分子中奪取一分子水，自身變?yōu)椴蝗艿腘,N-二環(huán)己基脲，從反應(yīng)液中沉淀出來(lái)，可過(guò)濾除去。接肽反應(yīng)除用縮合劑以外，還可用分別活化參加形成肽鍵的羧基和氨基的方法。羧基活化可用疊氮化物法和活化酯法（對(duì)硝基苯酯）等；氨基活化一般不需特殊手段，通常在接肽時(shí)加入有機(jī)堿，如三乙胺，保證氨基在自由狀態(tài)即可。近年來(lái)固相多肽合成迅速發(fā)展。在固相合成中，肽鏈的逐步延長(zhǎng)是在不溶的聚苯乙烯樹(shù)脂小圓珠上進(jìn)行的。合成多肽

36、的羧基端先和氯甲基聚苯乙烯樹(shù)脂反應(yīng)，形成芐酯。第二個(gè)氨基酸的氨基用叔丁氧甲酰基保護(hù)后，以DCCI為縮合劑，接在第一個(gè)氨基酸的氨基上。重復(fù)這個(gè)方法，可使肽鏈按一定順序延長(zhǎng)。最后把樹(shù)脂懸浮在無(wú)水三氟乙酸中，通入干燥HBr，使多肽與樹(shù)脂分離，同時(shí)除去保護(hù)基。整個(gè)合成過(guò)程現(xiàn)在已經(jīng)可以在自動(dòng)化固相多肽合成儀上進(jìn)行。平均合成每個(gè)肽鍵只需三小時(shí)。此法可用于醫(yī)藥工業(yè)。人工合成的催產(chǎn)素沒(méi)有混雜的加壓素，比提取的天然藥品好。已經(jīng)成功合成含124個(gè)殘基的蛋白。第四節(jié) 蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的多肽鏈并不是線形伸展的，而是按一定方式折疊盤(pán)繞成特有的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象，也稱空間結(jié)構(gòu)或高級(jí)結(jié)構(gòu)，是指蛋白質(zhì)分子中原子

37、和基團(tuán)在三維空間上的排列、分布及肽鏈的走向。高級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物功能或活性所必須的，包括二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。Primary structure, secondary, tertiary, quaternary structure一、有關(guān)概念1. 構(gòu)型configration與構(gòu)象conformation構(gòu)型指立體異構(gòu)體中取代原子或基團(tuán)在空間的取向，構(gòu)型的改變必須通過(guò)共價(jià)鍵的斷裂。構(gòu)象是指這些取代基團(tuán)當(dāng)單鍵旋轉(zhuǎn)時(shí)可能形成的不同的立體結(jié)構(gòu)，構(gòu)象的改變不涉及共價(jià)鍵的改變。2. 二面角因?yàn)殡逆I不能自由旋轉(zhuǎn)，所以肽鍵的四個(gè)原子和與之相連的兩個(gè)碳原子共處一個(gè)平面，稱肽平面。肽平面內(nèi)的C=O與NH呈

38、反式排列，各原子間的鍵長(zhǎng)和鍵角都是固定的。肽鏈可看作由一系列剛性的肽平面通過(guò)碳原子連接起來(lái)的長(zhǎng)鏈，主鏈的構(gòu)象就是由肽平面之間的角度決定的。主鏈上只有碳原子連接的兩個(gè)鍵是單鍵，可自由旋轉(zhuǎn)。繞CN1旋轉(zhuǎn)的角稱，而繞CC2旋轉(zhuǎn)的角稱。這兩個(gè)角稱為二面角。規(guī)定當(dāng)旋轉(zhuǎn)鍵兩側(cè)的肽鏈成順式時(shí)為0度。取值范圍是正負(fù)180度，當(dāng)二面角都是180度時(shí)肽鏈完全伸展。由于空間位阻，實(shí)際的取值范圍是很有限的。二、二級(jí)結(jié)構(gòu)（一）二級(jí)結(jié)構(gòu)是肽鏈的空間走向蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指肽鏈主鏈的空間走向（折疊和盤(pán)繞方式），是有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象。肽鏈主鏈具有重復(fù)結(jié)構(gòu)，其中氨基是氫鍵供體，羰基是氫鍵受體。通過(guò)形成鏈內(nèi)或鏈間氫鍵可以使肽鏈卷曲

39、折疊形成各種二級(jí)結(jié)構(gòu)單元。復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，就由這些比較簡(jiǎn)單的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元進(jìn)一步組合而成。（二）肽鏈卷曲折疊形成四種二級(jí)結(jié)構(gòu)單元1.螺旋(-helix) 螺旋模型是Pauling和Corey等研究-角蛋白時(shí)于1951年提出的。角蛋白是動(dòng)物的不溶性纖維狀蛋白，是由動(dòng)物的表皮衍生而來(lái)的。它包括皮膚的表皮以及毛發(fā)、鱗、羽、甲、蹄、角、絲等。角蛋白可分為兩類(lèi)，一類(lèi)是角蛋白，胱氨酸含量豐富，如角、甲、蹄的蛋白胱氨酸含量高達(dá)22；另一類(lèi)是角蛋白，不含胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸的含量很高，蠶絲絲心蛋白就屬于這一類(lèi)。角蛋白，如頭發(fā)，暴露于濕熱環(huán)境中幾乎可以伸長(zhǎng)一倍，冷卻干燥后又收縮到原來(lái)長(zhǎng)度。角蛋白

40、則無(wú)此變化。角蛋白的X射線衍射圖案極其相似，沿長(zhǎng)軸方向都有一個(gè)大周期結(jié)構(gòu)或重復(fù)單位，其長(zhǎng)度為55.5埃。Pauling等考慮到肽平面對(duì)多肽鏈構(gòu)象的限制作用，設(shè)計(jì)了多肽鏈折疊的各種可能模型，發(fā)現(xiàn)其中一種螺旋模型能很好地說(shuō)明角蛋白的X射線衍射圖案中的55.5埃重復(fù)單位。在這個(gè)模型中，每隔3.6個(gè)氨基酸殘基螺旋上升一圈，相當(dāng)于向上平移5.4埃。螺旋的直徑是11埃。螺旋上升時(shí)，每個(gè)氨基酸殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100°，向上平移1.5埃，比完全伸展的構(gòu)象壓縮2.4倍。這與衍射圖案中的小周期完全一致。其二面角=-57度，=-48度。在螺旋中氨基酸殘基的側(cè)鏈伸向外側(cè)，相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵，氫鍵的取向幾

41、乎與中心軸平行。氫鍵是由肽鍵中氮原子上的氫與其N(xiāo)端第四個(gè)羰基上的氧之間形成的。螺旋的結(jié)構(gòu)允許所有的肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的形成，因此相當(dāng)穩(wěn)定。-螺旋由氫鍵構(gòu)成一個(gè)封閉環(huán)，其中包括三個(gè)殘基，共13個(gè)原子，稱為3.613（n=3）螺旋。由L型氨基酸構(gòu)成的多肽鏈可以卷曲成右手螺旋，也可卷曲成左手螺旋，但右手螺旋比較穩(wěn)定。因?yàn)樵谧笫致菪刑寂c羰基過(guò)于接近，不穩(wěn)定。在天然蛋白質(zhì)中，幾乎所有螺旋都是右手螺旋。只在嗜熱菌蛋白酶中發(fā)現(xiàn)一圈左手螺旋。在角蛋白中，3或7個(gè)螺旋可以互相擰在一起，形成三股或七股的螺旋索，彼此以二硫鍵交聯(lián)在一起。螺旋不僅是角蛋白的主要構(gòu)象，在其他纖維蛋白和球狀蛋白中也廣泛存在，是一種常見(jiàn)的

42、二級(jí)結(jié)構(gòu)。螺旋是一種不對(duì)稱的分子結(jié)構(gòu)，具有旋光能力。螺旋的比旋不等于其中氨基酸比旋的簡(jiǎn)單加和，因?yàn)樗男庑允歉鱾€(gè)氨基酸的不對(duì)稱因素和構(gòu)象本身不對(duì)稱因素的總反映。天然螺旋的不對(duì)稱因素引起偏振面向右旋轉(zhuǎn)。利用螺旋的旋光性，可以測(cè)定它的相對(duì)含量。一條肽鏈能否形成螺旋，以及螺旋的穩(wěn)定性怎樣，與其一級(jí)結(jié)構(gòu)有極大關(guān)系。脯氨酸由于其亞氨基少一個(gè)氫原子，無(wú)法形成氫鍵，而且CN鍵不能旋轉(zhuǎn)，所以是螺旋的破壞者，肽鏈中出現(xiàn)脯氨酸就中斷螺旋，形成一個(gè)“結(jié)節(jié)”。此外，側(cè)鏈帶電荷及側(cè)鏈基團(tuán)過(guò)大的氨基酸不易形成螺旋，甘氨酸由于側(cè)鏈太小，構(gòu)象不穩(wěn)定，也是螺旋的破壞者。根據(jù)各種殘基的特性，可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。目前常見(jiàn)的

43、預(yù)測(cè)方法有Chou-Fasman法、GOR法、Lim法等，都是根據(jù)統(tǒng)計(jì)信息進(jìn)行預(yù)測(cè)的。如果二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)成功率大于80，就可以用來(lái)預(yù)測(cè)高級(jí)結(jié)構(gòu)，但目前只能達(dá)到70左右。Chou-Fasman法比較直觀，與二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的實(shí)際過(guò)程接近，但成功率不高。Chou-Fasman法根據(jù)各個(gè)氨基酸在一些已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中的表現(xiàn)，按構(gòu)象參數(shù)P(表示形成螺旋的能力) 由大到小將他們分為六組，依次為：最強(qiáng)的形成者(H)：Glu、Met、Ala、Leu中等的形成者(h)：Lys、Phe、Gln、Trp、Ile、Val很弱的形成者(I)：Asp、His中立者(i)：Cys、Ser、Thr、Arg較弱的破壞者(b)：A

44、sn、Tyr最強(qiáng)的破壞者(B)：Gly、Pro如肽鏈中6個(gè)連續(xù)的殘基中有4個(gè)h即可形成核心，然后向兩側(cè)延伸，遇到四肽破壞者時(shí)中止。形成螺旋時(shí)有協(xié)同性，即一旦形成核心，其它殘基就容易加入。2.-折疊（-pleated sheet） -折疊也叫-片層，在-角蛋白如蠶絲絲心蛋白中含量豐富。其X射線衍射圖案與-角蛋白拉伸后的圖案很相似。在此結(jié)構(gòu)中，肽鏈較為伸展，若干條肽鏈或一條肽鏈的若干肽段平行排列，相鄰主鏈骨架之間靠氫鍵維系。氫鍵與鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。為形成最多的氫鍵，避免相鄰側(cè)鏈間的空間障礙，鋸齒狀的主鏈骨架必須作一定的折疊(=139°,=135°)，以形成一個(gè)折疊的片層。側(cè)鏈交

45、替位于片層的上方和下方，與片層垂直。折疊有兩種類(lèi)型，一種是平行式，即所有肽鏈的氨基端在同一端；另一種是反平行式，即所有肽鏈的氨基端按正反方向交替排列。從能量上看，反平行式更為穩(wěn)定。絲心蛋白和多聚甘氨酸是反平行，拉伸角蛋白形成的角蛋白是平行式。反平行式的重復(fù)距離是7.0埃（兩個(gè)殘基），平行式是6.5埃。在絲心蛋白中，每隔一個(gè)氨基酸就是甘氨酸，所有在片層的一面都是氫原子；在另一面，側(cè)鏈主要是甲基，因?yàn)槌拾彼嵬?，丙氨酸是主要成分。如果肽鏈中?cè)鏈過(guò)大，并帶有同種電荷，則不能形成折疊。拉伸后的角蛋白之所以不穩(wěn)定，容易復(fù)原，就是因?yàn)閭?cè)鏈體積大，電荷高。3.轉(zhuǎn)角 轉(zhuǎn)角使肽鏈形成約180°的回轉(zhuǎn)，

46、第一個(gè)氨基酸的羰基與第四個(gè)氨基酸的氨基形成氫鍵。這種結(jié)構(gòu)在球狀蛋白中廣泛存在，可占全部殘基的1/4。多位于球狀蛋白的表面，空間位阻較小處。又分為型、型與III型。4.無(wú)規(guī)卷曲 指沒(méi)有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)看來(lái)雜亂無(wú)章，但對(duì)一種特定蛋白又是確定的，而不是隨意的。在球狀蛋白中含有大量無(wú)規(guī)卷曲，傾向于產(chǎn)生球狀構(gòu)象。這種結(jié)構(gòu)有高度的特異性，與生物活性密切相關(guān)，對(duì)外界的理化因子極為敏感。酶的活性中心往往位于無(wú)規(guī)卷曲中。除以上常見(jiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元外，還有其他新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，如環(huán)，由10個(gè)殘基組成，象希臘字母。5.超二級(jí)結(jié)構(gòu)相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元可組合在一起，相互作用，形成有規(guī)則，在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合

47、體，充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)件，稱為超二級(jí)結(jié)構(gòu)。常見(jiàn)的有三種：由兩股或三股右手螺旋彼此纏繞形成的左手超螺旋，重復(fù)距離約為140埃。由于超螺旋，與獨(dú)立的螺旋略有偏差。：折疊之間由螺旋或無(wú)規(guī)卷曲連接。：由一級(jí)結(jié)構(gòu)上連續(xù)的反平行折疊通過(guò)緊湊的轉(zhuǎn)角連接而成。包括曲折和回形拓?fù)?。三、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中所有原子和基團(tuán)的構(gòu)象。它是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤(pán)曲折疊形成的，包括所有主鏈和側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)。哺乳動(dòng)物肌肉中的肌紅蛋白整個(gè)分子由一條肽鏈盤(pán)繞成一個(gè)中空的球狀結(jié)構(gòu)，全鏈共有8段螺旋，各段之間以無(wú)規(guī)卷曲相連。在螺旋肽段間的空穴中有一個(gè)血紅素基團(tuán)。所有具有高度生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)幾乎都是球狀蛋白。三級(jí)結(jié)構(gòu)是

48、蛋白質(zhì)發(fā)揮生物活性所必須的。在三級(jí)結(jié)構(gòu)中，多肽鏈的盤(pán)曲折疊是由分子中各氨基酸殘基的側(cè)鏈相互作用來(lái)維持的。二硫鍵是維持三級(jí)結(jié)構(gòu)唯一的一種共價(jià)鍵，能把肽鏈的不同區(qū)段牢固地連接在一起，而疏水性較強(qiáng)的氨基酸則借疏水力和范德華力聚集成緊密的疏水核，有極性的殘基以氫鍵和鹽鍵相結(jié)合。在水溶性蛋白中，極性基團(tuán)分布在外側(cè)，與水形成氫鍵，使蛋白溶于水。這些非共價(jià)鍵雖然較微弱，但數(shù)目龐大，因此仍然是維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要力量。較大蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)往往由幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立的三維實(shí)體構(gòu)成，這些三維實(shí)體稱為結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域是在三級(jí)結(jié)構(gòu)與超二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的一個(gè)組織層次。一條長(zhǎng)的多肽鏈，可先折疊成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，再締合成三級(jí)結(jié)構(gòu)。這在

49、動(dòng)力學(xué)上比直接折疊更為合理。結(jié)構(gòu)域在功能上也有其意義。結(jié)構(gòu)域常有相對(duì)獨(dú)立的生理功能，如一些要分泌到細(xì)胞外的蛋白，其信號(hào)肽（負(fù)責(zé)使蛋白通過(guò)細(xì)胞膜）就構(gòu)成一個(gè)結(jié)構(gòu)域。此外，還有與殘基修飾有關(guān)的結(jié)構(gòu)域、與酶原激活有關(guān)的結(jié)構(gòu)域等。各結(jié)構(gòu)域之間常常只有一段肽鏈相連，稱為鉸鏈區(qū)。鉸鏈區(qū)柔性較強(qiáng)，使結(jié)構(gòu)域之間容易發(fā)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，所以酶的活性中心常位于結(jié)構(gòu)域之間。小蛋白多由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，由多個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白一般分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。四、蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)由兩條或兩條以上肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵構(gòu)成的蛋白質(zhì)稱為寡聚蛋白。其中每一條多肽鏈稱為亞基，每個(gè)亞基都有自己的一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。亞基單獨(dú)存在時(shí)無(wú)生物活性，只有相互聚合成

50、特定構(gòu)象時(shí)才具有完整的生物活性。四級(jí)結(jié)構(gòu)就是各個(gè)亞基在寡聚蛋白的天然構(gòu)象中空間上的排列方式。胰島素可形成二、六聚體，但不是其功能單位，所以不是寡聚蛋白。判斷標(biāo)準(zhǔn)是將發(fā)揮生物功能的最小單位作為一個(gè)分子。最簡(jiǎn)單的寡聚蛋白是血紅蛋白。它是由兩條鏈和兩條鏈構(gòu)成的四聚體，分子量65000。分子外形近似球狀，每個(gè)亞基都和肌紅蛋白類(lèi)似。血紅蛋白與氧結(jié)合時(shí)，和鏈都發(fā)生了轉(zhuǎn)動(dòng)，引起四個(gè)亞基間的接觸點(diǎn)上的變化。兩個(gè)亞基相互接近，兩個(gè)亞基則離開(kāi)。當(dāng)酸、熱或高濃度的尿素、胍等變性因子作用于寡聚蛋白時(shí)，后者會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化。這種變化可分為兩步：首先是亞基彼此解離，然后分開(kāi)的亞基伸展而成無(wú)規(guī)線團(tuán)。如小心處理，可將寡聚蛋白的

51、亞基拆開(kāi)，而不破壞其三級(jí)結(jié)構(gòu)。如血紅蛋白可用鹽解離成兩個(gè)半分子，即兩個(gè)、亞基。當(dāng)透析除去過(guò)量的鹽后，分開(kāi)的亞基又可重新結(jié)合而恢復(fù)活性。如果處理?xiàng)l件強(qiáng)烈，則亞基的多肽鏈完全展開(kāi)。這樣要恢復(fù)天然構(gòu)象雖很困難，但有些寡聚蛋白仍可恢復(fù)。如醛縮酶經(jīng)酸處理后，其4個(gè)亞基完全伸展成無(wú)規(guī)卷曲，當(dāng)pH恢復(fù)到7左右時(shí)，又可恢復(fù)如初。這說(shuō)明一級(jí)結(jié)構(gòu)規(guī)定了亞基間的結(jié)合方式，四級(jí)結(jié)構(gòu)的形成也遵從“自我裝配”的原則。五、結(jié)構(gòu)舉例（一）纖維狀蛋白角蛋白角蛋白是動(dòng)物的不溶性纖維狀蛋白，是由動(dòng)物的表皮衍生而來(lái)的。它包括皮膚的表皮以及毛發(fā)、鱗、羽、甲、蹄、角、絲等。角蛋白可分為兩類(lèi)，一類(lèi)是角蛋白，胱氨酸含量豐富，如角、甲、蹄的蛋

52、白胱氨酸含量高達(dá)22；另一類(lèi)是角蛋白，不含胱氨酸，但甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸的含量很高，蠶絲絲心蛋白就屬于這一類(lèi)。角蛋白，如頭發(fā)，暴露于濕熱環(huán)境中幾乎可以伸長(zhǎng)一倍，冷卻干燥后又收縮到原來(lái)長(zhǎng)度。角蛋白則無(wú)此變化。頭發(fā)主要是由角蛋白構(gòu)成的。三股右手螺旋形成左手超螺旋，稱為原纖維，直徑2納米。原纖維再排列成“92”的電纜式結(jié)構(gòu)，稱為微纖維，直徑8納米。成百根微纖維結(jié)合成不規(guī)則的纖維束，稱大纖維，直徑200納米。頭發(fā)周?chē)趋[狀細(xì)胞，中間是皮層細(xì)胞。皮層細(xì)胞的直徑是20微米，是由許多大纖維沿軸向平行排列而成的。膠原膠原是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成皮膚、骨胳、軟骨、肌腱、牙齒的主要纖維成分。膠原共有

53、4種，結(jié)構(gòu)相似，都由原膠原構(gòu)成。其一級(jí)結(jié)構(gòu)中甘氨酸占1/3，脯氨酸、羥脯氨酸和羥賴氨酸含量也較高。賴氨酸可用來(lái)結(jié)合糖基。原膠原是一個(gè)三股的螺旋桿，是由三股特殊的左手螺旋構(gòu)成的右手超螺旋。這種螺旋的形成是由于大量的脯氨酸和甘氨酸造成的。羥脯氨酸和羥賴氨酸的羥基也參與形成氫鍵，起著穩(wěn)定這種結(jié)構(gòu)的作用。羥脯氨酸和羥賴氨酸都是蛋白合成后經(jīng)羥化酶催化而羥化的。在膠原中每隔2個(gè)殘基有一個(gè)甘氨酸，只有處于甘氨酸氨基端的脯氨酸才能被羥化。羥化是在脯氨酰羥化酶的催化下進(jìn)行的，這個(gè)酶需要維生素C使其活性中心的鐵原子保持亞鐵狀態(tài)。缺少維生素C會(huì)使羥化不完全，膠原熔點(diǎn)低，不能正常形成纖維，造成皮膚損傷和血管脆裂，引起

54、出血、潰爛，即壞血病。所以維生素C又叫抗壞血酸。成纖維細(xì)胞合成原膠原的前體，并分泌到結(jié)締組織的細(xì)胞外空間，形成超螺旋結(jié)構(gòu)，再經(jīng)酶切，即成原膠原。原膠原之間平行排列，互相錯(cuò)開(kāi)1/4，構(gòu)成膠原的基本結(jié)構(gòu)。一個(gè)原膠原的頭和另一個(gè)原膠原的尾之間有40納米的空隙，其中填充磷酸鈣，即骨的無(wú)機(jī)成分。膠原的特殊的結(jié)構(gòu)和組成使它不受一般蛋白酶的水解，但可被膠原酶水解。在變態(tài)的蝌蚪的尾鰭中就含有這種酶。3.彈性蛋白能伸長(zhǎng)到原來(lái)長(zhǎng)度的幾倍，并可很快恢復(fù)原來(lái)長(zhǎng)度。在韌帶、血管壁等處含量較大。含1/3的甘氨酸，脯氨酸和賴氨酸也較多。羥脯氨酸和羥賴氨酸含量很少。彈性蛋白形成的螺旋由兩種區(qū)段組成，一種是富含甘氨酸、脯氨酸和

55、纈氨酸的左手螺旋，一種是富含丙氨酸和賴氨酸的右手螺旋。賴氨酸之間形成鎖鏈素或賴氨酰正亮氨酸，使鏈間發(fā)生交聯(lián)，具有很大的彈性。因?yàn)殒i鏈素可連接二、三或四條肽鏈，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所以彈性蛋白可向各個(gè)方向作可逆伸展。4.肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白兩種可溶性纖維蛋白，構(gòu)成肌肉的主要成分。前者構(gòu)成粗絲，后者構(gòu)成細(xì)絲。細(xì)絲沿粗絲的滑動(dòng)導(dǎo)致肌肉的伸縮，引起肌體動(dòng)作。這一過(guò)程需要其它物質(zhì)的參與和ATP供能。（二）球狀蛋白1. 肌紅蛋白肌肉中用來(lái)儲(chǔ)存氧。海洋哺乳動(dòng)物的肌肉中含大量肌紅蛋白，因而可長(zhǎng)時(shí)間潛水。抹香鯨每千克肌肉中含80克肌紅蛋白，比人高10倍，所以其肌肉呈棕色。分子量16700，單結(jié)構(gòu)域。由8段螺旋構(gòu)成一個(gè)球

56、狀結(jié)構(gòu)，親水基團(tuán)多在外層。血紅素輔基位于一個(gè)疏水洞穴中，這樣可避免其亞鐵離子被氧化。亞鐵離子與卟啉形成4個(gè)配位鍵，第五個(gè)配位鍵與93位組氨酸結(jié)合，空余的一個(gè)配位鍵可與氧可逆結(jié)合。其氧合曲線為雙曲線。2.血紅蛋白由4個(gè)亞基構(gòu)成一個(gè)四面體構(gòu)型，每個(gè)亞基的三級(jí)結(jié)構(gòu)都與肌紅蛋白相似，但一級(jí)結(jié)構(gòu)相差較大。成人主要是HbA，由兩個(gè)亞基和兩個(gè)亞基構(gòu)成，兩個(gè)亞基之間有一個(gè)DPG（二磷酸甘油酸），它與亞基形成6個(gè)鹽鍵，對(duì)血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)起著穩(wěn)定的作用。因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以不易與氧結(jié)合。當(dāng)一個(gè)亞基與氧結(jié)合后，會(huì)引起四級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，使其它亞基對(duì)氧的親和力增加，結(jié)合加快。反之，一個(gè)亞基與氧分離后，其它亞基也易于解離

57、。所以血紅蛋白是變構(gòu)蛋白，其氧合曲線是S形曲線，只要氧分壓有一個(gè)較小的變化即可引起氧飽和度的較大改變。這有利于運(yùn)輸氧，肺中的氧分壓只需比組織中稍微高一些，血紅蛋白就可以完成運(yùn)氧工作。第五節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)多種多樣的生物功能是以其化學(xué)組成和極其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。這不僅需要一定的結(jié)構(gòu)還需要一定的空間構(gòu)象。蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象取決于其一級(jí)結(jié)構(gòu)和周?chē)h(huán)境，因此研究一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是十分重要的。一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）種屬差異對(duì)不同機(jī)體中表現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)比較，發(fā)現(xiàn)種屬差異十分明顯。例如比較各種哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和魚(yú)類(lèi)等胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它們都是由51個(gè)氨基酸組成的，其排列順序大體相同但有細(xì)微差別。不同種屬的胰島素其差異在A鏈小環(huán)的8、9、10和B鏈30位氨基酸殘基。說(shuō)明這四個(gè)氨基酸殘基對(duì)生物活性并不起決定作用。起決定作用的是其一級(jí)結(jié)構(gòu)中不變的部分。有24個(gè)氨基酸始終不變，為不同種屬所共有。如兩條鏈中的6個(gè)半胱氨酸殘基的位置始終不變，說(shuō)明不同種屬的胰島素分子中AB鏈之間有共同的連接方式，三對(duì)二硫鍵對(duì)維持高級(jí)結(jié)構(gòu)起著重要作用。其他一些不變的殘基絕大多數(shù)是非極性氨基酸，對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)起著穩(wěn)定作用。對(duì)不同種屬的細(xì)胞色素C的研究同樣指出