臨床檢驗(clinical

1、緒緒 論論主講主講 楊怍升楊怍升緒 論v一、臨床檢驗（clinical laboratory technology or science）又稱實(shí)驗診斷學(xué)，就是通過實(shí)驗室的各種檢查方法，包括感官檢查、理學(xué)檢查、化學(xué)檢查、顯微鏡檢查以及自動化儀器檢查等，對病人的血液、體液、分泌物和排泄物等標(biāo)本進(jìn)行檢查、分析，以獲得病原、病理變化及臟器功能狀態(tài)等資料。二、臨床檢驗在醫(yī)學(xué)中的作用 1、為準(zhǔn)確診斷、及時治療提供依據(jù)臨床檢驗的結(jié)果是支持診斷、鑒別診斷、甚至確定診斷的主要依據(jù)。例：anemia依據(jù)：血中紅細(xì)胞和血紅蛋白量減少leukemia依據(jù)：血象和骨髓象腎臟有實(shí)質(zhì)性損傷的依據(jù)尿液中出現(xiàn)蛋白、細(xì)胞管型問：

2、tumor？2、為分析病情、觀察療效、判斷預(yù)后提供依據(jù)在疾病過程中，血液、體液、分泌物和排泄物也會隨之發(fā)生相應(yīng)的變化3、為預(yù)防疾病提供資料如血象和腫瘤細(xì)胞學(xué)的普查等三、臨床檢驗的一般方法1、目視檢查直接觀察標(biāo)本：顏色、透明度、性狀，有無凝塊或寄生蟲2、理學(xué)檢查液體的相對密度、血液比粘度、紅細(xì)胞沉降率、紅細(xì)胞比積等病理變化3、化學(xué)檢查定性和定量檢測標(biāo)本化學(xué)成分的病理變化4、顯微鏡檢查觀察有型成分的數(shù)量和形態(tài)5、自動化儀器檢查電子技術(shù)、程序控制的發(fā)展四、學(xué)習(xí)臨床檢驗的目的和要求1、理論聯(lián)系實(shí)踐2、操作要求3、檢驗結(jié)果必須和臨床表現(xiàn)結(jié)合4、檢驗人員的醫(yī)德第一章第一章 血液標(biāo)本采集和血涂片制備血液標(biāo)本

3、采集和血涂片制備血液學(xué)檢查 ： 反應(yīng)造血系統(tǒng)本身、機(jī)體全身或局部病變有助于疾病的診斷及療效、預(yù)后的觀察只能反應(yīng)疾病某一方面的情況，不能認(rèn)為是病程的全部反應(yīng)；不同個體，對同一影響有不同的反應(yīng)，或也可對不同影響產(chǎn)生相同的反應(yīng)一、血液標(biāo)本的采集1、毛細(xì)血管采血法部位：中指或無名指尖內(nèi)側(cè)，半歲以下拇指或 足部，特殊人員視情況而定。b. 所用器材：采血針、吸管c. 采血步驟及注意事項2、靜脈采血法部位：主要是肘靜脈。還可以在：手背部手腕部等 幼兒可采用頸外靜脈采血。采血器材：一次性注射器，檢驗用真空定量采血裝 置c. 采血步驟及注意事項兩種采血方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較毛細(xì)血管靜脈血缺點(diǎn)限制了重復(fù)實(shí)驗和追加實(shí)驗，

4、標(biāo)本量少，局部炎癥可得假結(jié)果，組織液可混入不同抗凝劑的使用，改變血液性質(zhì)，影響有形成分的形態(tài)優(yōu)點(diǎn)價廉、快速、操作簡便，標(biāo)本可直接測定標(biāo)本代表性大，無組織液影響，適于臨床研究，可重復(fù)實(shí)驗和追加其他實(shí)驗二、常用血液標(biāo)本抗凝劑及其使用選擇v1、檸檬酸鈉（枸櫞酸鈉）a. 抗凝原理：螯合鈣離子使用方法 配成109 mmol/L的濃度和血液1：9 106 mmol/L的濃度和血液1：4化學(xué)名：3-羥基-3-羧基戊二酸（三鈉鹽）c. 適用范圍：止血學(xué)檢驗、血沉、輸血保養(yǎng)液（毒性小）2. 草酸鈉（乙二酸的鈉鹽）a. 抗凝原理：草酸鈣沉淀b. 使用方法 草酸鈉0.1mol/L 和血液1：9c. 適用范圍： 止血

5、學(xué)檢驗3. 雙草酸鹽抗凝劑 a. 抗凝原理： 草酸鈣沉淀使用方法： 草酸鉀0.8g , 草酸銨1.2g（100ml） 與血液 1：10 （80C以下烘干）適用范圍： 紅細(xì)胞檢驗（紅細(xì)胞比積、計數(shù)） 不適于血小板計數(shù)和白細(xì)胞分類計數(shù)4. 肝素 （含硫酸基團(tuán)的粘多糖）抗凝原理：低濃度時抑制因子a、和PF3之 間的作用，加強(qiáng)抗凝血酶滅活絲 氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成， 還能抑制凝血酶的自我催化及抑制 因子的作用；高濃度時阻斷凝血 酶和纖維蛋白的反應(yīng)。 b. 適用方法： 1g/L濃度的肝素鈉與血液 1：10優(yōu)點(diǎn)：抗凝能力強(qiáng)、不影響血細(xì)胞體積、不易 溶血、能耐高溫。適用范圍： 紅細(xì)胞檢驗（紅細(xì)胞計數(shù)

6、、血紅蛋白 測定、紅細(xì)胞比積）和多種生化分析5. 乙二胺四乙酸（EDTA）鹽a. 抗凝原理： 螯合鈣離子b. 使用方法： 15g/L濃度EDTA 和血液 1：10適用范圍： 對血細(xì)胞形態(tài)影響小-血小板計數(shù)； 影響血小板聚集和白細(xì)胞吞噬功能 -不易做止血學(xué)檢驗及血小板功能 檢驗。 物理方法抗凝： 脫纖維蛋白： 將血液注入有玻璃珠的器皿中，轉(zhuǎn)動，纖維 蛋白纏繞凝固于玻璃球，從而防止血成凝塊。適 用于免疫學(xué)檢驗和紅斑性狼瘡細(xì)胞檢查。三、血涂片的制備技術(shù)血涂片的用途： 血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗、網(wǎng)織紅、異常 寄生蟲檢驗。 2. 血涂片制備步驟：（手工推片法）v將推玻片向1的方向稍抽回，當(dāng)血液充滿推玻片的寬度后

7、，以一定均勻的速度向2的方向滑動。3. 血涂片質(zhì)量評價： 均勻、厚薄、頭體尾、邊緣、兩側(cè)注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚四、 細(xì)胞染色技術(shù)染料-生物學(xué)染色劑：將生物組織細(xì)胞和病原體染色，在顯微鏡 下觀察結(jié)構(gòu)。（一）、染料 （天然染料和人工染料） 發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)使生物學(xué)染色劑產(chǎn)生顏色和被染組織親合。堿性染料：為陽離子染料，能接受質(zhì)子，染細(xì)胞核 的染料。如亞甲藍(lán)、天青。酸性染料：為陰離子染料，能釋放質(zhì)子。主要有熒 烷-氧雜蒽染料和偶氮染料兩類，能結(jié)合 細(xì)胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、 嗜酸性顆粒成分等。3. 復(fù)合染料：同時具有陰、陽離子型的染料如瑞氏染料（二）、細(xì)胞染色原理： 一般以它們

8、的物理現(xiàn)象和/或化學(xué) 現(xiàn)象為依據(jù)1. 物理作用：毛細(xì)管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等化學(xué)作用： a. 染料的化學(xué)成分：助色基團(tuán)的存在，堿性染料 在溶媒中為陽離子型，易與組織和細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的酸性物質(zhì)結(jié)合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與帶正電荷的堿性物質(zhì)結(jié)合。 b. 蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)中的氨基酸含有不同數(shù)量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同時還有其他活性基團(tuán)。在游離狀態(tài)時， -NH2獲得一個H+變成帶正電的-NH3+，而-COOH失去一個H+變成帶負(fù)電的-COO-。分別與不同染料結(jié)合。 c. 周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pHpI（ pI 為等電 點(diǎn)），則蛋白質(zhì)帶正電，結(jié)合酸性染料；反之

9、， pH pI，則結(jié)合堿性染料。（三）、細(xì)胞染色法的類型 1. 普通染色法： 經(jīng)物理和/或化學(xué)作用的吸附、結(jié)合 2. 熒光染色法：熒光染料，熒光顯微鏡 3. 細(xì)胞活體染色法：活體染料如燦爛甲酚藍(lán)等 4. 細(xì)胞化學(xué)染色法：用化學(xué)反應(yīng)顯示細(xì)胞內(nèi)某種成分。細(xì)胞免疫化學(xué)染色法（應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)） 五、 瑞氏染色法（一）、染色原理 分兩相進(jìn)行，第一相是酸性伊紅與細(xì)胞中的堿性物質(zhì)如血紅蛋白、嗜酸性顆粒結(jié)合；堿性染料天青 B與細(xì)胞中的酸性物質(zhì)如核染色質(zhì)、特異中性顆粒、 血小板結(jié)合。第二相是天青B和伊紅結(jié)合在適宜條件下 形成紫色的天青B-伊紅復(fù)合物，結(jié)果使白細(xì)胞核染色質(zhì)成紫色（瘧原蟲的染色質(zhì)成紅

10、色），中性粒細(xì)胞的顆粒及血小板顆粒區(qū)成紫色。（二）、試劑 1. Wright染液 瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml 甲醇：有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定為一定 形態(tài)，并使蛋白質(zhì)沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀等結(jié)構(gòu)，增 加細(xì)胞與染料接觸表面積，提高對染料的吸附作用， 增強(qiáng)染色效果。磷酸鹽緩沖液（PBS）：磷酸二氫鉀（無水）0.3 g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g, 蒸餾水加到1000ml。 配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。染色方法： a. 用蠟筆在血膜兩頭劃線，平放于染色架上。 b. 加瑞氏染液覆蓋血膜，固定1min。 c. 滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10分鐘。 d. 用清水沖洗，待干后鏡檢。注意事項： a. 血膜要干透后才能染色，否則染色時易脫落 b. 染色時間與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)，一般染液淡、染色時間長些效果好。 c. 染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀。 d. 沖洗時不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防染料沉著。沖洗時間也不能長。 e. 染色過淡，可復(fù)染。 f. 染色過深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色六、 姬姆薩染色法（一