生物化學(xué)試驗(yàn)基本操作玻璃儀器的規(guī)格和使用吸管

1、第二章生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)根本操作第一節(jié)玻璃儀器的規(guī)格和使用一、吸管的使用計(jì)量?jī)x器的選擇應(yīng)根據(jù)量取液體的體積大小而定，同時(shí)要考慮量取的準(zhǔn)確度表2-20。表2 -1計(jì)量?jī)x器的選擇標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量?jī)x器最正確量程準(zhǔn)確度滴管30 M 至 2ml低量筒5-2000ml中等容量瓶5-2000ml高滴定管1-25ml高吸管/移液槍5 d 至 10ml高微量注射器0.5-10ml高天平任何量度取決于天平的準(zhǔn)確度極高錐形瓶/燒杯25-5000ml極低吸管吸量管為精密計(jì)量容器，生化實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用。一吸管的類型1 移液管即單刻度吸管1普通單標(biāo)吸管它的中部有一圓柱狀空泡，只能量全量。當(dāng)所量取的液體自行流出后，使吸管尖端在受壁上停留3

2、-5秒，所余少量液體不必吹出，因?yàn)槠涔潭▋A出容量已經(jīng)檢定。2奧氏吸管它具有一相當(dāng)大的卵形空球及一短小的出口。當(dāng)將所量取的液體放出后， 必須將遺留在管尖內(nèi)的少量液體吹入受器內(nèi)。某些奧氏吸管帶有玻璃塞。在所有的吸管中以?shī)W氏吸管的準(zhǔn)確度最高，常用于定量實(shí)驗(yàn)。2. 吸管 即多刻度吸管1普通吸管它是直筒狀吸管，其上有多個(gè)刻度。北京玻璃廠生產(chǎn)的吸管，1ml以下不包括1ml都必須把尖端遺留的液體吹入受器中，新產(chǎn)品都注明有“吹字。1ml以上包括1ml那么不吹出 尖端遺留的液體。當(dāng)液體不再流出時(shí)， 應(yīng)使該管尖緊靠受器內(nèi)壁一段時(shí)間。 這種吸管又分為 慢流速、快流速2種。按其容量和精密度不同，慢流速吸管又分為 A與

3、B級(jí)，快流速吸管只 有B級(jí)。使用時(shí)，A級(jí)最后停留15秒，B級(jí)最后停3秒，同時(shí)需轉(zhuǎn)動(dòng)吸管。2莫氏吸管總量刻度在尖端以上，卸放液體時(shí)按刻度進(jìn)行。二刻度吸量管移液操作1. 選取原那么：每根吸量管上有許多等分的刻度，在刻度標(biāo)記有自上而下和自下而上兩種，規(guī)格為0.1 ml，0.2 ml，0.5ml，1ml，2 ml，5 ml，10 ml等。在一次完成移液的前提下， 應(yīng)選用容積較小的吸量管，對(duì)于同一次實(shí)驗(yàn)中同一種試劑的移取，應(yīng)選用同一支吸量管。2 操作過程：圖2 1刻度吸量管移液操作1執(zhí)管：拇指執(zhí)吸量管上部，使吸量管保持垂直，食指按在管口上調(diào)節(jié)流速，刻度 朝向操作者；2取液：把吸量管插入液體，用洗耳球吸取

4、液體至所需刻度上方，移開洗耳球，迅速用食指壓緊管口， 然后抽離液面。調(diào)準(zhǔn)刻度：用食指控制液體至所需刻度 此時(shí)液體凹面、 視線和刻度應(yīng)在同一水平線上 3放液：移開食指，讓液體自然流入容器內(nèi)。此時(shí)，管尖應(yīng)接觸容器內(nèi)壁，但不應(yīng)插入容器的原有液體中否那么管尖會(huì)沾上容器內(nèi)試劑，再移液時(shí)致使試劑交叉污染。待液體 流盡，將最后液滴吹出或轉(zhuǎn)動(dòng)吸量管使其沿容器內(nèi)壁流出。4洗滌：吸取血漿，尿及粘稠試劑的吸量管，用后應(yīng)及時(shí)用自來水沖洗干凈。如果 吸取一般試劑的吸量管，可待實(shí)驗(yàn)完畢后再洗。三吸管使用考前須知1. 對(duì)于多刻度吸管，有刻度到尖端的和不到尖端的；有讀數(shù)是從上而下的，也有讀數(shù)是從下而上的。使用時(shí)必須看清楚，以

5、免發(fā)生過失。2執(zhí)管時(shí)，要盡量拿上部，以食指堵住管口控制流量，刻度數(shù)字要向著自己。3不管使用哪一種吸管，都應(yīng)以食指堵住吸管的上孔。當(dāng)從液體中取出后，特別是吸 取粘性大的液體時(shí)， 必須先用濾紙將管的外壁擦干。 放出所需液體時(shí)， 必須使吸管尖端輕輕 觸及受器的內(nèi)壁。4吸取溶液時(shí)要把吸管插入適當(dāng)深度，防止吸空。嚴(yán)禁用口吸取，應(yīng)在管口上方用一 橡皮球吸而獲取溶液。5. 應(yīng)根據(jù)不同的需要量選用適當(dāng)?shù)奈?。例如吸?. 5ml溶液時(shí)，以選用2ml吸管為宜， 而5ml和10ml的均不適用。假設(shè)以1ml的吸取2次，那么因誤差時(shí)機(jī)增多而不適宜。6. 讀數(shù)時(shí)，管要垂直背對(duì)光線，眼與凹液面應(yīng)在同一水平高度上。7. 吸

6、管的洗滌 : 吸管用后，要以自來水沖洗數(shù)次，晾干后，以重鉻酸鉀 -硫酸洗液浸泡 1 小時(shí)以上。 如果是放入大量筒中浸泡， 要注意在筒下應(yīng)墊有玻璃纖維， 并將吸管的尖嘴朝上。 尖嘴局部假設(shè)碰破殘缺，那么吸量不準(zhǔn)；上口碰破殘缺，那么流量不易控制；二者均不宜使用，因 此要細(xì)心保管。四吸管的校正首先以分析天平稱出帶蓋稱量瓶重量， 然后用潔凈枯燥的吸管吸取蒸餾水至刻度處， 將 蒸餾水移入稱量瓶?jī)?nèi)，蓋好蓋再稱其重，由前后 2次的稱量值求出吸管中水的重量，重復(fù)稱 量2 -3 次取其平均值。再按水在校正溫度下的相對(duì)密度求得校正體積。二、微量可調(diào)加液管微量可調(diào)加液管常用于吸取 1ml 以內(nèi)的微量液體。 此管由塑

7、料制成， 具有使用方便、 取 液迅速、不易破損、 能吸取多種樣品等優(yōu)點(diǎn)。 適用于連續(xù)取樣和試液分裝， 目前廣泛使用于 臨床生化檢驗(yàn)中。 微量可調(diào)加液管一般為 5 檔調(diào)節(jié)， 其規(guī)格可根據(jù)需要選擇， 生化實(shí)驗(yàn)常選 用50、100、150、200和250卩l(xiāng)的微量可調(diào)加液管。微量可調(diào)加液管在正式使用前， 要連續(xù)按動(dòng)屢次， 使管內(nèi)空氣同工作環(huán)境空氣進(jìn)行交換， 保持管內(nèi)空氣工作負(fù)壓恒定。 使用時(shí)將塑料吸液嘴套在加液管頭上， 輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)， 以保持密封。 垂直地握住加液管，將按鈕按到第1停止點(diǎn)，并將吸液嘴浸入液面下23伽，緩慢地放松按鈕，使之復(fù)位，12秒鐘后從液體中取出。再將加液管移至準(zhǔn)備好的容器內(nèi)，緩慢地將

8、 按鈕按到第 1 停止點(diǎn)，等待 1 2秒鐘后再將按鈕完全按下，排出液體。使用不同的試液應(yīng)更換塑料吸液嘴。三、量筒量筒在準(zhǔn)確度要求不高的情況下， 用來量取相對(duì)大量的液體。 不需加熱促進(jìn)溶解的定性 試劑可直接在量筒中配制。 量筒的規(guī)格有 10ml、25ml 、50ml、100ml 、250ml、500ml 、1000ml 等多種。四、容量瓶容量瓶是一種較準(zhǔn)確的容量?jī)x器， 帶有磨口瓶塞， 上部是細(xì)小呈圓柱形的頸部并刻有環(huán) 形的刻度， 下部是膨大呈壺腹?fàn)畹钠可怼?使用前應(yīng)檢查容量瓶的瓶塞是否漏水， 瓶塞應(yīng)系在 瓶頸上， 不得任意更換。 用容量瓶配制溶液時(shí)， 固體物質(zhì)必須先在小燒杯中溶解或加熱溶解， 冷

9、卻至室溫后才能轉(zhuǎn)移到容量瓶中， 然后加溶劑稀釋至標(biāo)線。 當(dāng)溶劑加到快要接近標(biāo)線時(shí)應(yīng) 停頓 30 秒左右，待瓶頸上部液體流下后，再小心逐滴參加，直至溶液的彎月面最低點(diǎn)與標(biāo) 線相切。容量瓶絕不能加熱或烘干。容量瓶的規(guī)格有10ml 、 25ml、 50ml 、100ml 、 250ml 、50ml0、 1000ml 等多種。第二節(jié) 玻璃和塑料儀器的清洗與枯燥一、玻璃儀器的清洗實(shí)驗(yàn)中所用的玻璃儀器清潔與否， 直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果， 做生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)玻璃儀器清 潔程度的要求， 比一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求更高。 這是因?yàn)樯锘瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)、酶、核酸等 往往都是以“毫克和“微克計(jì)的，稍有雜質(zhì)，影響就很大。生物化學(xué)

10、實(shí)驗(yàn)對(duì)許多常見的 污染雜質(zhì)十分敏感， 如金屬離子 鈣、鐵離子等 、去污劑和有機(jī)物等， 因此玻璃儀器是否徹 底清洗凈就顯得非常重要。1. 初用玻璃儀器的清洗新購(gòu)置的玻璃儀器外表常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用 0.5%去污劑洗刷， 再用自來水洗凈，然后浸泡在 1%-2%鹽酸溶液中過夜 不可少于 4h ，再用自來水沖洗，最后用無(wú)離子水 沖洗2次，在100-120 C烘箱內(nèi)烘干備用。2. 使用過的玻璃儀器的清洗 1 一般玻璃儀器試管、燒杯、錐形瓶等 包括量筒 等一般玻璃儀器，選用大小適宜的毛刷，先用自來水 洗刷至無(wú)污物；再沾取洗滌凈稀釋液或浸入洗滌凈稀釋液內(nèi)，將器皿內(nèi)外特別是內(nèi)壁 細(xì)心刷洗，用自來水沖

11、洗干凈后，蒸餾水沖洗23次，烤干或倒置在清潔處，干后備用。凡洗凈 的玻璃器皿，不應(yīng)在器壁上帶有水珠，否那么表示尚未洗干凈， 應(yīng)再按上述方法重新洗滌。假設(shè) 發(fā)現(xiàn)內(nèi)壁有難以去掉的污跡，應(yīng)分別試用各種洗滌劑予以去除，再重新沖洗。) (2 量器 移液管、滴定管、量瓶等量器。使用后應(yīng)立即浸泡于涼水中，勿使物質(zhì)干涸。工作完畢 后用流水沖洗， 去除附著的試劑、 蛋白質(zhì)等物質(zhì)， 晾干后浸泡在絡(luò)酸洗液中 小時(shí) 46或過夜， 再用自來水充分沖洗、最后用蒸餾水沖洗24次，風(fēng)干備用。3. 石英和玻璃比色皿的清洗石英和玻璃比色皿絕不可用強(qiáng)堿清洗， 因?yàn)閺?qiáng)堿會(huì)浸蝕拋光的比色皿。 只能用洗液或 1% -2%的去污劑浸泡，然

12、后用自來水沖洗，清洗干凈的比色皿應(yīng)是內(nèi)外壁不掛水珠。洗刷儀器時(shí)，應(yīng)首先將手用肥皂洗凈，免得手上的油污附在儀器上，增加洗刷的困難。 如儀器長(zhǎng)久存放附有塵灰，先用清水沖去，再按要求選用潔凈劑洗刷或洗滌。如用去污粉， 可先將刷子蘸上少量去污粉，把儀器內(nèi)外全刷1遍，再邊用水沖邊刷洗至肉眼看不見有去污粉時(shí)，用自來水洗 3 -6 次，再用蒸餾水沖 3次以上。一個(gè)洗干凈的玻璃儀器，應(yīng)該以掛不住 水珠為度。 如仍能掛住水珠，那么需要重新洗滌。用蒸餾水沖洗時(shí)， 要用順壁沖洗方法并充分 振蕩， 經(jīng)蒸餾水沖洗后的儀器， 用指示劑檢查應(yīng)為中性。 做痕量金屬分析的玻璃儀器， 使用 ( 1:1 )-(1:9) HN0 3

13、溶液浸泡，然后進(jìn)行常法洗滌。進(jìn)行熒光分析時(shí)，玻璃儀器應(yīng)防止使用 洗衣粉洗滌 ( 因洗衣粉中含有熒光增白劑， 會(huì)給分析結(jié)果帶來誤差 ) 。分析致癌物質(zhì)時(shí)， 應(yīng)選 用適當(dāng)洗液浸泡，然后再按常法洗滌。二、塑料器皿的清洗聚乙烯、 聚丙烯等制成的塑料器皿， 在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中已被使用得越來越多。 第一次 使 用塑料器皿時(shí)，可先用 8mol/L 尿素 (用相對(duì)密度為 1.19 的濃鹽酸調(diào) pH = 1)清洗，接著依次用 去離子水、 1mol/L KOH 和去離子水清洗，然后用 10 mol/L EDTA 除去金屬離子的污染，最后 用去離子水徹底清洗， 以后每次使用時(shí)， 可只用 0.5%的去污劑清洗， 然后用

14、自來水和去離子 水洗凈即可。第三節(jié) 溶液的混勻攪拌與過濾一、溶液的混勻、攪拌與振蕩 在生化實(shí)驗(yàn)中，每參加一種試劑后必須充分混勻，才能使反響充分進(jìn)行；配制溶液時(shí)， 必須隨時(shí)攪拌或進(jìn)行振蕩混合。常用的溶液混勻方法有以下 3 種。1攪拌式適用于燒杯內(nèi)溶液的混勻。(1) 攪拌使用的玻璃棒，必須兩頭都燒圓滑。(2) 玻璃棒的粗細(xì)長(zhǎng)短必須與容器的大小和所配制的溶液的量呈適當(dāng)比例關(guān)系。不能用 長(zhǎng)而粗的玻璃棒去攪拌小離心管中的少量溶液。(3) 攪拌時(shí)，盡量使玻璃棒沿著器壁運(yùn)動(dòng)，不攪入空氣，不使溶液飛濺。(4) 傾入液體時(shí)， 必須沿壁器慢慢傾入， 以免大量空氣混入。 傾倒外表張力低的液體 ( 如 蛋白質(zhì)溶液 )

15、 時(shí)，更須緩慢仔細(xì)。(5) 研磨配制溶膠溶液時(shí)，要使杵棒沿著研缽的單方向進(jìn)行，不要來回研磨。2. 旋轉(zhuǎn)式適用于錐形瓶、容量瓶、大試管內(nèi)溶液的混勻。(1) 振蕩混合小離心管中液體時(shí)，可將離心管拿在手中，以手腕或肩作軸旋轉(zhuǎn)離心管； 手指持管的松緊要適合振動(dòng)的幅度。還可以把雙手掌心相對(duì)合攏，夾住離心管，來回搓動(dòng)。(2) 振蕩溶液時(shí)，應(yīng)沿著園圈轉(zhuǎn)動(dòng)容器，不應(yīng)上下振蕩。(3) 在容量瓶中混合溶液時(shí)，應(yīng)倒持容量瓶搖動(dòng)，用食指或手心頂住瓶塞，并不斷翻轉(zhuǎn) 容量瓶。(4) 在分液漏斗中振蕩液體時(shí)，應(yīng)用一手在適當(dāng)斜度下倒持漏斗，用食指或手心頂住瓶 塞，并用另一只手控制活塞。一邊振蕩，一邊翻開活塞，使氣體可以隨時(shí)從

16、漏斗排出。3. 彈打式適用于離心管、小試管內(nèi)溶液較多不易作振搖時(shí)的混勻。 在離心管中混合液體時(shí)， 可由一手持離心管上端， 另一手手指輕撥試管底部， 使管內(nèi)液 體作旋轉(zhuǎn)流動(dòng)；也可用一手拇指和食指持管的上端，用其余3 個(gè)手指彈動(dòng)離心管、小試管。4. 振搖式 適用試管內(nèi)少量液體的混勻。5. 倒轉(zhuǎn)式 適用于具塞試管內(nèi)有較多液體時(shí)以及容量瓶?jī)?nèi)液體的混勻。二、溶液的過濾 常用的溶液過濾的方法有以下幾種：1. 普通漏斗過濾此法最為簡(jiǎn)便和常用。 過濾時(shí)先將濾紙對(duì)折疊成四層， 放在漏斗中， 濾紙的上緣應(yīng)略低 于漏斗邊緣并與漏斗壁完全吻合， 不留縫隙。 向漏斗內(nèi)加液時(shí)， 要用玻棒引導(dǎo)不能過快倒入， 液面不能超過濾

17、紙的上緣。2. 布氏漏斗抽濾此法可加速過濾， 并使沉淀抽吸得較枯燥。 但不宜過濾膠體沉淀和顆粒太小的沉淀， 為膠體沉淀易穿透濾紙，顆粒太小的沉淀易在濾紙上形成一層密實(shí)的沉淀，溶液不易透過。過濾時(shí)用循環(huán)水真空泵使吸濾瓶?jī)?nèi)減壓， 由于瓶?jī)?nèi)與布氏漏斗液面上形成壓力差， 因而加快了過濾速度。第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)樣品的制備在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中， 無(wú)論是分析組織中各種物質(zhì)含量或是探究組織中物質(zhì)代謝過程， 都 需要利用特定生物樣品。 由于實(shí)驗(yàn)的特殊要求， 往往需要將獲得的樣品先作適當(dāng)處理。 掌握 實(shí)驗(yàn)樣品的正確處理與制備方法是做好生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的先決條件。一、血液樣品1. 全血 實(shí)驗(yàn)用的全血是指抗凝全血。 取清潔枯燥的試

18、管或其他容器， 收集人或動(dòng)物的新鮮血液， 立即與適量的抗凝劑充分混合。取得的全血如不立即使用，應(yīng)置冰箱中儲(chǔ)存。常用的抗凝劑有檸檬酸鹽、草酸鹽、氟化鈉、肝素等，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而定。通常先將抗凝劑配成水溶液，按所取血量需要加到試管或其他適宜的容器中，橫放，在100 C以下烘干肝素不宜超過 300C,那么抗凝劑在管壁上形成一層薄膜，使用時(shí)較為方便，效果也好。2. 血漿抗凝全血經(jīng)離心機(jī)離心， 那么血細(xì)胞下沉， 上清液即為血漿。 用血漿分析必須嚴(yán)格防止溶 血，故在采血時(shí)所用的取血容器包括注射器、 針頭與試管必須枯燥、清潔。 取出血液也不能 劇烈振搖，最好使用一次性注射器與試管，可防止醫(yī)院內(nèi)感染和有利于廢

19、物的處理。3. 血清收集不加抗凝劑的血液， 在室溫下自行凝固， 通常經(jīng) 3 小時(shí)后血塊收縮析出血清。 為促 使血清別離，可離心別離，這樣可縮短時(shí)間，并取得較多的血清。制備血清也要防止溶血， 一方面器具要枯燥，另一方面，血塊收縮后，及早別離出血清，因?yàn)榉胖眠^久，血塊中的血 細(xì)胞可能溶血。4. 無(wú)蛋白血濾液許多生物化學(xué)分析需防止蛋白質(zhì)的干擾， 常用蛋白質(zhì)沉淀劑將其中的蛋白質(zhì)去除， 制成 無(wú)蛋白血濾液，再進(jìn)行分析。如尿酸、肌酸等物質(zhì)的測(cè)定。常用的蛋白質(zhì)沉淀劑有：鎢酸、 三氯醋酸、硫酸鋅及高氯酸等，可根據(jù)不同的需要而加以選擇。、尿液樣本24 小時(shí)尿液對(duì)尿液標(biāo)本進(jìn)行分析一般定性實(shí)驗(yàn)只需收集一次尿液，但定

20、量實(shí)驗(yàn)應(yīng)收集 混合后取樣。 24 小時(shí)尿液收集的方法通常在早晨一定時(shí)間排出剩余尿棄去，以后每次尿都 收集于清潔有蓋容器中，到第二天早晨同一時(shí)間收集最后一次尿即為 24 小時(shí)尿。為防止尿液變質(zhì)，須參加不影響實(shí)驗(yàn)的防腐劑，防腐劑應(yīng)在收集第一次尿時(shí)同時(shí)參加。 常用的防腐劑有甲苯、鹽酸等，用量為 5ml/L 。尿液樣本收集后應(yīng)立即分析，如不能及時(shí)分析，應(yīng)將留取的尿液置40°C冰箱中保存。三、組織樣本離體不久的組織，在適宜的溫度及PH等條件下，可以進(jìn)行一定程度的新陳代謝。 因此， 在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中， 常利用離體組織研究各種物質(zhì)代謝的途徑與酶系的作用，也可以從組織中提取各種代謝物或酶進(jìn)行研究。1

21、. 組織勻漿 新鮮組織稱取重量后剪碎，參加適當(dāng)?shù)膭驖{制備液，用高速電動(dòng)勻漿器 或用玻璃勻漿器打碎組織制成組織勻漿。常用的勻漿制備液有生理鹽水、緩沖液、 Krebs-Ringer 氏溶液及 0.25M 蔗糖等，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同要求，加以選擇。2. 組織浸出液 將上法制成的組織勻漿離心，其上清液即為組織浸出液。第五節(jié) 生物化學(xué)常用緩沖液一、常用緩沖液由一定物質(zhì)所組成的溶液， 在參加一定量的酸或堿時(shí)， 其氫離子濃度幾乎不變， 此種溶 液稱為緩沖溶液， 這種作用稱為緩沖作用， 其溶液內(nèi)所含物質(zhì)稱為緩沖劑。 緩沖溶液通常是 一種弱酸及其共軛基團(tuán)的混合物。生物化學(xué)常用緩沖液有以下幾種：1. 磷酸鹽緩沖液磷

22、酸鹽H2PO4和HP02-是生物化學(xué)研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由于它們是二級(jí)解離，有2個(gè)pKa值，所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬。酸性緩沖液：用 H2P04-, pH值為14。中性緩沖液：用混合的兩種磷酸鹽，pH值為68。堿性緩沖液：用 HPQ2-, pH值為1012。磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：容易配制成各種濃度的緩沖液；適用的pH范圍寬；pH受溫度的影響小；緩沖液稀釋后pH變化小，如稀釋10倍后pH的變化小于0.1。其缺點(diǎn)為：易與常見的鈣Ca2+、Mg+離子以及重金屬離子締合生成沉淀；會(huì)抑制某些生物化學(xué)過程，如對(duì)某些酶的催化會(huì)產(chǎn)生某種程度的抑制作用。2 Tris 緩沖液Tris緩沖液在

23、生物化學(xué)研究中多用于電泳緩沖液。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中都使用Tris 緩沖液，而很少再用磷酸鹽緩沖液。Tris緩沖液的常用有效pH范圍是在“中性范圍，例如：TrisHCI緩沖液：pH 值為7.58.5Tris-磷酸鹽緩沖液：pH 值為5.O9.0TrisHCI緩沖液的優(yōu)點(diǎn)是：因?yàn)門ris的堿性較強(qiáng)，所以可以只用這一種緩沖體系,配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液；對(duì)生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。其缺點(diǎn)是：緩沖液的pH值受溶液濃度影響較大，緩沖液稀釋10倍，pH值的變化大于0.1 ;溫度效應(yīng)大，溫度變化對(duì)緩沖液pH值的影響很大，例如：4C時(shí)緩沖液的pH

24、值為8.4，貝U 37C時(shí)的pH值為7.4，所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的 Tris HCI緩沖液不能低于04C;易吸收空氣中的 CQ,所以配制的緩沖液要蓋嚴(yán)密封； 此緩 沖液對(duì)某些 pH 電極發(fā)生一定的干擾作用，所以要使用與 Tris 溶液具有兼容性的電極。3有機(jī)酸緩沖液這一類緩沖液多數(shù)是用羧酸與它們的鹽配制而成，pH值范圍為酸性，即pH值為3.06.0 ，最常用的是甲酸甲酸鹽緩沖液、乙酸乙酸鈉和檸檬酸檸檬酸鈉緩沖體系。有機(jī)酸緩沖液的缺點(diǎn)是：所有這些羧酸都是天然的代謝產(chǎn)物，因而對(duì)生化反響過程可能發(fā)生干擾作用；檸檬酸鹽和琥珀酸鹽可以和過渡金屬離子Fe3+、Zn2+、Mg+等結(jié)合而

25、使2+ 2+緩沖液受到干擾；這類緩沖液易與Ca離子結(jié)合，所以樣品中有Ca離子時(shí)，不能用這類緩沖液。4 硼酸鹽緩沖液常用的有效pH范圍是：pH值為8.510.0，因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其 優(yōu)點(diǎn)是配制方便， 只使用一種試劑， 缺點(diǎn)是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡(luò)合物， 尤其是能與糖類 的羥基反響生成穩(wěn)定的復(fù)合物而使緩沖液受到干擾。5 氨基酸緩沖液此緩沖液使用的范圍寬，可用于 pH值為2.011.0，最常用的有甘氨酸一 HCI緩沖液： pH值為2.05.0 ;甘氨酸一NaOHg沖液：pH值為8.011.0 ;甘氨酸-Tris 緩沖液：pH值 為 8.011.0。此類緩沖體系的優(yōu)點(diǎn)是： 為細(xì)胞組分

26、和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。 其缺點(diǎn)是 與羧酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會(huì)干擾某些生物化學(xué)反響過程；試劑的價(jià)格較高。二、緩沖溶液的選擇選擇緩沖液時(shí)， 要了解它的使用范圍。 枸櫞酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液很容易形成難溶 的二價(jià)陽(yáng)離子復(fù)合物，磷酸鹽可作為底物、某些酶的抑制劑或活化劑。這2種緩沖液都具有陽(yáng)離子，如Na+或Ko Tris常常對(duì)生物體有毒，其具有高度脂溶性，能從完整細(xì)胞和別離的 細(xì)胞器中穿過，使電子傳遞解偶聯(lián)。 此外，Tris容易受溫度影響，當(dāng)溫度從4C升到37C時(shí)， 其川的濃度增加10倍。用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的理想緩沖劑應(yīng)具有以下特點(diǎn)：不能透過生物膜；具有生物學(xué)穩(wěn)定性，且不干擾新陳代謝和

27、生物學(xué)過程； 對(duì)紫外線和可見光無(wú)明顯吸收； 離子成分或鹽濃 度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響較小；溫度對(duì)其pH的影響極小。選擇了適宜的緩沖液后，需要將溶液調(diào)節(jié)到所需要的 pH,必須考慮2個(gè)因素：到達(dá)準(zhǔn)確pH所需酸和共軛堿的比例；緩沖液的需要量，緩沖能力依賴于酸和堿的絕對(duì)數(shù)量及其相對(duì) 比例。對(duì)于傳統(tǒng)的緩沖液, 習(xí)慣上采用把酸性和堿性母液按比例混合的方法得到所需的pHo 對(duì)于具有兩性離子的酸來說, 通常是把它先參加到水中, 然后參加一定量的強(qiáng)堿或強(qiáng)酸調(diào)解 pH 到所需。也可以通過滴加酸或堿，用 pH計(jì)檢測(cè)pH,直到pH準(zhǔn)確為止。三、pH值的測(cè)定測(cè)定溶液pH值通常有兩種方法。1 pH 試紙法最簡(jiǎn)便但較粗略的方法是用

28、pH試紙，其分為廣泛和精密 pH試紙兩種。廣泛 pH試紙的 變色范圍是pH值為114、68、914等，只能粗略確定溶液的 pH值。另一種是精密 PH 試紙，可以較精確地測(cè)定溶液的pH值，其變色范圍是 23個(gè)PH單位并可以通過不同指示劑進(jìn)行比對(duì)，例如有 pH值為4.07.0、8.010.0等多種，可根據(jù)待測(cè)溶液的酸、堿性選 用某一范圍的試紙。測(cè)定的方法是將試紙條剪成小塊，用鑷子夾一小塊試紙不可用手拿.以免污染試紙 ,用玻璃棒蘸少許溶液與試紙接觸,試紙變色后與色階板對(duì)照,估讀出所測(cè)pH值。切不可將試紙直接放入溶液中，以免污染樣品溶液。也可將試紙塊放在白色點(diǎn)滴板上觀察和估測(cè)試紙要存放在有蓋的容器中，

29、以免受到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各種氣體的污染。2 pH 計(jì)法精確測(cè)定溶液pH值要使用pH計(jì)，其精確度可達(dá) 0.005個(gè)pH單位，關(guān)鍵是要正確選用和校對(duì)pH電極。過去是使用兩個(gè)電極，即玻璃電極和參比電極，目前已被淘汰，被兩種電下端玻璃泡處有保極合一的復(fù)合電極所代替， 即將它們共同組裝在一根玻璃管或塑料管內(nèi)，護(hù)罩，使用十分方便，尤其是便于測(cè)定少量液體的pH 值。使用時(shí)應(yīng)注意：(1) 經(jīng)常檢查電極內(nèi)的 4molL KCl 溶液的液面，如液面過低那么應(yīng)補(bǔ)充4mol L 的 KCl溶液。(2) 玻璃泡極易破碎，使用時(shí)必須極為小心。(3) 復(fù)合電極長(zhǎng)期不用，可浸泡在2 mol / L的KCI溶液中，平時(shí)可浸泡在無(wú)離子水

30、或緩沖溶液中， 使用時(shí)取出， 用蒸餾水沖洗玻璃泡局部，然后用吸水紙吸干余水，將電極浸入待 測(cè)溶液中，稍加攪拌，讀數(shù)時(shí)電極應(yīng)靜止不動(dòng)，以免數(shù)字跳動(dòng)不穩(wěn)定，(4) 使用時(shí)復(fù)合電極的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。(5) 使用前要用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正電極，常用的 3 種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液 pH 值 400、688 和9. 23(20 C)，精度為士 0. 002 pH單位。校正時(shí)先將電極放入6. 88的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，用pH計(jì)上的“標(biāo)準(zhǔn)旋鈕校正pH讀數(shù)，然后取出電極洗凈，再放人pH值為4. 00或9. 23的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，用“斜率旋鈕校正pH讀數(shù)，如此反復(fù)屢次，直至二點(diǎn)校正正確，再用第三種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液檢查?，F(xiàn)在，

31、有的pH計(jì)可以自動(dòng)校正，按“ yes 確定即可，標(biāo)準(zhǔn)緩沖液不用時(shí)應(yīng)冷藏。(6) 電極的玻璃泡容易被污染。假設(shè)測(cè)定濃蛋白質(zhì)溶液的pH值時(shí)，玻璃泡外表會(huì)覆蓋一層蛋白質(zhì)膜，不易洗凈而干擾測(cè)定，此時(shí)可用0.1 mol/L 的HCI和I mg /ml胃蛋白酶溶液浸泡過夜。假設(shè)被油脂污染，可用丙酮浸泡。假設(shè)電極保存時(shí)間過長(zhǎng)，校正數(shù)值不準(zhǔn)時(shí)，可將電極放入2 mol /L的KCI溶液中，40C加熱1 h以上，進(jìn)行電極活化。(7) 溶液 pH 值取決于溶液中的離子活度而不是濃度，只有在很稀的溶液中，離子的活度才與其濃度相等。 生化實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常配制比使用濃度高 10倍的“貯液 ，使用時(shí)再稀釋到所需 濃度，由于濃度變

32、化很大，溶液pH會(huì)有變化，因而，稀釋后仍需對(duì)其pH進(jìn)行調(diào)整。(8) 有的緩沖液(如“ Tris )的pH值受溫度影響很大，所以配制和使用都要在同一溫 度下進(jìn)行。第六節(jié) 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器的使用一、移液槍移液槍在生化實(shí)驗(yàn)中大量被使用， 它們主要用于量取少量或微量的液體， 可屢次重復(fù)地快速定量移液，并只用 1只手操作，十分方便。移液的準(zhǔn)確度 (即容量誤差 )為±( 0.5-1.5 %，移液的精密度即重復(fù)性誤差更小些，w 0.5 %。移液槍可分為2種：一種是固定容量的，常用的有100 d等多種規(guī)格。每種移液槍都有其專用的聚丙烯塑料槍頭吸頭，槍頭通常是一次性使用，當(dāng)然也可以超聲清洗后重復(fù)

33、使用，此種槍頭還可以進(jìn)行 121 C高溫、高壓滅菌。另一種是可調(diào)容量的移液槍，常用的有222 d、022 d和1222 d等幾種。IF圖2 2 可調(diào)移液器移液槍A :按鈕拇指鈕B :把手 C:手柄 D:按鈕桿E:卸尖器 F:顯示窗 G:卸尖器環(huán)H :吸頭注：推動(dòng)按鈕內(nèi)部的活塞分2段行程：第一檔為吸液，第二檔為放液，手感十分清楚。一移液槍的操作方法1. 量程的調(diào)節(jié)在調(diào)節(jié)量程時(shí)，用拇指和食指旋轉(zhuǎn)移液槍上部的旋鈕，使數(shù)字窗口出現(xiàn)所需容量體積的數(shù)字。如果要從大體積調(diào)為小體積，那么按照正常的調(diào)節(jié)方法，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)旋鈕即可；但如果 要從小體積調(diào)為大體積時(shí)，那么可先順時(shí)針旋轉(zhuǎn)刻度旋鈕至超過量程的刻度，再回調(diào)至

34、設(shè)定體積，這樣可以保證量取的最高精確度。在該過程中，不可將旋鈕旋出量程，否那么會(huì)卡住內(nèi)部機(jī)械裝置而損壞了移液槍。2. 槍頭的裝配在將槍頭套上移液槍時(shí)，不可用力太大，因?yàn)檫@樣會(huì)導(dǎo)致移液槍的內(nèi)部配件如彈簧因敲擊產(chǎn)生的瞬時(shí)撞擊力而變得松散，甚至?xí)?dǎo)致刻度調(diào)節(jié)旋鈕卡住。正確的方法是將移液槍器垂直插入槍頭中，稍微用力及左右微微轉(zhuǎn)動(dòng)即可使其緊密結(jié)合。如果是多道如8道或12道移液槍，那么可以將移液槍的第一道對(duì)準(zhǔn)第一個(gè)槍頭，然后傾斜地插入，往前前方向搖 動(dòng)即可卡緊。槍頭卡緊的標(biāo)志是略為超過O型環(huán)，并可以看到連接局部形成清晰的密封圈。3. 移液移液之前，要保證移液槍、槍頭和液體處于相同溫度。四指并攏，握住移液槍

35、上部，并 使移液槍保持豎直狀態(tài)， 然后用拇指按住柱塞桿頂端的按鈕， 向下按到第一停點(diǎn)， 將移液槍 的槍頭插入待取溶液中， 緩慢松開按鈕， 吸上液體， 并停留秒 1-2粘性大的溶液可加長(zhǎng)停留 時(shí)間 ，將槍頭沿器壁滑出容器， 用吸水紙擦去吸頭外表可能附著的液體， 排液 時(shí)槍頭接觸 傾斜的器壁，先將按鈕按到第一停點(diǎn)，停留 秒 1 粘性大的液體要加長(zhǎng)停留時(shí)間 ，再按壓到 第二停點(diǎn)， 吹出槍頭尖部的剩余溶液，如果不便于用手取下槍頭， 可按下除槍頭推桿， 將槍 頭推入廢物缸。在吸液之前，可以先吸放幾次液體以潤(rùn)濕槍頭 尤其是要吸取粘稠或密度與 水不同的液體時(shí) 。4. 放置使用完畢， 把移液槍的量程調(diào)至最大值

36、刻度， 使彈簧處于松弛狀態(tài)，以保護(hù)彈簧。 然后 豎直掛在移液槍架上。 當(dāng)移液槍槍頭里有液體時(shí)， 切勿將移液槍水平放置或倒置， 以免液體 倒流，腐蝕活塞彈簧。二移液槍的維護(hù)保養(yǎng)1. 定期清洗移液槍可以先用肥皂水或 60%異丙醇清洗， 然后再用蒸餾水清洗， 自然晾干。 每天開始工作時(shí)， 檢查移液槍外表 尤其是槍頭 管嘴連件局部 是否有灰塵和污跡， 建議用 70%乙醇擦拭， 確 保清潔。如果移液槍每天都需要使用，那么建議每3個(gè)月清潔并校準(zhǔn) 1次?？砂凑f明書拆開移液槍，檢查并擦拭灰塵和污跡。只能用70%乙醇擦拭，管嘴連件和推出器可浸泡在乙醇中過夜。活塞、C形環(huán)和彈簧涂上硅油后裝上，并復(fù)原移液槍。2.

37、高溫、高壓消毒管嘴在121 C高溫、高壓20min后，放置在常溫或烘箱中，待水氣蒸發(fā)后再使用。整支Focus 和Digital移液槍、Freshma n和彩色移液槍的管嘴連件，以及電子移液槍的管嘴連件，也按 121 C高溫、高壓20min的條件消毒。消毒后的移液槍必須放置在室溫2小時(shí)前方可使用，并且需要進(jìn)行校準(zhǔn)。、3. 校準(zhǔn)在20-25 C環(huán)境下，通過重復(fù)幾次秤量蒸餾水的方法進(jìn)行。用分析天平稱量所取純水的重量并進(jìn)行計(jì)算，來校正移液槍，1ml蒸餾水20 C時(shí)重0.9982g。4. 漏液的檢查使用時(shí)要檢查是否有漏液現(xiàn)象， 方法是吸取液體后懸空垂直放置數(shù)秒鐘， 看看液面是否下降。如果漏液，原因大致有

38、以下幾方面：槍頭不匹配，彈簧活塞老化，液體易揮發(fā)。如果是最后一種情況，可以先吸放數(shù)次液體，然后再移液。三移液槍使用考前須知1 吸取液體時(shí)一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，絕不允許突然松開，以防溶液吸入過快而 沖入移液槍內(nèi)腐蝕柱塞，而造成漏氣。2濃度和粘度大的液體，會(huì)產(chǎn)生誤差。為消除其誤差的補(bǔ)償量，可由試驗(yàn)確定，補(bǔ)償 量可通過調(diào)節(jié)旋鈕、改變讀數(shù)窗的讀數(shù)來進(jìn)行設(shè)定。3可用分析天平稱量所取純水的重量并進(jìn)行計(jì)算的方法，來校正取液器，1ml蒸餾水20C時(shí)重 0.9982g。4 在設(shè)置量程時(shí)，請(qǐng)注意旋轉(zhuǎn)到所需量程數(shù)字清清楚楚在顯示窗中，所設(shè)量程應(yīng)在移液器量程范圍內(nèi)，不要將旋鈕旋出量程，否那么會(huì)卡住機(jī)械裝置，損壞了

39、移液槍。5 嚴(yán)禁吸取有強(qiáng)揮發(fā)性、強(qiáng)腐蝕性的液體如濃酸、濃堿、有機(jī)物等。一般常用的移液槍只適用于量取水溶液，如生物緩沖液、培養(yǎng)液等。6 嚴(yán)禁使用移液槍吹打混勻液體。7不要用大量程的移液槍移取小體積的液體，以免影響準(zhǔn)確度。同時(shí)，如果需要移取 量程范圍以外較大量的液體，請(qǐng)使用吸管進(jìn)行操作。二、電熱恒溫水浴箱電熱恒溫水浴箱用于恒溫、加熱、消毒及蒸發(fā)等。常用的有2孔、4孔、6孔和8孔，工作溫度從室溫至100 C。 如圖圖2 3電熱恒溫水浴箱一使用方法1 關(guān)閉水浴箱底部外側(cè)的放水閥門，向水浴箱中注入蒸餾水至適當(dāng)?shù)纳疃取＜诱麴s水而不是自來水是為了防止水浴箱體 鋁板或銅板被侵蝕。2 將電源插頭接在插座上，合上

40、電閘。插座的粗孔必須安裝接地線。3將調(diào)溫旋鈕沿順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)至適當(dāng)溫度位置。4翻開電源開關(guān)，接通電源，紅燈亮，表示電爐絲通電開始加熱。5. 在恒溫過程中，當(dāng)溫度升到所需的溫度時(shí)，沿逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)調(diào)溫旋鈕至紅燈熄滅、綠燈亮為止。此后，紅綠燈就不斷熄、亮，表示恒溫控制發(fā)生作用。6調(diào)溫旋鈕刻度盤的數(shù)字并不表示恒溫水浴箱內(nèi)的溫度。隨時(shí)記錄調(diào)溫旋鈕在刻度盤上的位置與恒溫水浴箱內(nèi)溫度計(jì)指示的溫度的關(guān)系。在屢次使用、總結(jié)經(jīng)驗(yàn)的根底上， 可以比擬迅速地調(diào)節(jié)，得到需要控制的溫度。7使用完畢，關(guān)閉電源開關(guān)，拉下電閘，拔下插頭。&假設(shè)較長(zhǎng)時(shí)間不使用，應(yīng)將調(diào)溫旋鈕退回零位，并翻開放水閥門，放盡水浴箱內(nèi)的全 部

41、存水。二考前須知1 水浴箱內(nèi)的水位絕對(duì)不能低于電熱管，否那么電熱管將被燒壞。2控制箱內(nèi)部切勿受潮，以防漏電損壞。3. 初次使用時(shí)，應(yīng)參加與所需溫度相近的水后再通電，并防止水箱內(nèi)無(wú)水時(shí)接通電源。4使用過程中應(yīng)注意隨時(shí)蓋上水浴槽蓋，防止水箱內(nèi)水被蒸干。5 .調(diào)溫旋鈕刻度盤的刻度并不能精確表示水溫，實(shí)際水溫應(yīng)以溫度計(jì)讀數(shù)為準(zhǔn)。三、電動(dòng)離心機(jī)在實(shí)驗(yàn)過程中，欲使沉淀與母液分開，有過濾和離心2種方法。在下述情況下，使用離心方法較為適宜：沉淀有粘性；沉淀顆粒小，容易透過濾紙；沉淀量多而疏松；沉淀量少，需要定量測(cè)定；母液量很少，別離時(shí)應(yīng)減少損失；沉淀和母液必須迅速別離開；母液粘稠；一般膠體溶液。離心機(jī)是利用離

42、心力對(duì)混合物溶液進(jìn)行別離和沉淀的一種專用儀器。電動(dòng)離心機(jī)通常分為大、中、小3種類型。圖2 4 電動(dòng)離心機(jī)一離心原那么：1. 平衡：將一對(duì)離心管放入一對(duì)套管中，置于天平兩側(cè)，用滴管向較輕一側(cè)的離心管 與套管之間滴水至兩側(cè)平衡。2. 對(duì)稱：將已平衡好的對(duì)管置于離心機(jī)中的對(duì)稱位置。一使用方法 1離心前檢查：取出所有套管，起動(dòng)空載的離心機(jī)，觀察是否轉(zhuǎn)動(dòng)平穩(wěn)；檢查套管有 無(wú)軟墊，是否完好，內(nèi)部有無(wú)異物；離心管與套管是否匹配；檢查變速旋鈕是否在“0處。2離心時(shí)先將待離心的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到大小適宜的離心管內(nèi)，盛量占管的2/3 體積， 以免溢出。將此離心管放入外套管內(nèi)。3將1對(duì)外套管 連同離心管 放在臺(tái)秤上平衡，

43、如不平衡， 可用小吸管調(diào)整離心管內(nèi)容 物的量或向離心管與外套間參加平衡用水。 每次離心操作都必須嚴(yán)格做到， 否那么將會(huì)損壞離 心機(jī)部件，甚至造成嚴(yán)重事故，應(yīng)十分警惕。4將以上 2個(gè)平衡好的套管，按對(duì)稱位置放到離心機(jī)中，蓋嚴(yán)離心機(jī)蓋，并把不用的離心套管取出。5開動(dòng)時(shí)，先開電源開關(guān)，然后慢慢撥動(dòng)變速旋鈕，使速度逐漸加快。停止時(shí)，先將旋鈕撥到“ 0，不繼續(xù)使用時(shí)，拔下插頭。待離心機(jī)自動(dòng)停止后，才能翻開離心機(jī)蓋并取 出樣品，絕對(duì)不能用手阻止離心機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)。6用完后，將套管中的橡皮墊洗凈，保管好。沖洗外套管，倒立使其枯燥。 二考前須知1離心過程中，假設(shè)聽到特別響聲，說明離心管可能破碎，應(yīng)立即停止離心。如果管

44、已 破碎， 將玻璃渣沖洗干凈 玻璃渣不能倒入下水道 ，然后換管按上述操作重新離心； 假設(shè)管未 破碎，也需要重新平衡后再離心。2有機(jī)溶劑和酚等會(huì)腐蝕金屬套管，假設(shè)有滲漏現(xiàn)象，必須及時(shí)擦干凈漏出的溶液，并 更換套管。3. 防止連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間使用。 一般大離心機(jī)使用 40min后應(yīng)休息20min或30min ,臺(tái)式小離心 機(jī)使用40min后休息10min。4. 電源電壓與離心機(jī)所需的電壓一致，接地后才能通電使用。5. 應(yīng)不定期檢查離心機(jī)內(nèi)電動(dòng)機(jī)的電刷與轉(zhuǎn)子磨損情況，嚴(yán)重時(shí)更換電刷或軸承。四、紫外-可見分光光度計(jì)人們?cè)趯?shí)踐中早已總結(jié)出不同顏色的物質(zhì)具有不同的物理和化學(xué)性質(zhì)。根據(jù)物質(zhì)的這些特性可對(duì)其進(jìn)行有效

45、的分析和判別。1918年，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局制成了第一臺(tái)紫外-可見分光光度計(jì)。此后，紫外-可見分光光度計(jì)經(jīng)不斷改良，又出現(xiàn)自動(dòng)記錄、自動(dòng)打印、數(shù)字顯示、 微機(jī)控制等各種類型的儀器， 使分光光度法的靈敏度和準(zhǔn)確度不斷提高，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。目前，分光光度法已為工農(nóng)業(yè)各個(gè)部門和科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域廣泛采用，成為人們從事生產(chǎn)和科研的有力測(cè)試手段。 我國(guó)在分析化學(xué)領(lǐng)域有著堅(jiān)實(shí)的根底，在分光光度分析方法和儀器的制造方面都已到達(dá)一定的水平?，F(xiàn)以VU-9200型紫外可見分光光度計(jì)為例，介紹紫外-可見分光光度計(jì)的使用方法。圖2 5 紫外可見分光光度計(jì)一儀器各局部功能介紹1 樣品室門翻開門可放置樣品，關(guān)上門后才可以進(jìn)

46、行測(cè)量。2 顯示窗顯示測(cè)量值。在不同的功能下，可以分別顯示透射比、吸光度及濃度和錯(cuò)誤顯示。3.波長(zhǎng)顯示窗顯示當(dāng)前波長(zhǎng)值。4.波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)節(jié)波長(zhǎng)用，當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)旋鈕時(shí)，顯示窗的數(shù)字隨之改變。5.儀器電源開關(guān)。6.儀器操作鍵盤實(shí)現(xiàn)儀器測(cè)量及功能轉(zhuǎn)換。7.打印輸出口&RS232口 選配。9.換燈手柄。10.樣品池拉手11 .電源插座。12氘燈開關(guān)。(二) 操作步驟安裝好儀器后， 檢查樣池位置， 使其處在光路中 ( 拉動(dòng)拉手應(yīng)感到每檔的定位 )。關(guān)好樣 品室門， 翻開儀器電源開關(guān) (假設(shè)聯(lián)用打印機(jī)， 那么應(yīng)先開主機(jī)后再開打印機(jī) ) ，方式選擇指示燈 應(yīng)在透射比位置，工作曲線選擇點(diǎn)應(yīng)在第一點(diǎn)，顯

47、示器應(yīng)顯示為XX .X ，預(yù)熱 10 min ，即可以進(jìn)行測(cè)量。1. 透射比測(cè)量在樣品室中，放置空白及樣品 。(1) 按需要調(diào)節(jié)波長(zhǎng)旋鈕，使波長(zhǎng)顯示窗顯示所需波長(zhǎng)值。(2) 按 方式選擇 鍵使透射比指示燈亮，并使空白溶液處在光路中。(3) 按100環(huán)鍵調(diào)100%，待顯示器顯示100.0時(shí)即表示調(diào)好100T。(4) 翻開樣品室門在樣池架中放擋光板，關(guān)閉樣品室門，觀察顯示器是否為零，如不為22,那么按0環(huán)調(diào)零。(5) 取出擋光板，放入空白溶液，關(guān)好樣品室門，顯示器應(yīng)為 100.0，假設(shè)不為 100.0那么重 新調(diào)100勿(重復(fù))。(6) 拉動(dòng)樣品拉手使被測(cè)樣品依次進(jìn)入光路，那么顯示器上依次顯示樣品

48、的透射比值。2. 吸光度測(cè)量 吸光度測(cè)量與透射比根本相同，只是有一點(diǎn)要注意，按方式選擇鍵時(shí)，應(yīng)使吸光度ABS指示燈亮。(三) 使用比色皿時(shí)考前須知1 拿比色皿時(shí)，手指只能捏住比色皿毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。 2應(yīng)將比色皿的透光面對(duì)準(zhǔn)光路，切勿將毛玻璃面對(duì)著光路。3測(cè)定有色溶液吸光度時(shí)，一定要用有色溶液清洗比色皿內(nèi)壁幾次，以免改變有色溶 液的濃度。 在測(cè)定一系列溶液的吸光度時(shí)， 通常都按由稀到濃的濃度順序測(cè)定， 以減小測(cè)量 誤差。4清洗比色皿時(shí)，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。如比色皿被有機(jī)物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液 (體積比 1:2) 浸泡片刻， 再用水沖洗。 不能用堿溶

49、液或氧化性強(qiáng)的洗滌 液洗比色皿， 以免損壞； 也不能用毛刷清洗比色皿， 以免損傷它的透光面。 每次做完實(shí)驗(yàn)時(shí)， 應(yīng)立即洗凈比色皿。5比色皿外壁的水用擦鏡紙或細(xì)軟的吸水紙吸干，以保護(hù)透光面。第七節(jié)常用的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法一、分光光度法分光光度法是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析的一項(xiàng)技術(shù)。它具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、 快速等優(yōu)點(diǎn)，是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的實(shí)驗(yàn)方法。許多物質(zhì)的測(cè) 定都采用分光光度法。一原理光的本質(zhì)是一種電磁波，具有不同的波長(zhǎng)。肉眼可見的光稱為可見光， 波長(zhǎng)范圍在400 760nm波長(zhǎng)v 400 nm的光稱為紫外光，波長(zhǎng) 760 nm的光稱為紅外光?？梢姽鈪^(qū)的光因波 長(zhǎng)不

50、同而呈現(xiàn)不同的顏色，這些不同顏色的光稱為單色光。單色光并非單一波長(zhǎng)的光，而是一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光。 可見光區(qū)的單色光按波長(zhǎng)順序排列為：紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫。許多物質(zhì)的溶液具有顏色，有色溶液所呈現(xiàn)的顏色是由于溶液中的物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收所致。不同的物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同， 對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收能力也不同， 因此具有其 特有的吸收光譜。即使是相同的物質(zhì)由于其含量不同， 對(duì)光的吸收程度也不同。 利用物質(zhì)所 特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或利用物質(zhì)對(duì)一定波長(zhǎng)光的吸收程度來測(cè)定物質(zhì)含量的方法，稱為分光光度法。所使用的儀器稱為分光光度計(jì)。朗伯一比爾Lambert Beer定律是分光光度法的根本原理。當(dāng)一束單色

51、光通過一均勻的溶液時(shí)，一局部被吸收，一局部透過，設(shè)入射光的強(qiáng)度為10,透射光強(qiáng)度為I，那么丄1 0 為透光度，用T表示。當(dāng)溶液的液層厚度不變時(shí)，溶液的濃度越大，對(duì)光的吸收程度越大，那么透光度越小。即：-IgT =KC 式中K為吸光系數(shù)，C為濃度當(dāng)溶液濃度不變時(shí)，溶液的液層厚度越大，對(duì)光的吸收程度越大，那么透光度越小。即：- lg T = K “ L L為液層厚度將以上兩式合并可用下式表示:-IgT 二 K C L研究說明：溶液對(duì)光的吸收程度即吸光度A又稱消光度 E或光密度 0D與透光度T呈負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系，即A =lgT故A = KCL上式為朗伯一比爾定律，其意義為：當(dāng)一束單色光通過一均勻溶液時(shí)，溶

52、液對(duì)單色光的吸收程度與溶液濃度和液層厚度的乘積呈正比。朗伯一比爾定律常被用于測(cè)定有色溶液中物質(zhì)含量，其方法是配制濃度的標(biāo)準(zhǔn)液S，將待測(cè)液 T與標(biāo)準(zhǔn)液以同樣的方法顯色，然后放在厚度相同的比色皿中進(jìn)行比色，那么:測(cè)定其吸光度,得AS和 A，根據(jù)朗伯一比爾定律：AS=KsCs LsAt = KtCt Lt兩式相除得：ASKSCSLSATKT CT LT由于是同一類物質(zhì)其K值相同，又由于比色皿的厚度相等，所以Ks二Kt , Ls = 1AS _ CSATCTCtCsAs此即Lambert-Beer定律的應(yīng)用公式。二應(yīng)用利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定主要有以下幾種方法: 1 標(biāo)準(zhǔn)管法A值，然后按下式求

53、得待測(cè)溶將待測(cè)溶液與濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同條件下分別測(cè)定 液中物質(zhì)的含量。Ct 二學(xué) Cs2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法先配制一系列濃度由小到大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)定出它們的 A值，以A值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在測(cè)定待測(cè)溶液時(shí)，操作條件應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)相同，以待測(cè) 液的A值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該樣品的相應(yīng)濃度。3 吸收系數(shù)法當(dāng)某物質(zhì)溶液的濃度為 1mol/L，厚度為1cm時(shí)，溶液對(duì)某波長(zhǎng)的吸光度稱為該物質(zhì)的 摩爾吸光系數(shù)，以 £表示。£值可通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得，也可由手冊(cè)中查出。某物質(zhì)£值，只要測(cè)出其A值再根據(jù)下式便可求得樣品的濃度。722型分光光度計(jì)為例說明。(三) 分光光度

54、計(jì)分光光度計(jì)種類較多，其結(jié)構(gòu)根本相似，以圖2-6 722型分光光度計(jì)1 儀器的構(gòu)造(主要部件)(1) 光學(xué)系統(tǒng)采用光柵自準(zhǔn)式色散系統(tǒng)和單光束結(jié)構(gòu)光路，如圖27所示。(2) 儀器的結(jié)構(gòu)722型分光光度計(jì)的主要部件包括光源室、單色光器、試樣室、光電池暗盒、電子系統(tǒng)及數(shù)字顯色器等部件。 光源室部件 由鎢燈燈架、聚光鏡架、截止濾光片組架等部件組成。鎢燈燈架上裝 有鎢燈，作為可見區(qū)域的能量輻射源。 單色器部件是儀器的心臟局部，位于光源與試樣室之間。由狹縫部件、反光鏡組件、準(zhǔn)直鏡部件、光柵部件與波長(zhǎng)線性傳動(dòng)機(jī)構(gòu)等組成。在這里使光源室來的白光變成單色光。 試樣室部件 由比色皿座架部件及光門部件組成。A值或T

55、、c值。 光電管暗盒部件 由光電管及微電流放大器電路板等部件組成。由試樣室出來的光經(jīng) 光電轉(zhuǎn)換并放大后，在數(shù)字顯示器上直接顯示出測(cè)定液的圖2-7 722型光柵分光光度計(jì)外觀示意圖1. 數(shù)字顯示器；2吸光度調(diào)零旋鈕消光零；3選擇開關(guān)；4.吸光度調(diào)斜率電位器；5.濃度旋鈕；6.光源室；7.電源開關(guān)；8.波長(zhǎng)旋鈕；9.波長(zhǎng)刻度窗；10.試樣架拉手;11. 100%T旋鈕；12. 0%T旋鈕0旋鈕；13.靈敏度調(diào)節(jié)旋鈕；14.枯燥器2.工作過程如圖2-7所示：由鎢燈發(fā)出的連續(xù)輻射光經(jīng)濾色片選擇及聚光鏡聚光后經(jīng)入射光狹縫進(jìn)入單色光器，進(jìn)入單色光器的復(fù)合光通過平面反射鏡反射及準(zhǔn)直鏡準(zhǔn)直變成平行光射向色散元件光柵，光柵將入射的復(fù)合光通過衍射作用形成按照一定順序均勻排列的連續(xù)單色光譜，此單色光重新回到準(zhǔn)直鏡上，由于儀器出射狹縫設(shè)置在準(zhǔn)直鏡的焦面上，這樣從光柵色散出來的光譜經(jīng)準(zhǔn)直鏡后利用聚光原理