SDS聚丙烯酰胺凝..

1、一、實驗目的 了解電泳實驗原理 掌握電泳實驗操作規(guī)程 學習用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)及測定蛋白質(zhì)相對分子量的原理與技術(shù)二、電泳的基本原理電泳的基本原理 電泳是指帶電顆粒在電場的作用下電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或

2、提純的技術(shù)。三、電泳的分類三、電泳的分類 從原理上：移界電泳（自由流電泳等），區(qū)帶電泳（SDS-PAGE等），穩(wěn)態(tài)電泳（等速電泳，等電聚焦（IEF）等），雙向電泳等。 凝膠系統(tǒng)的均勻性：連續(xù)性凝膠電泳，不連續(xù)凝膠電泳 按外形：圓盤狀電泳，水平板電泳，垂直板電泳及毛細管電泳等。 被分離的物質(zhì)是否變性：非變性、變性（） 從載體上：自由流電泳，凝膠電泳，瓊脂糖電泳，紙電泳等。：等電聚焦電泳等電聚焦電泳：SDS-PAGE 雙向電泳后的凝膠雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖：分布圖： 水平方向反映出蛋白水平方向反映出蛋白在在pI上的差異，上的差異，垂直方向反映出它們在垂直方向

3、反映出它們在分子量上的差別分子量上的差別。第一向電第一向電泳：等電泳：等電聚焦電泳聚焦電泳聚焦后凝聚焦后凝膠放置在膠放置在SDS凝膠凝膠上，進行上，進行第二向電第二向電泳泳第二向電泳：第二向電泳：SDS-PAGE分子量大分子量大分子分子量小量小pH9pH3pH9pH3大腸桿菌全蛋白提取液雙向電泳凝膠染色后照片大腸桿菌全蛋白提取液雙向電泳凝膠染色后照片四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 1. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的特點 （1）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的支持介質(zhì)是聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯丙烯酰胺酰胺(CH2=CHCONH2簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-N,N-甲叉雙甲叉雙丙烯酰

4、胺丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺四甲基乙二胺(簡稱TEMEDTEMED)和催催化劑過硫酸銨化劑過硫酸銨 (簡稱APAP)或核黃素核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠（其網(wǎng)孔大小可由凝膠濃度和交聯(lián)度加以調(diào)節(jié)） ，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGEPAGE)。常用于蛋白質(zhì)的定性分析，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量。 （2）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統(tǒng)，即只有分離膠的連續(xù)系統(tǒng)和有濃縮膠與分離膠的不連續(xù)系統(tǒng)。 （3）強還原劑可

5、以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵， SDS與蛋白質(zhì)充分定量結(jié)合（平均每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子,重量比約為1：1.4），以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)，消除了各種蛋白質(zhì)本身電荷上的差異，從而使蛋白質(zhì)電泳的速度只與蛋白質(zhì)的分子量相關(guān)，而與蛋白質(zhì)本身所帶電荷無關(guān)。（4）由于具有濃縮效應、分子篩效應和電荷效應，使被分離物質(zhì)在電泳時產(chǎn)生不同的泳動速率而相互分離。圖4 電泳過程示意圖A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。 C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。（5）最后再利用特異性的顏色反應使蛋白質(zhì)著色，這樣就可

6、在凝膠中展現(xiàn)出蛋白質(zhì)條帶。2.蛋白質(zhì)分子量測定原理 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳還可以用于未知蛋白分子量的測定，在同一凝膠上對一系列已知分子量的標準蛋白及未知蛋白進行電泳，測定各個的標準蛋白的電泳距離（或遷移率），并對各自分子量的對數(shù)（log MW）作圖，即得到標準曲線。測定未知蛋白質(zhì)的電泳距離（或遷移率），通過標準曲線就可以求出未知蛋白的分子量。 lg m=lg m0-KrT lg Rf=lg r0-KrT m和Rf是聚丙烯酰胺濃度為T%時的遷移率和相對遷移率。 m0和r0是假設(shè)當凝膠濃度T為0%時的自由遷移率和自由相對遷移率。直線的斜率為阻滯系數(shù)。Kr與凝膠系統(tǒng)的交聯(lián)度、分子的形狀和分子質(zhì)量有

7、關(guān)。 遷移率（或泳動度）是指帶電顆粒在單位電場強度下泳動的速度，可用下列公式計算： =/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt 為遷移率（cm2V-1min-1）；為顆粒泳動速度（cms-1）；E 為電場強度（ Vcm-1）；d 為顆粒泳動的距離（cm）；l為濾紙有效長度（cm）；V為實際電壓（V）；t為通電時間（s或min）。通過測量d, l, V, t, 即可計算出被分離物質(zhì)的遷移率。 在確定的條件下，某物質(zhì)的遷移率為常數(shù)，是該物質(zhì)的化學特征常數(shù) 由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是成比例結(jié)合的，因此 lg mw=K-bX 兔磷酸化酶兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 M

8、W=66,200 兔肌動蛋白兔肌動蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑 MW=20,100 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 MW=14,400 標準分子量圖1 標準蛋白質(zhì)與待測樣品電泳圖譜 圖2 電泳遷移率與logMW之間的關(guān)系，其公式為log MW =K-bX 94 00062 00043 00031 00020 10014 400膠槽膠槽123注：膠槽1 標準蛋白；膠槽2、3 樣品蛋白得到同行專家贊3.樣品、儀器設(shè)備及試劑 （一）樣品：透析的細胞色素C及純化后的細胞色素C。 （二）儀器設(shè)備： 恒流恒壓電泳儀及配套電泳槽； 冷凍離心機及離

9、心管； 制冰機； pH計； 真空機； 6取樣器； 7. 進樣器實驗流程實驗流程分離膠的制備分離膠的制備濃縮膠的制備濃縮膠的制備 加樣加樣 待分離樣品的制備待分離樣品的制備 電泳電泳剝膠剝膠 固定染色、洗脫固定染色、洗脫 準備儀器，配制試劑準備儀器，配制試劑4.實驗步驟 1.準備儀器設(shè)備 2.配制試劑 3.樣品處理 4.制備分離膠 5.制備濃縮膠 6.上樣 7.電泳 8.染色 9.脫色 10.測量結(jié)果（1 1）準備儀器設(shè)備）準備儀器設(shè)備 1.1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, , 準備準備2 2個干凈的個干凈的錐形瓶錐形瓶. .2.2.把玻璃板在灌膠支架上固定好把玻璃板在灌膠

10、支架上固定好. .固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板壞玻璃板. .（2）.配制試劑 1. 貯備液及工作溶液； 2.染色液； 3. 0.1的溴酚藍水溶液；貯備液及工作溶液 1. 30%凝膠貯液 2. 分離膠buffer 3. 濃縮膠buffer 4. 電極緩沖液 5. 上樣緩沖液 6. 10%的AP30%凝膠貯液 29.2g 丙烯酰胺丙烯酰胺Acrylamide, 0.8g 甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺Bisacrylamide, 加蒸餾水定容到加蒸餾水定容到100ml. 73g 丙烯酰胺丙烯酰胺Acrylamide, 2g 甲叉雙丙烯酰胺甲

11、叉雙丙烯酰胺Bisacrylamide, 加蒸餾水定容到加蒸餾水定容到250ml. 每大組1份濃縮膠buffer 每大組1份分離膠buffer每大組1份上樣緩沖液每大組1份Tris-甘氨酸電極緩沖液（1L） 25mM Tris，3g 250mM 甘氨酸,14.4g (pH 8.3) 0.1% SDS,1g 每兩小組1份固定液配方 40%甲醇 10%乙酸 50%水 每小組50ml10% Ammonium persulfate(fresh).4.8%濃縮膠（5ml） 30%凝膠貯液 0.8ml 濃縮膠Buffer 1.25ml 蒸餾水 2.95ml AP 20ul TEMED 5ul 每小組1份分

12、離膠(15ml) 30%凝膠貯液5.75ml 分離膠Buffer 3.75ml 蒸餾水5.5ml AP 40ul TEMED 10ul 每小組1份考馬斯亮藍G-250 50g硫酸胺 0.6gG-250 58ml磷酸 定容到400ml 再加100ml甲醇 每大組1份（3）.樣品處理 A、標準蛋白質(zhì)樣品、標準蛋白質(zhì)樣品marker B、用樣品緩沖液配制、用樣品緩沖液配制1mg/ml的純化蛋白質(zhì)樣品的純化蛋白質(zhì)樣品 C、制備復雜樣品、制備復雜樣品 取葉片取葉片1g，加，加5ml樣品緩沖液研磨，過濾，樣品緩沖液研磨，過濾，12000rpm離心離心10min,取上清，備用。取上清，備用。將樣品將樣品A、

13、B、C都的沸水中加熱都的沸水中加熱10min,再置再置12000rpm離心離心10min,取上清，備用。取上清，備用。（4）制備分離膠 按比例配好分離膠按比例配好分離膠, ,用移液管快速加入用移液管快速加入, ,大約大約5 5厘厘米左右米左右, ,之后加少許蒸餾水之后加少許蒸餾水, ,靜置靜置4040分鐘分鐘. .凝膠配制過程要迅速凝膠配制過程要迅速, , 催化劑催化劑TEMEDTEMED要在注膠要在注膠前再加入前再加入, ,否則凝結(jié)無法注膠否則凝結(jié)無法注膠. .注膠過程最好一注膠過程最好一次性完成次性完成, ,避免產(chǎn)生氣泡避免產(chǎn)生氣泡. .水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排水封的目的是為

14、了使分離膠上延平直，并排除氣泡除氣泡凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面的界面. .（5 5）制備濃縮膠）制備濃縮膠倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干, ,按比例配按比例配好濃縮膠好濃縮膠, ,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm5mm處處, ,迅迅速插入樣梳速插入樣梳, ,靜置靜置4040分鐘分鐘. . 樣梳需一次平穩(wěn)插入樣梳需一次平穩(wěn)插入, ,梳口處不得有氣泡梳口處不得有氣泡, ,梳底梳底需水平需水平. .（6 6）加樣）加樣拔出樣梳后拔出樣梳后, ,在上槽內(nèi)加入緩沖液在上槽內(nèi)加入緩沖液, ,沒過

15、鋸齒時可取下梳子沒過鋸齒時可取下梳子. . 要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出, ,否則會影響加樣效果否則會影響加樣效果. .加樣三個：加樣三個： A A、5l標準蛋白溶解液標準蛋白溶解液B、 5l純化標準樣品純化標準樣品C、制備的復雜樣品、制備的復雜樣品10l用微量注射器距槽底三分之一處進樣用微量注射器距槽底三分之一處進樣, ,加樣前加樣前, ,樣品在樣品在 沸水中加熱沸水中加熱3 3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。 注射器不可過低注射器不可過低, ,以防刺破膠體以防刺破膠體, ,也不可過高也不可過高, ,在樣下在樣下 沉時會發(fā)生擴散沉時會發(fā)生擴散. . 為避免

16、邊緣效應為避免邊緣效應, ,最好選用中部的孔注樣最好選用中部的孔注樣. .（7）電泳 A、濃縮膠15mA/膠 B、分離膠25mA/膠 到距離底部5mm處停止，取出膠(8)固定染色與脫色 加固定液固定0.5h 水洗3次，每次15min 加染色液染色6h或過夜 水洗脫色至無背景（9）測量數(shù)據(jù) A、指示劑遷移距離 B、不同分子量蛋白質(zhì)遷移距離四、實驗報告 、實驗名稱 、時間、地點 、任課教師 、學生姓名、學號、分組 、實驗目的 、實驗原理 、儀器、試劑 、實驗步聚 、結(jié)果及計算 、分析及討論 1：Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作 用，操作時應戴手套 2：玻璃管表面應光滑潔凈，蔗糖溶液封住管

17、 底，否則會造成凝膠與玻璃管之間產(chǎn)生氣 泡 3：盡量不要破壞膠面，否則樣品區(qū)帶不平整。五、注意事項五、注意事項 4：并非所有蛋白質(zhì)的分子量都可以用這種方法準確測定。一些電荷異常及帶有大的輔基的蛋白質(zhì)分子的分子量無法準確測定。 5：有多個亞基的蛋白質(zhì)分子量在測定時要結(jié)合其它方法。 六、參考資料 張龍翔等，生化實驗方法和技術(shù)（第二版），高等教育出版社 中國科學院上海植生所編，現(xiàn)代植物生理學實驗指南，科學出版社 張龍翔等， 生化實驗方法和技術(shù)（第1版），1981年，高教出版社 郭堯君，蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)（第2版），2005，科學出版社 http/:61.index.php 樣

18、品的濃縮效應：由于電泳基質(zhì)的四個不連續(xù)性(即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、pH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性)，使樣品在電泳開始時在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶(厚度為10-2cm)，而得以濃縮，然后再進行電泳分離。濃縮效應分子篩效應 分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同，因此表現(xiàn)出不同的遷移率，即所謂分子篩效應。即使凈電荷相似，也就是說自由遷移率相等的蛋白質(zhì)分子，也會由于分子篩效應在分離膠中被分開。 此處分子篩效應是指樣品通過一定孔徑的凝膠時，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱層析方法中的分子篩作用，則是大分子通過凝膠顆粒之間

19、的縫隙先流出，而小分子則通過凝膠顆粒內(nèi)的孔道后流出。電荷效應 蛋白質(zhì)混合物在凝膠界面處被高度濃縮，堆積成層，形成一狹小的高濃度的蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。承載有效電荷多，泳動速度快，反之則慢。因此各種蛋白質(zhì)就以一定的順序排列戍一個一個的圓盤狀。在進入分離膠中時，此種電荷效應仍起作用。凝膠層的不連續(xù)性層（或?qū)樱┎煌哪z，其作用如下 樣品膠：為大孔膠，用光聚合法制備，樣品預先加在其中再聚合，起防止對流的作用，避免樣品跑到上面的緩沖液中。 濃縮膠：為大孔膠，用光聚合法（或化學聚合法）制備，有防對流作用。樣品在其中濃縮，并按其遷移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界

20、面上積聚成薄層。 分離膠：為小孔膠，一般采用化學聚合法制備。樣品在其中進行電泳和分子篩分離。也有防對流的作用。 蛋白質(zhì)分子在大孔凝膠中受到的阻力小 移 動速度快。緩沖液離子的不連續(xù)性 在電場中如有兩種電荷符號相同的離子向同一方向泳動,其遷移率大小不同，兩種離子若能形成界面，則走在前面的離子稱為快離子 (又稱先行離子)，走在后面的離子稱為慢離子(又稱隨后離子)。為使樣品達到濃縮的目的需在電泳緩沖系統(tǒng)中加入有效遷移率大小不相同的兩種離子。并使這兩種離子在緩沖系統(tǒng)中組成不連續(xù)的兩相。即在三層凝膠中加入快離子，在電極緩沖液中加入慢離子。 為了保持溶液的電中性及一定的PH，需加入一種與快、慢離子符號相反的離子稱為緩沖配對離子。使緩沖配對離子分布于全部電泳緩沖系統(tǒng)中(即三層凝膠及電極緩沖液中)。例如分離蛋白質(zhì)樣品時通常用氯根(Cl-)為快離子，甘氨酸根負離子(NH2CH2COO-)為慢離子，采用三羥甲基氨基甲烷(簡稱Tris)作為緩沖配對離子。 電泳開始前，如圖A所示，慢離子位于兩個電極槽中，快離子分布在三層凝膠中，樣品在樣品凝膠中，緩沖配對離子位于全部系統(tǒng)中。 電泳進行中如圖B所示，快離子與慢離子的界面向下移動，由于選擇適當?shù)膒H緩沖液，使蛋白質(zhì)樣品的有效遷移率(有效遷移率 ，為遷移率，為解離度)介于快離子與慢離子的界面處，而濃縮成為極窄的區(qū)帶。它們的有