色譜分析概論

1、 色譜分析法概論色譜分析法概論 chromatography 色譜法概述 色譜過程和術(shù)語 色譜法基本理論 基本類型色譜的分離機制 主要內(nèi)容：主要內(nèi)容： 色譜過程和分離原理色譜過程和分離原理 基本概念和計算公式基本概念和計算公式：保留值、分配系：保留值、分配系數(shù)數(shù)K K、容量因子、容量因子k k、n n、H H、R R 色譜基本理論：塔板理論、色譜基本理論：塔板理論、速率理論速率理論 基本類型色譜機制基本類型色譜機制一、色譜法（一、色譜法（chromatograph）的起源和發(fā)展）的起源和發(fā)展 11906年由俄國植物學家Tsweet創(chuàng)立 植物色素分離植物色素分離見圖示 2、1931年胡蘿卜素異構(gòu)

2、體的分離 3、3040年代TLC、PC平板色譜法的出現(xiàn) 4、40年代瑞典科學家Tiselius等在分配液相色譜、 吸附色譜和電泳領(lǐng)域取得了成果 5、50年代英國Martin和Synge建立GC色譜 6、60年代GC-MS聯(lián)用 7、70年代HPLC崛起圖示固定相固定相CaCO3顆粒顆粒流動相流動相石油醚石油醚 2現(xiàn)在：一種重要的分離、分析技術(shù) 分離混合物各組分并加以分析 固定相固定相除了固體，還可以是液體除了固體，還可以是液體 流動相流動相液體或氣體液體或氣體 色譜柱色譜柱各種材質(zhì)和尺寸各種材質(zhì)和尺寸 被分離組分被分離組分不再僅局限于有色物質(zhì)不再僅局限于有色物質(zhì)定義：利用各組分物理化學性質(zhì)的不同

3、，在流動相流定義：利用各組分物理化學性質(zhì)的不同，在流動相流 經(jīng)固定相時，由于各組分在兩相間的吸附、分經(jīng)固定相時，由于各組分在兩相間的吸附、分 配或其它親和力的差異而產(chǎn)生不同速度的移配或其它親和力的差異而產(chǎn)生不同速度的移 動，最終達到分離的目的。動，最終達到分離的目的。圖例圖例分離基礎(chǔ)：差速遷移分離基礎(chǔ)：差速遷移 (例例:賽跑賽跑)目的：多組分分離，實現(xiàn)定性定量分析目的：多組分分離，實現(xiàn)定性定量分析圖示分離機制：分離機制： 各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心 利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現(xiàn)分離吸附解吸再吸附再解吸無數(shù)次洗脫分開碳酸鈣碳酸鈣吸附劑吸附劑石油醚石油醚流動相流動相色素

4、氣相色譜氣相色譜：流動相為氣體（稱為載氣）流動相為氣體（稱為載氣） GCGC 按固定相不同分為：氣固色譜按固定相不同分為：氣固色譜 (GSC)(GSC) 氣液色譜氣液色譜 (GLC)(GLC)三、色譜法分類：三、色譜法分類： 1按兩相分子的聚集狀態(tài)分：按兩相分子的聚集狀態(tài)分：液相色譜液相色譜：流動相為液體（也稱為淋洗液）流動相為液體（也稱為淋洗液） LCLC 按固定相的不同分為：液固色譜按固定相的不同分為：液固色譜 (LSC)(LSC) 液液色譜液液色譜 (LLC)(LLC)。2按固定相的固定方式分：按固定相的固定方式分：續(xù)前3按分離機制分：按分離機制分： （ partition chroma

5、tography） （ absorption chromatography） （ion exchange chromatography ） （size exclusion chromatography） 色譜法簡單分類色譜法簡單分類色譜法色譜法GSC液相色譜法液相色譜法 （LC）柱色譜法柱色譜法平面色譜法平面色譜法毛細管電泳法毛細管電泳法 （CE）LLCLSCSECIEC紙色譜法紙色譜法薄層色譜法薄層色譜法（TLC）LLCLLCLSC氣相色譜法氣相色譜法（GC）柱色譜法柱色譜法GLC超臨界流體色譜法超臨界流體色譜法 （SFC）優(yōu)點：優(yōu)點：“三高”、“一快”、“一廣”缺點：缺點：一、色譜過程二、

6、基本術(shù)語1、流出曲線和色譜峰2、基線、噪音和漂移3、峰寬柱效參數(shù)4、峰高和峰面積定量參數(shù)5、保留值定性參數(shù)6、分配系數(shù)和容量因子相平衡參數(shù)7、等溫線8、分離因子和分離度分離參數(shù)色譜過程：指物質(zhì)分子（被分離組分分離組分）在相對運動的 兩相（流動相流動相和固定相固定相）中的“分配”平衡 過程以吸附色譜為例色譜過程： 吸附 解吸再吸附 再解吸 反復多次洗脫被測組分分配系數(shù)不同 差速遷移 分離 流出曲線（色譜圖流出曲線（色譜圖 chromagtogram）：電信號強 度隨時間變化曲線 色譜峰色譜峰(peak)：流出曲線上突起部分 base line, noise and drift基線基線：僅有流動相

7、通過檢測器時產(chǎn)生 的信號曲線。反映檢測器噪音 隨時間變化的曲線 （穩(wěn)定平直直線）噪音噪音：儀器本身所固有的，以噪音 帶表示（儀器越好，噪音越?。┢破疲夯€向某個方向穩(wěn)定移動 （儀器未穩(wěn)定造成）峰寬峰寬W：色譜峰兩側(cè)拐點切線與基線相交的截距標準差標準差： 為正態(tài)分布曲線兩拐點間距離的一半。 對應0.607h處峰寬的一半注：小，峰窄，柱效高半峰寬半峰寬W1/2：峰高一半處所對應的峰寬355. 221W4W21699. 1WW 圖示 峰高(peak height；h)：組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時的檢測信號，即色譜峰頂至基線的距離。 峰面積(peak area；A)：色譜曲線與基線間包圍的面積。 保

8、留時間保留時間 retention time, tR：從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所需時間，即組分通過色譜柱所需要的時間 死時間死時間dead time, t0：不被固定相滯留組分的保留時間，相當于流動相到達檢測器所需要的時間 調(diào)整保留時間調(diào)整保留時間tR：組分由于和固定相作用，比不作用的組分在柱種多停留的時間，即組分在固定相中滯留的時間。等于組分的保留時間與死時間之差值0tttRR表示組分在色譜固定相內(nèi)滯留狀態(tài)的參數(shù)表示組分在色譜固定相內(nèi)滯留狀態(tài)的參數(shù)（1）時間表示的保留值）時間表示的保留值圖示續(xù)前保留體積保留體積VR：從進樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點時所需要的 流動相的體積。 VR與tR

9、和Fc（流動相流速mL/min）的關(guān)系 死體積死體積V0：由進樣器至檢測器的流路中未被固定相占有的空間 體積。包括從進樣器到色譜柱導管的體積、固定相的孔隙及顆 粒間隙、 柱出口導管及檢測器內(nèi)腔體積的總和。cRRFtVCRcRFtFV1無關(guān)；為定值，與注：310VVVVmCFtV00差，峰形，色譜峰擴展0V（2）用體積表示的保留值）用體積表示的保留值續(xù)前調(diào)整保留體積調(diào)整保留體積VR：保留體積與死體積之差，即組分 停留在固定相時所消耗流動相的體積CRRRFtVVV0cRcRFtFV1無關(guān)；與注：mSCCK 分配系數(shù)分配系數(shù)K（partition coefficient , 平衡常數(shù)）：指在一定溫度

10、和壓力下，組分在色譜柱中達分配平衡后，在固定相與流動相中的濃度比在流動相中出現(xiàn)的幾率為單位時間內(nèi)一個分子設(shè) R在固定相中出現(xiàn)的幾率為單位時間內(nèi)一個分子設(shè)1RmSmmSSVVKVCVCRR1mSVVKR11RRRtttLtLuuR000流動相的遷移速度度組分在色譜柱中遷移速) 1(R續(xù)前討論：討論： 色譜條件一定時，tR主要取決K的大小 （色譜法基本的定性參數(shù) ）)1 (0mSRVVKtt色譜過程方程RtK分配系數(shù)K不容易獲得，不常用容量因子容量因子（capacity factor, 容量比，分配比）k： 在平衡狀態(tài)下，組分在固定相與流動相中的質(zhì)量比msmmssmsVVKVCVCWWk000tt

11、tttkRR長注：Rtk不等是分離的前提不等或注：kK)1 ()1 (00kttVVKttRmSR容易獲得，用的更多k 注：應選擇合適分離條件使得難分離的組分K不等)1 (0msBBRVVKtt)1 (0msAARVVKtt)(0BAmsBRARRKKVVtttt0RBAtKK定義：指一定溫度下，組分在兩相中分配達平衡時，在兩相指一定溫度下，組分在兩相中分配達平衡時，在兩相 中的濃度關(guān)系曲線，即中的濃度關(guān)系曲線，即cs對對cm的關(guān)系曲線的關(guān)系曲線 (1) 線性等溫線線性等溫線（理想）（理想）對稱峰對稱峰(2)非線性等溫線非線性等溫線凸形凸形拖尾峰拖尾峰（常見）（常見） 凹形凹形前沿峰前沿峰固定

12、相表面活性吸附中心未達飽和，K一定，與溶質(zhì)濃度無關(guān)固定相表面吸附中心活性不均，溶質(zhì)分子先占據(jù)強吸附中心再占據(jù)弱吸附中心，K隨著溶質(zhì)濃度的增加而減小 溶質(zhì)與固定相作用，改變其表面性質(zhì)，K隨著溶質(zhì)濃度的增加而增加 對稱因子對稱因子：（拖尾因子）：（拖尾因子）fs在0.951.05之間fs小于0.95fs大于1.05ABAAWfhs2205. 0 對稱因子對稱因子(symmetry factor) 衡量色譜峰對稱性衡量色譜峰對稱性（1）分離因子（分配系數(shù)比或選擇性系數(shù)） 定義：兩種物質(zhì)調(diào)整保留值之比121212RRttkkKK分離因子1是色譜分離的必需條件22112WWttRRR峰寬和之半）保留值之

13、差（峰頂間距)2(21)1 (21122112)(177. 1)(2WWttWWttRRRRR（2）分離度（）分離度（resolution, R）： 衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù)定義：相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值的幾倍定義：相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值的幾倍討論討論 設(shè)色譜峰為正常峰，W1W2= 4 完全未分開定量分析前提）完全分離基本分離0 . 1(65 . 140 . 1RtRtRRR第三節(jié)第三節(jié) 色譜法基本理論色譜法基本理論 21RR21RR)(22/ )(1212WWttWWttR要使要使R R大，必須：大，必須：1 1、t tR R大大- - k k大大-熱力學熱力學2

14、 2、W W小小-峰展寬小峰展寬小-動力學動力學分離度：分離度： 色譜理論包括兩方面色譜理論包括兩方面:熱力學理論：熱力學理論：研究分配研究分配(分離分離)過程，塔板過程，塔板理論（理論（plate theory）。）。動力學理論：動力學理論：研究各種動力學因素對峰展研究各種動力學因素對峰展寬的影響，速率理論（寬的影響，速率理論（rate theory）。）。一、塔板理論一、塔板理論 plate theory 。 。將色譜柱比作蒸餾塔，把一根連續(xù)的色將色譜柱比作蒸餾塔，把一根連續(xù)的色譜柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小譜柱設(shè)想成由許多小段組成。在每一小段內(nèi)，一部分空間為固定相占據(jù)，另一段內(nèi)，一部

15、分空間為固定相占據(jù)，另一部分空間充滿流動相。組分隨流動相進部分空間充滿流動相。組分隨流動相進入色譜柱后，就在兩相間進行分配。并入色譜柱后，就在兩相間進行分配。并假定在每一小段內(nèi)組分可以很快地在兩假定在每一小段內(nèi)組分可以很快地在兩相中達到分配平衡，這樣一個小段稱作相中達到分配平衡，這樣一個小段稱作一個理論塔板，經(jīng)過多次分配平衡，分一個理論塔板，經(jīng)過多次分配平衡，分配系數(shù)小的組分，先離開蒸餾塔，分配配系數(shù)小的組分，先離開蒸餾塔，分配系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔。系數(shù)大的組分后離開蒸餾塔。：1柱的組成為多個連續(xù)、等距塔板，每塔板內(nèi)組分分配瞬間達 平衡（H理論塔板高度）2流動相間歇式進入色譜柱，每次進一個

16、塔板體積3樣品和載氣均加在第1號塔板上，沿柱方向縱向擴散忽略4分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)結(jié)果：當塔板數(shù)很大時，組分色譜流出曲線為趨 于正態(tài)分布理理HLn2221)(16)(54. 5WtWtnRR理L ：柱長色譜柱效參數(shù)色譜柱效參數(shù)，但柱壓和分析時間一定，；，分離能力，柱效一定，討論：理理理理理理理nLHnHLHnLn1不同；組分不同則與所用組分有關(guān)，選用注：計算理理nn一致無量綱，上下單位必須理n續(xù)前2212)(54. 5)(16WtWtnRReffeffeffnLH/0ttkR2)1(kknneff理理，實的反映柱效扣除了死時間，更能真和討論：nnkHneffeffeff塔板理論的貢獻：從熱

17、力學角度塔板理論的貢獻：從熱力學角度解釋了色譜流出曲線的形狀和濃度極大點的位置提出了評價柱效高低的n和H的計算式須在給定條件，指定組分測定時才有意義缺點：缺點：22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理1.柱效不能表示被分離組分的實際分離效果。2.塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同流動相流速下柱效不同的 結(jié)果，無法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。二、速率理論二、速率理論 rate theoryrate theory塔板理論成功處塔板理論成功處：解釋了色譜流出曲線的形狀和濃度極大值對應的tR 評價柱效（n，）塔板理論存在問題塔板理論存在問題:1）做出了四個與實際不相符的假設(shè) 忽略

18、了組分在兩相中傳質(zhì)和擴散的動力學過程2）只定性給出塔板高度的概念，卻無法解釋板高的 影響因素3）排除了一個重要參數(shù)流動相的線速度u， 因而無法解釋柱效與流速關(guān)系 更無法提出降低板高的途徑速率理論速率理論影響柱效因素 19561956年，荷蘭學者范第姆特年，荷蘭學者范第姆特(Van Deemter)(Van Deemter)提出了提出了色譜過程動力學理論色譜過程動力學理論速率理論。速率理論。塔板高度渦流擴散項縱向擴散項傳質(zhì)阻抗項H = A + B/u + Cu吸收了塔板理論的有效成果H，并從動力學角度較好地解釋了影響柱效的因素u:線速度，cm/suBAHCuu/項可忽略，最佳uCAHBuu項可忽

19、略，最佳（測定）前提下和較短在保證足夠大最佳utRR高，峰越尖銳，柱效，一定，三個常數(shù)注：nHuH = A + B/u + Cu 當色譜柱內(nèi)的組分隨流動相在固定相顆粒間穿行,朝柱出口方向移動,如果固定相顆粒不均勻,則組分在穿行這些空隙時碰到大小不一的顆粒而必須不斷的改變方向,于是在柱內(nèi)形成了紊亂的湍流流動使流經(jīng)障礙情況不同的流路中的分子到達柱出口,而使譜帶展寬圖示back柱填充不均勻 產(chǎn)生原因：流動相產(chǎn)生原因：流動相攜樣品進柱，遇到來自固定相顆粒攜樣品進柱，遇到來自固定相顆粒 的阻的阻力路徑不同渦流擴散 cmdpA單位2注：注：顆粒太小，柱壓過高且不易填充均勻 空心毛細管柱（0.10.5mm）

20、，A=0，n理較高渦流擴散系數(shù) ：填充不規(guī)則因子，：填充不規(guī)則因子，填充技術(shù)和填料顆粒形狀決定。d dp p：填料：填料 ( (固定相固定相) ) 顆粒的平均直徑，顆粒的平均直徑， dp小，A小；但dp太小，和柱阻大。產(chǎn)生原因：產(chǎn)生原因： 由于組分的加入，在柱的軸向上形成溶度梯度，因此當組分以塞子形式隨流動相流動的時候,以塞子狀分布的分子自發(fā)的向前和向后擴散。這種由濃度梯度引起的其方向沿著軸向進行的的擴散,稱為分子縱向擴散,其譜帶展寬 B/u=2DmL/u Dm為分子在流動相中的擴散系數(shù) 為填料因子 產(chǎn)生原因：由于溶質(zhì)分子在流動相和固定相中產(chǎn)生原因：由于溶質(zhì)分子在流動相和固定相中的擴散、分配、

21、轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達到平衡，的擴散、分配、轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達到平衡，實際傳質(zhì)速度是有限的，這一時間上的滯后使色實際傳質(zhì)速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬液相色譜的傳質(zhì)阻抗項Cu又分為：（1）流動相傳質(zhì)阻抗（2）固定相傳質(zhì)阻抗。流動相中的傳質(zhì)阻抗產(chǎn)生原因：組分從流動相擴散到兩相界面需要一定的時間,該時間與擴散時經(jīng)過的距離平方成正比,與組分擴散系數(shù)成反比,而擴散經(jīng)過的路程決定于固定相間顆粒的大小,由于組分處在顆?？障堕g的不同位置,因此到達兩相間的時間不同,從而使譜帶展寬.固定相的顆粒直徑越大組分到達兩相界面的

22、時間越長.柱長越長,組分停留在流動相中的時間增加,傳質(zhì)阻力相應增加.引起譜帶變寬Hmf1kd2u/Dm f1為常數(shù) k為溶質(zhì)的保留因子 d為固定相填料直徑 Dm為溶質(zhì)在流動相中的擴散系數(shù) 采用細顆粒的固定相,增大組分在在流動相中的擴散系數(shù),適當降低流動相線速,選用短柱等均可使流動相傳質(zhì)阻力盡可能的減小固定相傳質(zhì)阻抗 組分從兩相界面擴散到固定相內(nèi)部,達到平衡后又返回兩相界面時受到的阻力,稱為固定相傳質(zhì)阻抗 Hs= f2 k (df)2Lu/ Ds f2為常數(shù)，k為溶質(zhì)的保留因子，df為固定相或固定液膜的厚度，Ds為組份在固定相中的擴散系數(shù) 在吸附色譜中Hs與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層

23、固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中，Hs才有明顯影響。采用單分子層的化學鍵合固定相時Hs可以忽略 使固定相傳質(zhì)阻力減小的方法是采用低含量的固定液，以減小固定液液膜厚度。選用低粘度的固定液，增大組分在固定液中的擴散系數(shù)，適當提高柱溫和和降低流速柱外效應 速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應（色譜峰在柱外死空間里的擴展效應） 柱外效應主要由從進樣點到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應，首先應盡可能減少柱外死體積，其次進樣時間要短，并將樣品直接進在柱頭的中心部位1分離度定義式 2分離度計算式)2(21)1(2112211

24、2)(177. 1)(2WWttWWttRRRRR前提前提定義式基礎(chǔ)上，相鄰兩組分的定義式基礎(chǔ)上，相鄰兩組分的n一致（假設(shè)）一致（假設(shè)） 22114kknR理理HLnuCuBAH/121212RRttkkKK（分離因子）柱效項柱選擇項柱容量項影響色譜峰的寬窄主要取決于色譜柱性能及流速nR 因為HLn 已知LRLRH2或的條件下在不改變塔板高度22114kknR21221LLRRss注：柱長過長，柱阻增大續(xù)前 討論：討論：v 增加柱效是提高分離度的一個直接有效手段v 提高柱效、改善分離的途徑：增加柱長；降低板高v 根據(jù)速率理論，降低板高、提高柱效的方法是： 1）采用粒度較小、均勻填充的固定相（A

25、項 ） 2）分配色譜應控制固定液液膜厚度（C項 ） 3）適宜的操作條件： 流動相的性質(zhì)和流速，柱溫等等（B項 ） 22114kknR理理HLnuCuBAH/影響峰的間距 主要受固定相性質(zhì)，以及柱溫影響1R因為R，所以1，無法分離01R的影響都很大微小變化對R一倍R2 . 11 . 122114kknR121212RRttkkKK（分離因子）影響峰位影響峰位主要受固定相用量、柱溫和載氣流速的影響主要受固定相用量、柱溫和載氣流速的影響kkR100RkRkkk，1，峰擴張，的影響對時RtRk變慢時，Rkk5RtRkk很少，時，1022114kknR圖示（一）吸附色譜法（二）分配色譜法（三）離子交換色譜法（四）空間排阻色譜法對于不同的分離機理，K的含義不同。 吸附色譜 吸附