學(xué)習(xí)生化13復(fù)制a

1、DNA的生物合成的生物合成(復(fù)制復(fù)制)DNA Biosynthesis，Replication 復(fù)制復(fù)制(replication)(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以親代是指遺傳物質(zhì)的傳代，以親代DNADNA分子為分子為模板合成兩個完全相同的子代模板合成兩個完全相同的子代DNADNA分子的分子的過程。過程。復(fù)制復(fù)制親代親代DNA子代子代DNAThe Cell Life CycleThe Cell Life Cycle復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的基本規(guī)律Basic Rules of DNA Basic Rules of DNA Replication Replication 第一節(jié)第一節(jié)l復(fù)

2、制的方式復(fù)制的方式l半保留復(fù)制半保留復(fù)制(semi-conservative replication)l復(fù)制的高保真性復(fù)制的高保真性(high fidelity) l雙向復(fù)制雙向復(fù)制(bidirectional replication)l半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication) 一、半保留復(fù)制的實(shí)驗依據(jù)和意義一、半保留復(fù)制的實(shí)驗依據(jù)和意義 DNA在復(fù)制開始時，親代在復(fù)制開始時，親代DNA雙鏈間雙鏈間的氫鍵斷裂，雙鏈解開為兩股單鏈，然后以的氫鍵斷裂，雙鏈解開為兩股單鏈，然后以每一股鏈作為模板每一股鏈作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，按堿基

3、配對規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈，從而使一個合成與模板互補(bǔ)的子鏈，從而使一個DNA分分子轉(zhuǎn)變成與之完全相同的兩個子轉(zhuǎn)變成與之完全相同的兩個DNA分子。每分子。每個子代雙鏈個子代雙鏈DNA分子中，都含有一股來自親分子中，都含有一股來自親代的舊鏈和一股新合成的代的舊鏈和一股新合成的DNA鏈，這種復(fù)制鏈，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念半保留復(fù)制的概念A(yù)GGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTA

4、CTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈母鏈DNA DNA 復(fù)制過程中形成復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉的復(fù)制叉子代子代DNA DNA 目目 錄錄子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 Testing Models for DNA replicationMatthew Meselson and Franklin Stahl (1958)Matthew Meselson and Franklin Stahl more recentlyFaculty member at HarvardMechanisms of

5、 Molecular EvolutionFaculty Chair for CBW StudiesFaculty member at U. of OregonMeiotic binationTesting Models for DNA replicationMeselson and Stahl (1958)Density labeling experiment on E. coli (bacterial) DNABacterial culture15NH4Cl(Sole N source)Grow for several generationsBacterial culturewith den

6、se DNAThis is the starting material for the experimentMeselson and Stahl (continued)Harvest cells and resuspend in media with14NH4Cl as the sole N sourceBacterial culturewith dense DNAGrow for 1 generationHarvest some cells“1st generation”Grow for another generationHarvest some cells“2nd generation”

7、Grow for another generationetcFor each generation isolate the DNA and spin through a density (CsCl) gradient).Detect DNA in the gradient (eg by UV absorption)Monitor how many DNA bands there are after each generationBacterial culture“0 generation”14NH4Cl密度梯度實(shí)驗密度梯度實(shí)驗 實(shí)驗結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。實(shí)驗結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮

8、含重氮-DNA的細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代梯度離心結(jié)果梯度離心結(jié)果Meselson and Stahl Original Data按半保留復(fù)制方式，子代按半保留復(fù)制方式，子代DNADNA與親代與親代DNADNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。但不是絕對的。原核生物復(fù)制時，原核生物復(fù)制時，D

9、NA從起始點(diǎn)從起始點(diǎn)(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。 二、雙向復(fù)制二、雙向復(fù)制復(fù)制中的放射自顯影圖象復(fù)制中的放射自顯影圖象A. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)及復(fù)制起始點(diǎn)B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C. 復(fù)制接近終止點(diǎn)復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination, ter)oriterA B C真核生物每個染色體有多個起始點(diǎn)，是多真核生物每個染色體有多個起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為習(xí)慣上把兩個相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個復(fù)制子一個復(fù)

10、制子(replicon) 。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。制的功能單位。 53oriorioriori535533553復(fù)制子復(fù)制子3三、復(fù)制的半不連續(xù)性三、復(fù)制的半不連續(xù)性3535解鏈方向解鏈方向3 5 3 3 5 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈(leading strand)隨從鏈隨從鏈(lagging strand)順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱順著解鏈方向連續(xù)延長，這股

11、不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段為隨從鏈。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。的半不連續(xù)性。 DNA DNA復(fù)制的酶學(xué)復(fù)制的酶學(xué)The Enzymology of The Enzymology of DNA ReplicationDNA Replication第二節(jié)第二節(jié)參與參與DNADNA復(fù)制的物質(zhì)復(fù)制的物質(zhì) 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DN

12、A的的DNA聚合酶，簡寫聚合酶，簡寫 為為 DNA-pol模板模板(template) : 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈母鏈引物引物(primer): 提供提供3-OH末端使末端使dNTP可以依次聚可以依次聚合合 其他的酶和蛋白質(zhì)因子其他的酶和蛋白質(zhì)因子一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng) (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 目目 錄錄聚合反應(yīng)的特點(diǎn)聚合反應(yīng)的特點(diǎn)DNA 新鏈生成需引物和模板；新鏈生成需引物和模板； 新鏈的延長只可沿新鏈的延長只可沿5 3方向進(jìn)行方向進(jìn)行 。二、二、DNA聚合酶聚合酶全稱：依賴全稱：依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-de

13、pendent DNA polymerase)簡稱：簡稱：DNA-pol 、 DDDP活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性外切酶活性 5 3外切酶活性外切酶活性?能切除突變的能切除突變的 DNA片段。片段。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目目 錄錄stalling transient melting exo

14、nuclease site occupancy（一）原核生物的（一）原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol IV (discovered in 1999)DNA-pol V (discovered in 1999)（一）原核生物的（一）原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-

15、pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I功能：對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和功能：對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-pol （109kD）323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶核酸外切酶活性活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604

16、個氨基酸個氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶核酸外切酶活性活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實(shí)驗室合成片段是實(shí)驗室合成DNA，進(jìn)行，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。 Structure of the Klenow fragmentDNA-pol （120kD） DNA-pol II DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活?；虬l(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。 它參與它參與DNADNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。 功能功能是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用

17、的酶。 DNA-pol (250kD)（二）真核生物的（二）真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 有聚合酶活性，引物酶活性。有聚合酶活性，引物酶活性。持續(xù)合成持續(xù)合成DNADNA鏈，又有校正功能，完成鏈，又有校正功能，完成DNADNA復(fù)制。復(fù)制。修復(fù)酶，修復(fù)酶，DNADNA損傷的切除修復(fù)。損傷的切除修復(fù)。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用?？诘淖饔谩Ｔ诰€粒體在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。復(fù)制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol （二）真核生物的（二）真核生物的DNA聚合酶聚合酶填補(bǔ)引物填補(bǔ)引物空隙，切空

18、隙，切除修復(fù)，除修復(fù)，重組重組延長子延長子鏈的主鏈的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性線粒體線粒體DNA復(fù)復(fù)制制低保低保真度真度的復(fù)的復(fù)制制起始引起始引發(fā)，引發(fā)，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol填補(bǔ)引物填補(bǔ)引物空隙，切空隙，切除修復(fù)，除修復(fù)，重組重組延長子延長子鏈的主鏈的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性線粒體線粒體DNA復(fù)復(fù)制制低保低保真度真度的復(fù)的復(fù)制制起始引起始引發(fā)，引發(fā)，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性

19、酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol三、復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)三、復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。確傳代的基本原理。復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：（一）（一）DNA-polDNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀的核酸外切酶活性和及時校讀 （二）復(fù)制的保真性和堿基選擇（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇（一）（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀的核酸外切酶活性和及時校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基

20、；并用的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。不表現(xiàn)活性。（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇 DNA DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵）聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。 嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。 1. 遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；遵守嚴(yán)格的堿基配

21、對規(guī)律；2. 聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；3. 復(fù)制出錯時復(fù)制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。的及時校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制 四、復(fù)制中的分子解鏈及四、復(fù)制中的分子解鏈及DNA DNA 分子分子拓?fù)鋵W(xué)變化拓?fù)鋵W(xué)變化 DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。解成單鏈，它才能起模板作用。 （一）解螺旋酶、引物酶和單鏈（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白理順理順DNA鏈鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 (gyrA, B)穩(wěn)定已解開的單

22、鏈穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)運(yùn)送和協(xié)同運(yùn)送和協(xié)同DnaBDnaC (dnaC)解開解開DNA雙鏈雙鏈解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨認(rèn)起始點(diǎn)辨認(rèn)起始點(diǎn)DnaA (dnaA)蛋白質(zhì)（基因）蛋白質(zhì)（基因）通用名通用名功能功能原核生物復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)原核生物復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)E. Coli 基因圖基因圖目目 錄錄 解螺旋酶解螺旋酶(helicase) 利用利用ATP供能，作用于氫鍵，使供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解雙鏈解開成為兩條單鏈開成為兩條單鏈 “引物酶引物酶”(primase) 復(fù)制起始時

23、催化生成復(fù)制起始時催化生成RNA引物的酶引物的酶 單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整的完整 1010 8 8 局部解鏈后局部解鏈后（二）（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA topoisomerase) 解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成目目 錄錄拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵、又能連接磷酸二酯鍵 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶分分 類類拓?fù)洚愅負(fù)洚悩?gòu)酶構(gòu)酶切

24、斷切斷DNADNA雙鏈中一股鏈，使雙鏈中一股鏈，使DNADNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，閉切口，DNADNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需反應(yīng)不需ATPATP。拓?fù)洚愅負(fù)洚悩?gòu)酶構(gòu)酶切斷切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，連接斷端，供能，連接斷端， DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制作用機(jī)制 目目 錄錄五、五、DNADNA連接酶連接酶連接連接DNA鏈鏈3-OH末端和相鄰末端和相鄰DNA鏈鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段末端，使二者生成磷酸

25、二酯鍵，從而把兩段相鄰的相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。鏈連接成一條完整的鏈。 DNA連接酶連接酶(DNA ligase)作用方式作用方式POO-O-OHO5POO-O-O335DNA連接酶連接酶ATPADP5353目目 錄錄DNA連接酶（連接酶（ligase）35535353HOP DNA ligaseNADATPNMNAMP+PPi+POHP5533+53DNAligaseOOHPOOO-OOHPOOOPP-PPiDNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。作用。在在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用?？谧饔?。也是基因工程的重

26、要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能DNA生物合成過程生物合成過程The Process of DNA Replication第三節(jié)第三節(jié)（一）復(fù)制的起始（一）復(fù)制的起始需要解決兩個問題：需要解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。解開成單鏈，提供模板。2. 合成引物，提供合成引物，提供3-OH末端。末端。一、原核生物的一、原核生物的DNADNA生物合成生物合成 復(fù)制起始點(diǎn)（復(fù)制起始點(diǎn)（E.coli-oriCE.coli-oriC）E.coli復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn) oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17

27、 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列53531. DNA解鏈解鏈 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶引物引物酶酶SSB35352. 引發(fā)體和引物引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。 3535引物

28、引物3 HO5引物引物酶酶復(fù)制叉（復(fù)制叉（replication fork）（二）復(fù)制的延長（二）復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在復(fù)制的延長指在DNA-polDNA-pol催化下，催化下，dNTPdNTP以以dNMPdNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目目 錄錄領(lǐng)頭鏈的合成領(lǐng)頭鏈的合成目目 錄錄隨從鏈的合成隨從鏈的合成目目 錄錄目目 錄錄階段一階段一階段二階段二階段三階段三階段四

29、階段四復(fù)復(fù)制制過過程程簡簡圖圖目目 錄錄 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。處匯合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）復(fù)制的終止（三）復(fù)制的終止Terminating DNA synthesis in prokaryotes.Each fork stops at the Ter regions, which are 22 bp, 3 copies, and bind the Tus protein.555RNA酶酶OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP

30、+Pi55DNA連接酶連接酶 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接目目 錄錄哺乳動物的哺乳動物的細(xì)胞周期細(xì)胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNADNA生物合成生物合成 細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及期及M期這兩個關(guān)期這兩個關(guān)鍵點(diǎn)。鍵點(diǎn)。G1S及及G2M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。性有關(guān)。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。實(shí)施調(diào)控作用。 真核生物每個染色體有多個起始點(diǎn)，是多復(fù)制子真核生物每個染色體有多個起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時序性，

31、即復(fù)制子以分組方式激活復(fù)制。復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動。而不是同步起動。 復(fù)制的起始需要復(fù)制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replication factor, RF)。 增殖細(xì)胞核抗原增殖細(xì)胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。 （一）復(fù)制的起始（一）復(fù)制的起始3553領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈3535親代親代DNA隨從鏈隨從鏈引物引物核小體核小體（二）

32、復(fù)制的延長（二）復(fù)制的延長 染色體染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。呈線狀，復(fù)制在末端停止。 復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。 染色體兩端染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）復(fù)制的終止（三）復(fù)制的終止5335 5335 +5333355目目 錄錄目目 錄錄切除引物的兩種機(jī)制切除引物的兩種機(jī)制目目 錄錄 端粒端粒(telomere)指真核生物染色體線性指真核生物染色體線性DNADNA分子末端的結(jié)構(gòu)。分子末端的結(jié)構(gòu)。功能功能 維持染色體的穩(wěn)定性維持染色體的穩(wěn)定性 維持維持DNADN

33、A復(fù)制的完整性復(fù)制的完整性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 由末端單鏈由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。 末端末端DNA序列是多次重復(fù)的富含序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基堿基的短的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶端粒酶(telomerase)(telomerase) 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, h

34、TRT) 組成組成端粒酶的催端粒酶的催化延長作用化延長作用爬爬行行模模型型DNADNA聚合酶復(fù)制子鏈聚合酶復(fù)制子鏈進(jìn)一步加工進(jìn)一步加工目目 錄錄端粒與衰老端粒與衰老逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第四節(jié)第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription) 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA 模板模板逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶D

35、NA-RNA 雜雜化雙鏈化雙鏈RNA酶酶單鏈單鏈DNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈雙鏈DNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法稱為稱為cDNAcDNA法。法。 以以mRNAmRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與錄合成的與mRNAmRNA堿基序列互堿基序列互補(bǔ)的補(bǔ)的DNADNA鏈。鏈。 試管內(nèi)合成試管內(nèi)合成cDNAcDNAcDNA complement

36、ary DNA二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義 逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。的重大發(fā)現(xiàn)。 逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。到的病毒致癌理論。 滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication)(rolling circle replication)三、滾環(huán)復(fù)制和三、滾環(huán)復(fù)制和D D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制 是某些低等

37、生物的復(fù)制形式，如是某些低等生物的復(fù)制形式，如X174和和M13噬菌體等。噬菌體等。3-OH5-P55533335滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制5 533 5目目 錄錄dNTPDNA-pol 取代環(huán)復(fù)制取代環(huán)復(fù)制D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制(D-loop replication) 是線粒體是線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的復(fù)制形式。的復(fù)制形式。 Protein NameFunctionDNA GyraseUnwinding DNASSBSingle-stranded DNA bindingDnaAInitiation factorHUHistone-like (DNA binding a

38、nd bending)PriAPrimosome assemblyPriBPrimosome assemblyPriCPrimosome assemblyDnaBDNA unwinding (helicase)DnaCDnaB chaperoneDnaTAssists DnaC in delivery of DnaBPrimaseSynthesis of an RNA primerDNAP III holoenzymeElongation (DNA synthesis)DNAP IExcises RNA primer, fills in with DNALigaseCovalently lin

39、ks Okazaki fragmentsTusTermination對對DNA復(fù)制的調(diào)控復(fù)制的調(diào)控 DNA損傷（突變）與修復(fù)損傷（突變）與修復(fù)DNA Damage (Mutation) and Repair第五節(jié)第五節(jié)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。改變，均可稱為突變。在復(fù)制過程中發(fā)生的在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為突變稱為DNA損傷損傷(DNA damage)。從分子水平來看，突變就是從分子水平來看，突變就是DNA分子上分子上堿基的改變。堿基的改變。 一、突變的意義一、突變的意義（一）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)（一）突變是進(jìn)化、分化的

40、分子基礎(chǔ)（二）突變導(dǎo)致基因型改變（二）突變導(dǎo)致基因型改變（三）突變導(dǎo)致死亡（三）突變導(dǎo)致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ) 二、引發(fā)突變的因素二、引發(fā)突變的因素物理因素物理因素 紫外線紫外線(ultra violet, UV)、各種輻射、各種輻射 UV化學(xué)因素化學(xué)因素常見的化學(xué)誘變劑常見的化學(xué)誘變劑化合物類別化合物類別作作 用用 點(diǎn)點(diǎn)分子改變分子改變堿基類似物堿基類似物如：如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羥胺類（羥胺類（NH2OH）T C- T - A - C - G -亞硝酸鹽（亞硝酸鹽（NO2）C U- G - C - A - T

41、 -烷化劑烷化劑如：氮芥類，如：氮芥類，NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G目目 錄錄三、突變的分子改變類型三、突變的分子改變類型錯配錯配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) DNA分子上的堿基錯配稱點(diǎn)突變分子上的堿基錯配稱點(diǎn)突變(point mutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤?；蜞奏ぷ冟堰省?2. 顛換顛換（一）錯配（一）錯配鐮形紅細(xì)胞貧血病人鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb (HbS) 亞基亞基N-val his leu thr pro val glu C 肽鏈肽鏈CAC GTG基因基因正常成人正常成人