第四代基因組測序技術(shù)

1、納米孔基因測序技術(shù)巴德年醫(yī)學(xué)1501 王世瑀2基因測序第一代基因測序：Sanger Sanger 測序采用的是直接測序法，測序采用的是直接測序法，Sanger Sanger 測序目的是尋找與疾病有關(guān)的特定的基測序目的是尋找與疾病有關(guān)的特定的基因突變。但是對于沒有明確候選基因或候選基因數(shù)量較多的大樣本病例篩查是難以完成的，而且其只能在因突變。但是對于沒有明確候選基因或候選基因數(shù)量較多的大樣本病例篩查是難以完成的，而且其只能在PCRPCR擴(kuò)增后測序。而且只能逐段測序，分析單個(gè)擴(kuò)增后測序。而且只能逐段測序，分析單個(gè)DNADNA片段。測序成本高，數(shù)據(jù)分析量大，自動(dòng)化程度不高。片段。測序成本高，數(shù)據(jù)分析

2、量大，自動(dòng)化程度不高。另外，此法，速度慢，時(shí)間長。另外，此法，速度慢，時(shí)間長。 第二代基因測序第二代測序技術(shù)測序平臺和測序成本仍然十分高昂，儀器普遍高達(dá)第二代測序技術(shù)測序平臺和測序成本仍然十分高昂，儀器普遍高達(dá)40-7040-70萬美元，而一個(gè)全基因組測序至少需要萬美元，而一個(gè)全基因組測序至少需要2000-50002000-5000美元，同時(shí)花費(fèi)幾周的時(shí)間；第二代測序美元，同時(shí)花費(fèi)幾周的時(shí)間；第二代測序技術(shù)依賴于基因樣品的擴(kuò)增過程，大量的洗脫過程即增加了成本和樣品制備的時(shí)間，也容技術(shù)依賴于基因樣品的擴(kuò)增過程，大量的洗脫過程即增加了成本和樣品制備的時(shí)間，也容易出現(xiàn)錯(cuò)誤累積；第二代測序技術(shù)普遍讀長

3、為易出現(xiàn)錯(cuò)誤累積；第二代測序技術(shù)普遍讀長為150-400bp150-400bp，無法滿足更高的科研需要；大量，無法滿足更高的科研需要；大量的數(shù)據(jù)拼接工作和光學(xué)讀取導(dǎo)致的大體量數(shù)據(jù)，讓分析變成了耗時(shí)耗力的工作。的數(shù)據(jù)拼接工作和光學(xué)讀取導(dǎo)致的大體量數(shù)據(jù)，讓分析變成了耗時(shí)耗力的工作。3英國牛津納米孔公司最新研發(fā)出第三代基因測序技術(shù)，這項(xiàng)新英國牛津納米孔公司最新研發(fā)出第三代基因測序技術(shù)，這項(xiàng)新的基因測序技術(shù)采用納米孔單分子讀取技術(shù)的基因測序技術(shù)采用納米孔單分子讀取技術(shù)4工作原理對DNA進(jìn)行生物或化學(xué)處理,而采用物理辦法直接讀出DNA序列.其原理可以簡單的描述為: 電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過

4、納米孔。單個(gè)堿基通過納米尺度的通道時(shí), 會引起通道電學(xué)性質(zhì)的變化.理論上, A, C, G, T 4 種不同的堿基化學(xué)性質(zhì)的差異會導(dǎo)致它們穿越納米孔時(shí)引起的電學(xué)參數(shù)的變化量也不同, 對這些變化進(jìn)行檢測可以得到相應(yīng)堿基5MinION的尺寸之小，只有一支筆的長度，重大約100克，MinION完全顛覆了測序儀的形象，MinION直接通過USB鏈接到筆記本上，原始的電流信號通過網(wǎng)絡(luò)傳到英國的服務(wù)器上，進(jìn)行讀取。一個(gè)MinION有500個(gè)納米孔在并行測序，每個(gè)孔每秒測30bp，因此，要測到1G的數(shù)據(jù)，需要3天時(shí)間。6 納米孔生物納米孔固體納米孔前言：DNA鏈的直徑非常小(雙鏈DNA直徑約為2 nm, 單

5、鏈DNA直徑約為1 nm), 所以對所采用的納米孔的尺寸有著近乎苛刻 的要求. 納米通道(nanopore)是1999年由美國加州大學(xué)的Deamer和哈佛大學(xué)的Brant組共同提出的，是指由7聚體的a溶血素(aHL)在雙層脂膜上形成的直徑在(1526)nm通道。左膜通道最窄處直徑尺寸約為1.5 nm, 恰好允許單鏈DNA分子通過, 并且大小嚴(yán)格一致，從本質(zhì)上說是一種離子通道核酸外切酶附著在堿基表面將落入的孔的一側(cè)的外表面，而讓一種合成的環(huán)糊精作為傳感器共價(jià)結(jié)合到納米孔的內(nèi)表面，將這個(gè)系統(tǒng)鑲嵌在一個(gè)脂質(zhì)雙分子層內(nèi)。為了提供既符合不同堿基檢測又滿足外切酶活性的物理?xiàng)l件，須事先將脂質(zhì)雙分子層，調(diào)為不

6、同的鹽濃度。在合適的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個(gè)堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫作用，從而影響流過納米孔的電流。 固態(tài)納米孔主要是利用硅及其衍生物制造而成, 一般使用離子束或電子束在硅或其他材料薄膜表面鉆出納米尺度的孔洞, 再進(jìn)一步對孔的形狀和大小進(jìn)行修飾而成. 相比于生物納米孔, 固態(tài)納米孔在穩(wěn)定性、電流噪聲、工藝集成方面有著顯著的優(yōu)勢, 但是因?yàn)槭芟抻谌缃竦陌雽?dǎo)體工藝制造水平, 固態(tài)納米孔的制造還較為復(fù)雜與昂貴.7前提條件：（) ) 每個(gè)核苷酸都有其特有的電流阻塞信號每個(gè)核苷酸都有其特有的電流阻塞信號; () ; () 納米孔具有合適的幾何尺寸納米孔具有合適的幾何尺寸, , 一

7、次只容納一個(gè)堿基通過一次只容納一個(gè)堿基通過; () ; () 電流分辨率足以檢測核苷酸的移動(dòng)電流分辨率足以檢測核苷酸的移動(dòng); () ; () 核苷酸分子的運(yùn)動(dòng)核苷酸分子的運(yùn)動(dòng)必須是單向的必須是單向的; () ; () 納米孔與薄膜之間的組合應(yīng)當(dāng)足夠牢固以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)所需的溫度和化學(xué)環(huán)境納米孔與薄膜之間的組合應(yīng)當(dāng)足夠牢固以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)所需的溫度和化學(xué)環(huán)境. .薄膜將溶液分為薄膜將溶液分為2 2個(gè)區(qū)域個(gè)區(qū)域, , 薄膜上的納米孔作為連接薄膜上的納米孔作為連接2 2個(gè)區(qū)域的導(dǎo)電通道個(gè)區(qū)域的導(dǎo)電通道. . 在薄膜的兩側(cè)加上偏置電壓在薄膜的兩側(cè)加上偏置電壓, , 溶液中的離子在電壓作用下經(jīng)過納米孔產(chǎn)生離子電流溶

8、液中的離子在電壓作用下經(jīng)過納米孔產(chǎn)生離子電流, , 在外部條件不變且無在外部條件不變且無DNADNA分子通過納米孔的情況分子通過納米孔的情況下下, , 該電流是穩(wěn)定的該電流是穩(wěn)定的. DNA. DNA分子在驅(qū)動(dòng)電壓作用下單向通過納米孔通道時(shí)分子在驅(qū)動(dòng)電壓作用下單向通過納米孔通道時(shí), , 在合適的電壓下，核酸外切在合適的電壓下，核酸外切酶消化單鏈酶消化單鏈DNADNA，單個(gè)堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫作用。，單個(gè)堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫作用。 由于堿基阻塞了通道導(dǎo)致流經(jīng)納米由于堿基阻塞了通道導(dǎo)致流經(jīng)納米孔通道的離子流量減小孔通道的離子流量減小, , 因此可以觀察到離子電流的減小因

9、此可以觀察到離子電流的減小. . 離子電流可以通過偏置電壓乘以總電導(dǎo)的離子電流可以通過偏置電壓乘以總電導(dǎo)的方式求得方式求得. .腺嘌呤腺嘌呤A A與胸腺嘧啶與胸腺嘧啶T T的電信號大小很接近，但的電信號大小很接近，但T T在環(huán)糊精停留的時(shí)間是其他核苷酸的在環(huán)糊精停留的時(shí)間是其他核苷酸的2 2到到3 3倍，倍，鳥嘌呤鳥嘌呤G G和胞嘧啶和胞嘧啶C C各自停留的時(shí)間也不同，所以每個(gè)堿基都有特有的電流干擾振幅而區(qū)分開來。另外甲各自停留的時(shí)間也不同，所以每個(gè)堿基都有特有的電流干擾振幅而區(qū)分開來。另外甲基化的基化的c c在環(huán)糊精的停留時(shí)間為正常在環(huán)糊精的停留時(shí)間為正常c c在環(huán)糊精的停留時(shí)間的兩倍，所以

10、通過納米孔檢測還可以直接讀取在環(huán)糊精的停留時(shí)間的兩倍，所以通過納米孔檢測還可以直接讀取甲基化的甲基化的c c8 隧道電流對隧道電流對DNADNA分子經(jīng)過電極時(shí)的位置、方向十分敏分子經(jīng)過電極時(shí)的位置、方向十分敏感感, ,所以即使非常微小的差異也會引起隧道電流的變化所以即使非常微小的差異也會引起隧道電流的變化, , 如何控制如何控制DNADNA分子準(zhǔn)確、單一方向地通過納米孔也很難。分子準(zhǔn)確、單一方向地通過納米孔也很難。 電容檢測法作為一種可能的電學(xué)解決方案電容檢測法作為一種可能的電學(xué)解決方案, ,也有研究也有研究者對此進(jìn)行了研究者對此進(jìn)行了研究, ,當(dāng)單個(gè)堿基通過納米孔時(shí)當(dāng)單個(gè)堿基通過納米孔時(shí),

11、,其自身所帶其自身所帶電荷會引起納米電容上的電荷量發(fā)生變化電荷會引起納米電容上的電荷量發(fā)生變化, ,從而可以檢測從而可以檢測到電壓的變化到電壓的變化, ,理論上理論上4 4種不同的堿基所帶電荷不同種不同的堿基所帶電荷不同, ,引起引起的電壓變壓也會有所差異的電壓變壓也會有所差異, ,因此可以用于因此可以用于DNADNA的測序的測序. .在絕在絕緣體上硅襯底上制作出緣體上硅襯底上制作出poly-SiO2-Sipoly-SiO2-Si結(jié)構(gòu)的納米電容結(jié)構(gòu)的納米電容, ,來來檢測堿基通過納米孔時(shí)引起的電壓波動(dòng)檢測堿基通過納米孔時(shí)引起的電壓波動(dòng), , 通過仿真驗(yàn)證通過仿真驗(yàn)證了采用電容的電壓波動(dòng)分辨單個(gè)

12、堿基信息的可能性了采用電容的電壓波動(dòng)分辨單個(gè)堿基信息的可能性, ,通過通過仿真給出了仿真給出了C, A, T, G 4C, A, T, G 4種堿基單獨(dú)穿越納米孔時(shí)引起的種堿基單獨(dú)穿越納米孔時(shí)引起的電壓波動(dòng)的變化。可以看出電壓波動(dòng)的變化。可以看出, C, A, G 3, C, A, G 3種堿基的電壓曲種堿基的電壓曲線較為相近線較為相近, ,有一個(gè)峰值和一個(gè)谷值有一個(gè)峰值和一個(gè)谷值, ,與單個(gè)偶極子穿越納與單個(gè)偶極子穿越納米孔引起的電壓波動(dòng)類似米孔引起的電壓波動(dòng)類似, ,而而T T的電壓曲線可區(qū)分度較高的電壓曲線可區(qū)分度較高, ,有有1 1個(gè)峰值和個(gè)峰值和2 2個(gè)谷值個(gè)谷值. .圖中得到的結(jié)果

13、是脫離圖中得到的結(jié)果是脫離DNADNA骨架的單骨架的單個(gè)堿基得到的結(jié)果個(gè)堿基得到的結(jié)果, , 實(shí)際在測量單個(gè)堿基過程中得到的實(shí)際在測量單個(gè)堿基過程中得到的電壓值會受到電壓值會受到DNADNA骨架、附近堿基和溶液離子的影響骨架、附近堿基和溶液離子的影響, , 因因此在堿基識別的準(zhǔn)確度上還有很多需要研究的問題此在堿基識別的準(zhǔn)確度上還有很多需要研究的問題. . 電容檢測法電容檢測法9 熒光測序DNA序列信息轉(zhuǎn)換成兩種顏色的圖形信息，然后再通過光學(xué)讀出技術(shù)進(jìn)行檢測、分析。然而，要將熒光探 針標(biāo)記到DNA鏈中的每一個(gè)堿基上是非常困難的工作。于是人們開發(fā)出了一種新的方法，使用合成DNA和光讀取技術(shù)測序。待

14、測DNA鏈中的每一個(gè)核苷酸都被替換成更長的由橙色和藍(lán)色堿基組成的寡聚體，每一個(gè)待測核苷酸都被12bp的寡聚體替代。將這種轉(zhuǎn)換后的新 DNA鏈與分子信標(biāo)雜交。雜交鏈在通過納米孔時(shí)分子信標(biāo)會脫落，釋放出熒光，讀取這些熒光就可以推測出原始 DNA鏈的序列。用兩種不同的12 堿基寡聚體（12-mer oligos）A和B，按照四種不同的組合方式（AB、BA、AA、BB）將A、B組合起來，這樣就可以對DNA鏈中的每一個(gè)核苷酸進(jìn)行替換了。因?yàn)閱蝹€(gè)核苷酸通過納米孔的速度實(shí)在是太快了，完全無法進(jìn)行檢測，所以將單核苷酸替換成這種長一點(diǎn)的寡聚體，可以減緩?fù)ㄟ^速度，方便檢測。同時(shí)，通過這種信號轉(zhuǎn)化還將DNA鏈中原本

15、的四種信號A、T、G、C簡化成了A、B兩種信號。挪威Lingvitae公司已經(jīng)成功開發(fā)出了一種自動(dòng)化的、大規(guī)模并行處理方法。該方法可以在24小時(shí)內(nèi)將一個(gè)人類基因組序列轉(zhuǎn)化成由24bp寡聚體序列組成的“新”序列。10 缺陷 1，DNADNA高速通過納米孔的特性使得高速測序成為可能，但同時(shí)這種高速度也正是很多納米孔測序技術(shù)的弱點(diǎn)。高速通過納米孔的特性使得高速測序成為可能，但同時(shí)這種高速度也正是很多納米孔測序技術(shù)的弱點(diǎn)。因?yàn)樗俣忍?，檢測的信號質(zhì)量就不高，甚至很多小因?yàn)樗俣忍?，檢測的信號質(zhì)量就不高，甚至很多小 的信號根本就檢測不到。在的信號根本就檢測不到。在120mV120mV的條件下，的條件下，

16、DNADNA會以每個(gè)會以每個(gè)堿基堿基/1s20s/1s20s的速度通過的速度通過溶血素納米孔。溶血素納米孔。 這就需要探測器的檢測帶寬達(dá)到這就需要探測器的檢測帶寬達(dá)到MHzMHz級，才能檢測到皮安級的電級，才能檢測到皮安級的電流強(qiáng)度。流強(qiáng)度。 當(dāng)當(dāng)DNADNA在電泳作用下通過納米孔時(shí)，由于擴(kuò)散作用的影響，降低了測序的質(zhì)量。由于在電泳作用下通過納米孔時(shí)，由于擴(kuò)散作用的影響，降低了測序的質(zhì)量。由于DNADNA分子的隨機(jī)分子的隨機(jī) 運(yùn)動(dòng)使得運(yùn)動(dòng)使得它通過納米孔的時(shí)間，即通過時(shí)間的跨度非常大，因此，人們無法判斷有多少堿基通過了納米孔。而且，由于跨它通過納米孔的時(shí)間，即通過時(shí)間的跨度非常大，因此，人們無

17、法判斷有多少堿基通過了納米孔。而且，由于跨孔孔DNADNA分子與納米孔表面間存在的分子與納米孔表面間存在的 非特異性的相互作用還會受到非連續(xù)性的粘滑現(xiàn)象影響，所以相互作用會發(fā)生非特異性的相互作用還會受到非連續(xù)性的粘滑現(xiàn)象影響，所以相互作用會發(fā)生改變。同一種堿基分子通過納米孔時(shí)的通過時(shí)間也會不同。而且如果堿基分子通過納米孔的時(shí)間小于平均通過時(shí)改變。同一種堿基分子通過納米孔時(shí)的通過時(shí)間也會不同。而且如果堿基分子通過納米孔的時(shí)間小于平均通過時(shí)間，那么它極有可能被漏檢。間，那么它極有可能被漏檢。 鑒于此，對于納米孔測序技術(shù)來說，最為重要的一點(diǎn)就是如何控制并減慢鑒于此，對于納米孔測序技術(shù)來說，最為重要的

18、一點(diǎn)就是如何控制并減慢DNADNA分子通過納米孔的速度，分子通過納米孔的速度， 同同時(shí)盡量消除由于納米孔表面相互作用給時(shí)盡量消除由于納米孔表面相互作用給DNADNA分子跨孔動(dòng)力學(xué)上造成的波動(dòng)現(xiàn)象。降溫和增加溶液的粘稠度分子跨孔動(dòng)力學(xué)上造成的波動(dòng)現(xiàn)象。降溫和增加溶液的粘稠度 可以在可以在一定程度上減慢一定程度上減慢DNADNA分子通過納米孔的速度，但這兩種方法都不能消除因納米孔表面相互作用造成的跨孔動(dòng)力學(xué)分子通過納米孔的速度，但這兩種方法都不能消除因納米孔表面相互作用造成的跨孔動(dòng)力學(xué)波動(dòng)現(xiàn)象。波動(dòng)現(xiàn)象。2，溶血素七聚體是最常用于在脂質(zhì)雙分子層中制造生物納米孔的材料，它性質(zhì)非溶血素七聚體是最常用于在脂質(zhì)雙分子層中制造生物納米孔的材料，它性質(zhì)非 常穩(wěn)定。但脂質(zhì)雙常穩(wěn)定。但脂質(zhì)雙分子層的性質(zhì)卻不那么穩(wěn)定，尤其是液態(tài)脂質(zhì)雙分子層，制造起來極難且費(fèi)時(shí)。分子層的性質(zhì)卻不那么穩(wěn)定，尤其是液態(tài)脂質(zhì)雙分子層，制造起來極難且費(fèi)時(shí)。使用離子束雕刻、電子束鉆孔和原子層沉積等方法可以在氮化硅、氧化硅或其它