生物化學(xué)復(fù)習(xí)-蛋白質(zhì)3-5-1-7

1、第六節(jié)、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第六節(jié)、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)分子具有多樣的生物學(xué)功能，需要一蛋白質(zhì)分子具有多樣的生物學(xué)功能，需要一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還需要一定的空間構(gòu)象。定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還需要一定的空間構(gòu)象。一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化（一）同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異十分明顯，但相蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)的功能起決定作用。根同部分氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)的功能起決定作用。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異，可以斷定它們?cè)谟H緣據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異，可以斷定它們?cè)?/p>

2、親緣關(guān)系上的遠(yuǎn)近。關(guān)系上的遠(yuǎn)近。同源蛋白質(zhì)：在不同生物體中行使相同或相似同源蛋白質(zhì)：在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)稱同源蛋白質(zhì)。如功能的蛋白質(zhì)稱同源蛋白質(zhì)。如血紅蛋白在血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能，不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能，細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分組分 。 同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)： A.不同種屬來(lái)源的同源蛋白質(zhì)具有相同長(zhǎng)度不同種屬來(lái)源的同源蛋白質(zhì)具有相同長(zhǎng)度或接近相同長(zhǎng)度的多肽鏈?；蚪咏嗤L(zhǎng)度的多肽鏈。B.順序同源現(xiàn)象：同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具順序同源現(xiàn)象：同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明

3、顯的相似性，這種相似性稱序列同源性，有明顯的相似性，這種相似性稱序列同源性，或順序同源現(xiàn)象?；蝽樞蛲船F(xiàn)象。lC.不變殘基和可變殘基：不變殘基和可變殘基：l同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序中有許多位置的氨基同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序中有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱酸對(duì)所有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱不變殘基不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。不變殘基高度保守，是必需的。l除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對(duì)不同的除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有很大變化，稱種屬有很大變化，稱可變殘基可變殘基，可變殘基中，可變殘基中，個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能

4、。 l通過(guò)比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以通過(guò)比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化，親源關(guān)系研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化，親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序差異就越大越遠(yuǎn)，同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序差異就越大l25種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基35個(gè)。l60種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基27個(gè)。l親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素C的差異越小。l親源關(guān)系越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素C的差異越大。l物種的親緣關(guān)系越近，物種的親緣關(guān)系越近，細(xì)胞色素細(xì)胞色素c的一級(jí)結(jié)構(gòu)越的一級(jí)結(jié)構(gòu)越相似，據(jù)此可繪制系統(tǒng)相似，據(jù)此可繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析分析2. 胰島素胰

5、島素 不同生物的胰島素不同生物的胰島素AA序列中，有序列中，有24個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸殘基位置始終不變，殘基位置始終不變，A, B鏈上鏈上6個(gè)個(gè)Cys 不變不變（重要性），其余（重要性），其余18 個(gè)氨基酸多數(shù)為個(gè)氨基酸多數(shù)為非極非極性側(cè)鏈性側(cè)鏈，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。用。其它氨基酸其它氨基酸 對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對(duì)免疫反應(yīng)起作用，豬與人接近，而狗則但對(duì)免疫反應(yīng)起作用，豬與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。尿病。 （二）（二）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的個(gè)體差

6、異蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的個(gè)體差異分子病分子病 基因突變引起某個(gè)功能蛋白的某個(gè)（些）基因突變引起某個(gè)功能蛋白的某個(gè)（些）氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使其功能部分或全部喪的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使其功能部分或全部喪失。失。鐮狀細(xì)胞貧血（鐮狀細(xì)胞貧血（sick-cell anemia）是最早被）是最早被認(rèn)識(shí)的一種分子病。它是由于基因突變導(dǎo)致血紅認(rèn)識(shí)的一種分子病。它是由于基因突變導(dǎo)致血紅蛋白分子中氨基酸殘基被更換所造成的。蛋白分子中氨基酸殘基被更換所造成的。-鏈鏈 1 2 3 4 5 6 7 8Hb-A Val-His-Leu-Th

7、r-Pro-Glu-Glu-LysHb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys從患者紅從患者紅細(xì)胞中鑒細(xì)胞中鑒定出特異定出特異的鐮刀型的鐮刀型或月牙型或月牙型細(xì)胞。細(xì)胞。正常紅細(xì)胞正常紅細(xì)胞鐮刀狀紅細(xì)胞鐮刀狀紅細(xì)胞（三）一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)（三）一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活的激活 一些蛋白質(zhì)、酶、多肽激素在剛合成時(shí)是以無(wú)活性一些蛋白質(zhì)、酶、多肽激素在剛合成時(shí)是以無(wú)活性的前體形式存在，只有切除部分多肽后才呈現(xiàn)生的前體形式存在，只有切除部分多肽后才呈現(xiàn)生物活性，如血液凝固系統(tǒng)的血纖維蛋白原和凝血物活性，如血液凝固系統(tǒng)的血纖維蛋白原和凝血酶原，消化系統(tǒng)的蛋白酶原

8、、激素前體等。酶原，消化系統(tǒng)的蛋白酶原、激素前體等。胰島素原的激活胰島素原的激活 胰島素在胰島的胰島素在胰島的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上合成，稱前胰島素原，含信號(hào)肽。前胰島素原在合成，稱前胰島素原，含信號(hào)肽。前胰島素原在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，進(jìn)入后，信號(hào)信號(hào)肽的引導(dǎo)下，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，進(jìn)入后，信號(hào)肽被肽被信號(hào)肽酶信號(hào)肽酶切除，生成胰島素原，被運(yùn)至高爾切除，生成胰島素原，被運(yùn)至高爾基體貯存。并在特異的肽酶作用下，切除基體貯存。并在特異的肽酶作用下，切除C C肽，肽，得到活性胰島素。得到活性胰島素。 二、二、 蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系別（變）構(gòu)現(xiàn)象：別（變）

9、構(gòu)現(xiàn)象：蛋白質(zhì)與配體結(jié)合改變蛋白蛋白質(zhì)與配體結(jié)合改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的現(xiàn)象。質(zhì)的構(gòu)象，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的現(xiàn)象。別構(gòu)蛋白多是寡聚蛋白。因別構(gòu)而產(chǎn)生的效應(yīng)別構(gòu)蛋白多是寡聚蛋白。因別構(gòu)而產(chǎn)生的效應(yīng)稱稱別構(gòu)效應(yīng)別構(gòu)效應(yīng)。在蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用中，能被它可在蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用中，能被它可逆結(jié)合的其他分子稱為逆結(jié)合的其他分子稱為配體配體。1. 肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)由一條多肽鏈和一個(gè)輔基血紅素構(gòu)成，Mr為16.6KD，153個(gè)氨基酸殘基。Kendrew J及其同事于1963年完成肌紅蛋白的X-晶體學(xué)分析，最終分辨率為0.14nml肌紅蛋白- 血紅蛋白家族中鐵是由稱為

10、原卟啉 （protoporphyrin ）的有機(jī)分子固定的。l原卟啉由4個(gè)吡咯環(huán)l原卟啉 只有結(jié)合亞鐵態(tài)鐵才能結(jié)合氧氧合肌紅蛋白中血紅素鐵離子的6個(gè)配體l4個(gè)是卟啉環(huán)中央的4個(gè)N原子，第5個(gè)是環(huán)面上方的His93（F8），第6個(gè)是下方的O2肌紅蛋白在進(jìn)化中形成的多肽微環(huán)肌紅蛋白在進(jìn)化中形成的多肽微環(huán)境至少有三個(gè)作用：境至少有三個(gè)作用：固定血紅素基；保護(hù)血紅素鐵免遭氧化；固定血紅素基；保護(hù)血紅素鐵免遭氧化；為為O2分子提供一個(gè)合適的結(jié)合部位分子提供一個(gè)合適的結(jié)合部位l鐵原子的位置與卟啉環(huán)平面的關(guān)系發(fā)生關(guān)鍵性改變?nèi)パ跫〖t蛋白中Fe（II）離子有5個(gè)配位體，位于離卟啉環(huán)平面上方（HisF8一側(cè)）0.

11、055nm處。與O2結(jié)合時(shí)， Fe（II）離子離卟啉環(huán)平面只有0.026nm.是血紅蛋白具有別構(gòu)性質(zhì)的基本原因His64(E7)MbO2Mb+O2K = MbO2 / MbO2 (1)Y=MbO2/Mb+MbO2 (2)Y=O2 / O2+K將（1）改寫為： MbO2 = MbO2 / K 并代入（2）得： l當(dāng)當(dāng)Y=1Y=1時(shí)，所有肌紅蛋白的氧合位置均被占據(jù)，即肌紅蛋白時(shí)，所有肌紅蛋白的氧合位置均被占據(jù)，即肌紅蛋白被氧飽和被氧飽和,K=0,K=0lY=0.5Y=0.5時(shí)，肌紅蛋白的一半被飽和，時(shí)，肌紅蛋白的一半被飽和，PO2=KPO2=K，解離常數(shù)，解離常數(shù)K K稱為稱為P50P50， P(

12、O2)=K= P50或P0.5 P50定義為肌紅蛋白一半被氧飽和時(shí)的氧分壓 肌紅蛋白的氧合曲線呈雙曲線型，表明對(duì)肌紅蛋白的氧合曲線呈雙曲線型，表明對(duì)O2O2的親和力較大，的親和力較大， P50 為2torr2torr，適于儲(chǔ)氧（線粒體，適于儲(chǔ)氧（線粒體O2O2：0 010torr10torr；靜脈血；靜脈血15torr15torr或更高）。或更高）。 肌紅蛋白也利于胞內(nèi)的肌紅蛋白也利于胞內(nèi)的O2O2從內(nèi)表面向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)從內(nèi)表面向線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn) ( (內(nèi)表面內(nèi)表面10torr, 80%10torr, 80%飽和飽和, ,線粒體線粒體 1 torr, 25% 1 torr, 25% 飽和飽和) )

13、LogY/(1-Y)=log p(O2) logKY=O2 / O2+K =p(O2)/p(O2)+KY K= p(O2) Y p(O2) = p(O2)(1Y)Y/ (1Y)= p(O2)/ Kl在從肺部經(jīng)心臟到達(dá)外周組織的動(dòng)脈血中Hb約為96氧飽和度。在回到心臟的靜脈血中Hb僅為64氧飽和度。因此每100ml血經(jīng)過(guò)組織約釋放Hb攜帶的1/3氧或相當(dāng)于大氣壓和體溫下6.5ml氧氣l血紅蛋白的結(jié)構(gòu)、氧合過(guò)程中的構(gòu)象變化、氧結(jié)合曲線和別構(gòu)效應(yīng)（協(xié)同性）l 血紅蛋白的構(gòu)象（三維結(jié)構(gòu)）MbHb Hb l兩個(gè)二聚體的偏心樞軸旋移15并平移0.08nm 去氧血紅蛋白氧合血紅蛋白l近側(cè)His（F8）與Fe

14、原子一起被拉動(dòng)，F(xiàn)e-N鍵變成垂直于血紅素平面l共8個(gè)鹽橋，氧合時(shí)伴鹽橋斷裂P (O2)/torr氧飽和分?jǐn)?shù)（Y）P50=26torr肺泡中P(O2)工作肌肉毛細(xì)血管中P(O2)l由Y對(duì)P (O2)作圖Y=P4(O2)P4(O2) + KP(O2)/torrY完全協(xié)同，n=4實(shí)驗(yàn)觀察到亞基間結(jié)合氧時(shí)無(wú)相互作用l由此方程導(dǎo)出Y=P4(O2)P4(O2) + KYPn(O2)K=1Y兩邊取對(duì)數(shù)，得log(Y/(1-Y)=nlogP(O2)-logK對(duì)logP(O2)Y1Ylog(作圖Hill系數(shù)是協(xié)同性程度的一種量度 n=1表示配體結(jié)合是非協(xié)同性的; n1表示配體結(jié)合是正協(xié)同性的; n1表示配體結(jié)

15、合是負(fù)協(xié)同性的。50% 飽和度時(shí), logK=n(logP50) 或 K=(P50)n血紅蛋白氧合協(xié)同性使它更有效的起著運(yùn)輸氧氣的作用P (O2)/torr氧飽和分?jǐn)?shù)（Y）P50=26torr肺泡中P(O2)工作肌肉毛細(xì)血管中P(O2)Y=0.97Y=0.25lH+、CO2和BPG在血紅蛋白上都有各自的結(jié)合部位，這種在空間上相隔部位間的相互作用一種別構(gòu)效應(yīng)(1)、 H+和CO2促進(jìn)O2的釋放（Bohr效應(yīng)）碳酸酐酶在紅細(xì)胞中特別豐富 HbO2 + H+ +CO2 HbH+CO2 + O2 圖6-17 在不同pH下Mb和Hb的氧飽和分?jǐn)?shù)曲線氧飽和分?jǐn)?shù)（Y）組織中血液中實(shí)驗(yàn)中P(O2)/torrl

16、反應(yīng)是可逆的，產(chǎn)生的H+貢獻(xiàn)于Bohr效應(yīng)。氨基甲酸也可形成額外的鹽橋，有助于穩(wěn)定T態(tài)，促進(jìn)氧的釋放l正常人的紅細(xì)胞約含有4.5mmol/L BPG，約與血紅蛋白等摩爾數(shù)。Hb四聚體分子中只有一個(gè)BPG結(jié)合部位。位于四個(gè)亞基締合形成的中央空穴內(nèi)。而氧合血紅蛋白（R態(tài)）中，中央空穴變得太小，容納不了BPG，因?yàn)镺2的結(jié)合引起構(gòu)象變化，擾亂了BPG的結(jié)合部位。l可表示如下：BPG降低血紅蛋白對(duì)氧的親和力BPG與每個(gè)與每個(gè)b b鏈鏈的的Lys b82, b82, His b2, b2, His b143 b143, , N-末端末端 Val b1 b1等殘基的正電等殘基的正電荷靜電作用荷靜電作用P(

17、O2)/torr氧飽和分?jǐn)?shù)（Y）組織中肺中（4500m）肺中 (海平面）BPG進(jìn)一步提高了血紅蛋白的輸氧效率。在進(jìn)一步提高了血紅蛋白的輸氧效率。在肺部，肺部，PO2超過(guò)超過(guò)100torr，血紅蛋白幾乎全被，血紅蛋白幾乎全被O2飽和飽和, BPG是否存在與氧和關(guān)系不大。在是否存在與氧和關(guān)系不大。在組織中，組織中，PO2低（低（30torr)，BPG能降低血紅能降低血紅蛋白的氧親和力，加大血紅蛋白的卸氧量。蛋白的氧親和力，加大血紅蛋白的卸氧量。（1）高山適應(yīng)和肺氣腫的生理補(bǔ)償變化；）高山適應(yīng)和肺氣腫的生理補(bǔ)償變化；BPG升高。升高。（2）血庫(kù)儲(chǔ)血時(shí)加入肌苷可防止）血庫(kù)儲(chǔ)血時(shí)加入肌苷可防止BPG的降

18、解。的降解。l氧的S形曲線結(jié)合，Bohr效應(yīng)以及BPG效應(yīng)物的調(diào)節(jié)使得血紅蛋白的輸氧能力達(dá)到最高效率(協(xié)同效應(yīng)、波耳效應(yīng)、別構(gòu)效應(yīng)使血紅蛋協(xié)同效應(yīng)、波耳效應(yīng)、別構(gòu)效應(yīng)使血紅蛋白的輸氧能力達(dá)到最高效率白的輸氧能力達(dá)到最高效率 )l血紅蛋白使體內(nèi)的pH維持在一個(gè)較穩(wěn)定的水平l血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)充分反映了它的生物學(xué)適應(yīng)性，結(jié)構(gòu)與功能的高度統(tǒng)一性。1. 胎兒血紅蛋白（胎兒血紅蛋白（HbF)在相當(dāng)于成人血紅蛋在相當(dāng)于成人血紅蛋白白 (HbA)b b 鏈鏈143殘基位置含有殘基位置含有Ser， 而成年而成年人人b b 鏈的這個(gè)位置是具有陽(yáng)離子的鏈的這個(gè)位置是具有陽(yáng)離子的His殘基。殘基。殘基殘基143面向

19、面向b b 亞基之間的中央空隙。亞基之間的中央空隙。（1 1）為什么）為什么 2 , 3-2 , 3-二磷酸甘油酸（二磷酸甘油酸（2, 3-2, 3-BPG)同脫氧同脫氧HbA的結(jié)合比同脫氧的結(jié)合比同脫氧HbF更緊？更緊？ （2） HbF 對(duì)對(duì)2 , 3-二磷酸甘油酸的低親和力二磷酸甘油酸的低親和力如何影響到如何影響到HbF 對(duì)氧的親和力？對(duì)氧的親和力？ （3） HbF 的的P50 是是18托（托（Torr) , HbA的的P50 是是26托（托（Torr) ，基于這兩個(gè)數(shù)值如何解釋，基于這兩個(gè)數(shù)值如何解釋氧從母親血液有效轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒？氧從母親血液有效轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒？鏈的143位為絲氨酸，而鏈的14

20、3位為組氨酸 解析與要點(diǎn)解析與要點(diǎn) ：（1） 2 , 3-二磷酸甘油酸的陰離子基團(tuán)處在脫氧血二磷酸甘油酸的陰離子基團(tuán)處在脫氧血紅蛋白兩條紅蛋白兩條b b 鏈的鏈的Lys b82b82、H His b b143、 His b b2和和N-末端末端Val b1 b1 氨基的陽(yáng)離子形成氫鍵和鹽鍵的距離范氨基的陽(yáng)離子形成氫鍵和鹽鍵的距離范圍內(nèi)，它可與中心空隙帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，而脫圍內(nèi)，它可與中心空隙帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，而脫氧氧HbF b b 鏈鏈143殘基位置含有殘基位置含有Ser，缺少帶正電荷的，缺少帶正電荷的側(cè)鏈，減低了對(duì)側(cè)鏈，減低了對(duì)2 , 3-二磷酸甘油酸的親和力二磷酸甘油酸的親和力 （2）

21、 2 , 3-二磷酸甘油酸穩(wěn)定脫氧血紅蛋白的構(gòu)象，二磷酸甘油酸穩(wěn)定脫氧血紅蛋白的構(gòu)象， HbF 與與2 , 3-二磷酸甘油酸的結(jié)合力低，因而增加了二磷酸甘油酸的結(jié)合力低，因而增加了對(duì)氧的親和力。對(duì)氧的親和力。 （3）在）在20 40 torr 氧分壓下，氧分壓下， HbF對(duì)氧的親和力對(duì)氧的親和力大于大于HbA 允許氧由母親血向胎兒有效轉(zhuǎn)移。允許氧由母親血向胎兒有效轉(zhuǎn)移。l2.在體外，用下列方法處理對(duì)血紅蛋白與氧的親和力有什么影響？l(1)pH值從7.0增加到7.4l(2)CO2分壓從1000Pa增加到4000Pal(3)O2分壓從6000Pa下降到2000Pal(4)2,3-二磷酸甘油酸的濃度

22、從810-4 mol/L下降到210-4 mol/Ll(5) a2b2解聚成單個(gè)亞基l解答： (1)pH值增加，Hb與氧的親和力增加l(2)CO2分壓增加，Hb與氧的親和力降低l(3)O2分壓下降，Hb與氧的親和力降低l(4)2,3-DPG濃度下降，Hb與氧的親和力增加l(5) a2b2解聚成單個(gè)亞基， Hb與氧的親和力增加l導(dǎo)致一個(gè)蛋白質(zhì)中氨基酸改變的基因突變能產(chǎn)生所謂分子病，這是一種遺傳病l與有缺陷的血紅蛋白有關(guān)的疾病分為兩類：一類稱為血紅蛋白病是由于或鏈發(fā)生了變化，例如鐮刀狀細(xì)胞貧血病等；另一類稱為地中海貧血，是由于缺少了或鏈，例如-和-地中海貧血病l由于遺傳基因突變導(dǎo)致血紅蛋白分子中氨

23、基酸殘基的替代所造成的l是一個(gè)反映出蛋白質(zhì)的氨基酸序列在決定它的構(gòu)象及其生物學(xué)功能方面的重大作用的典型例子。Hb A H2NVal-His-leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Hb S H2NVal-His-leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys- 1 2 3 4 5 6 7 8鐮刀形鐮刀形紅細(xì)胞紅細(xì)胞正常紅正常紅細(xì)胞細(xì)胞小小 結(jié)結(jié)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：（1）每種蛋白質(zhì)分子都具有其特定的結(jié)構(gòu)來(lái)完）每種蛋白質(zhì)分子都具有其特定的結(jié)構(gòu)來(lái)完成它特定的功能，甚至只有個(gè)別氨基酸的變化成它特定的功能，甚至只有個(gè)別氨基酸的變化就能引起功能的改變或喪失，結(jié)構(gòu)

24、與功能之間就能引起功能的改變或喪失，結(jié)構(gòu)與功能之間具有高度統(tǒng)一性。具有高度統(tǒng)一性。（2）蛋白質(zhì)的構(gòu)象與功能的關(guān)系十分密切。構(gòu)）蛋白質(zhì)的構(gòu)象與功能的關(guān)系十分密切。構(gòu)象改變時(shí)，功能也會(huì)發(fā)生改變；蛋白質(zhì)構(gòu)象的象改變時(shí)，功能也會(huì)發(fā)生改變；蛋白質(zhì)構(gòu)象的破壞，可引起功能的喪失。破壞，可引起功能的喪失。l（遼寧師范大學(xué)2005年）討論蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系l蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮必須以特定構(gòu)象為基礎(chǔ)，兩者密切相關(guān)。l（1）變性、復(fù)性，構(gòu)象改變，生物學(xué)活性改變l(2) 酶原激活等例子都說(shuō)明通過(guò)改變一級(jí)結(jié)構(gòu)而改變空間結(jié)構(gòu)，從而酶活改變（3）肌紅蛋白與血紅蛋白a、b 結(jié)構(gòu)相似，具有相似的功能。其特定的結(jié)構(gòu)維持了結(jié)合氧的

25、能力。 血紅蛋白為四聚體，具有變構(gòu)現(xiàn)象使得輸氧能力高度有效。l（4）酶與底物結(jié)合過(guò)程中的誘導(dǎo)契合第七節(jié)第七節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì) 蛋白質(zhì)是相對(duì)分子質(zhì)量（蛋白質(zhì)是相對(duì)分子質(zhì)量（relative molecular mass, Mr）很大的生物大分子，其）很大的生物大分子，其Mr變化范圍在變化范圍在6 0001 000 000 或更大一些?；蚋笠恍?。（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低Mr 假定某種微量成分只有一個(gè)，測(cè)出其百分含量后，可用比例式算出最低相對(duì)分子質(zhì)量。 若測(cè)出兩種微量成分的百分含量，分別用比例式算出的最低相對(duì)分子質(zhì)量不相同時(shí)，可計(jì)算兩個(gè)最低相對(duì)分子質(zhì)量近似的最

26、小公倍數(shù)。真實(shí)真實(shí)Mr = 最低最低 Mr n （n 是每個(gè)分子中元素原子的數(shù)目）是每個(gè)分子中元素原子的數(shù)目）舉例：舉例： 1、肌紅蛋白、肌紅蛋白 Fe：0.335% M Fe ：55.8 Mr：16 700 n = 1 2、血紅蛋白、血紅蛋白 Fe：0.335% M Fe ：55.8 最低最低Mr：16 700 別法別法Mr： 68 000 n= 4 真實(shí)真實(shí)Mr：16 700 466 800氨基酸的定量分析表明牛血清清蛋白含有氨基酸的定量分析表明牛血清清蛋白含有0.58%的色氨酸（色氨酸的相對(duì)分子質(zhì)量為的色氨酸（色氨酸的相對(duì)分子質(zhì)量為204）。）。（1）試計(jì)算牛血清清蛋白的最小相對(duì)分子質(zhì)量

27、）試計(jì)算牛血清清蛋白的最小相對(duì)分子質(zhì)量（假設(shè)每個(gè)蛋白分子只含有一個(gè)色氨酸殘基）。（假設(shè)每個(gè)蛋白分子只含有一個(gè)色氨酸殘基）。 （2）凝膠過(guò)濾測(cè)得的牛血清清蛋白的相對(duì)分子）凝膠過(guò)濾測(cè)得的牛血清清蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為質(zhì)量為70 000, 試問(wèn)牛血清清蛋白分子含有幾個(gè)試問(wèn)牛血清清蛋白分子含有幾個(gè)色氨酸殘基？色氨酸殘基？解：解： (1) 0.58:100=204:Mr, Mr=204x100/0.58=35172.41 (2) 70 000/35172.412l半透膜半透膜（semipermeab1e membrane）l滲透壓（滲透壓（osmotic pressure）l理想溶液中，溶液理想溶液中，溶

28、液的滲透壓與溶質(zhì)濃的滲透壓與溶質(zhì)濃度的關(guān)系可用范托度的關(guān)系可用范托夫（夫（vant Hoff）公）公式表示：式表示：滲透壓滲透壓半透膜半透膜溶劑溶劑蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶液溶液 =nRT/V=(g/Mr)RT/V 即即 = ( g / V ) RT / Mr = c R T / Mrl式中式中中滲透壓中滲透壓(N/m2即即Pa)lV是溶液體積是溶液體積(m3)，n是溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù)；是溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù)；lg是溶質(zhì)的質(zhì)量是溶質(zhì)的質(zhì)量(g)；c是溶質(zhì)的濃度是溶質(zhì)的濃度(g/ m3)；lT是絕對(duì)溫度是絕對(duì)溫度(K)；lR是氣體常數(shù)是氣體常數(shù) 8.314J/(Kmol)；lMr是溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量或稱摩爾

29、質(zhì)量是溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量或稱摩爾質(zhì)量(g/mol)。l從上式看出，理想溶液中滲透壓是濃度的線性函數(shù)，從上式看出，理想溶液中滲透壓是濃度的線性函數(shù)，實(shí)際的高分子溶液與濃度之間不是簡(jiǎn)單的實(shí)際的高分子溶液與濃度之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系線性關(guān)系。在濃度不大時(shí)，它們的關(guān)系用下式表示：在濃度不大時(shí)，它們的關(guān)系用下式表示：l用稀釋法（外延法）：利用滲透壓的測(cè)定來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)Mr時(shí)，實(shí)際上都是測(cè)定幾個(gè)不同濃度的滲透壓，以/c對(duì)c作圖并外推到蛋白質(zhì)濃度為0時(shí)所得截距，即 lim/c值，代入公式求出Mr.l對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量10 000至100 000范圍的蛋白質(zhì)利用滲透壓法估算其Mr，可以給出可靠的結(jié)果= RT(cM

30、r+ Kc2) c=RTMr+ KcMr=RTLim/cc 0l利用超速離心機(jī)測(cè)定蛋白質(zhì)或其他生物大分子利用超速離心機(jī)測(cè)定蛋白質(zhì)或其他生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量，常用的有兩種方法：的相對(duì)分子質(zhì)量，常用的有兩種方法：一種是沉降速率法（一種是沉降速率法（sedimentation velocity），），另一種是沉降平衡法（另一種是沉降平衡法（sedimentation equilibrium）。）。被認(rèn)為是最準(zhǔn)確可靠的方法被認(rèn)為是最準(zhǔn)確可靠的方法基本原理： 離心力（centrifugal force，F(xiàn)c）： 當(dāng)一個(gè)粒子（生物大分子或細(xì)胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時(shí)，此離心力“Fc”由下式定義

31、： F = ma = m2 2 r a 粒子旋轉(zhuǎn)的加速度， m 沉降粒子的有效質(zhì)量，粒子旋轉(zhuǎn)的角速度， r粒子的旋轉(zhuǎn)半徑( cm )。 相對(duì)離心力（relative centrifugal force，RCF）: 由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字g”表示離心力，只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。RCF就是實(shí)際離心場(chǎng)轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。 X X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（revolutions per m

32、inute,簡(jiǎn)寫成r/min,或rpm）。22 沉降系數(shù)（sedimentation coefficient，s）： 1924年Svedberg對(duì)沉降系數(shù)下的定義為顆粒在單位離心力場(chǎng)中移動(dòng)的速度。 若用2n/60表示，則 X1：離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2：離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。S：沉降系數(shù)，時(shí)常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫S，量綱為秒。 例如，動(dòng)物原生質(zhì)核糖體的沉降系數(shù)等于80S，它的含義就是：8010-13s。細(xì)胞及細(xì)胞的各組分的沉降系數(shù)有很大的差異，所以可以利用生物樣品沉降系數(shù)的差異采用離心技術(shù)將他們彼此分開(kāi)。 4.沉降系數(shù)與物質(zhì)相

33、對(duì)分子質(zhì)量: 根據(jù)Svedberg公式，由沉降系數(shù)可以計(jì)算出物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量： Mr=RTsMr=RTs20,W/D/D20,W20,W(1-(1-) Mr:相對(duì)分子質(zhì)量； D20,W：以20的水為介質(zhì)時(shí)顆粒的擴(kuò)散系數(shù)； R:氣體常數(shù)； T：絕對(duì)溫度； s20,W：以20的水為介質(zhì)時(shí)顆粒的沉降系數(shù)； ：偏微比容，等于溶質(zhì)粒子密度的倒數(shù)； ：溶劑密度 l利用凝膠過(guò)濾（gel filtration）可以把蛋白質(zhì)混合物按分子的大小分離開(kāi)來(lái)。這種方法比較簡(jiǎn)便，不要求復(fù)雜的儀器就能相當(dāng)精確地測(cè)出蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量l如果某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體具有相同的過(guò)柱速度即相同的洗脫體積，則認(rèn)為這種蛋白質(zhì)

34、具有與此球體相同的半徑，稱蛋白質(zhì)分子的斯托克半徑 當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過(guò)凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，向下移動(dòng)的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對(duì)分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。 若以組分的洗脫體積(Ve)對(duì)組分相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lgMr)作圖，可得一曲線，其中主要部分成直線關(guān)系。以此為標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以通過(guò)測(cè)定某一未知組分的洗脫體積，而從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得其相對(duì)分子質(zhì)量。在實(shí)際應(yīng)用中多以相對(duì)洗脫體積Kav (Kav=Ve/Vt) 對(duì)lgMr作曲線，稱為選擇曲線，

35、曲線的斜率說(shuō)明凝膠的特性。每一類型的化合物，如球蛋白類、右旋糖酐類、酶與清蛋白類等都有各自特定的選擇曲線。測(cè)定時(shí)，未知相對(duì)分子質(zhì)量的組分應(yīng)位于直線部分為宜。若不在直線部分，可選用另一種凝膠重新試驗(yàn)。logMr洗脫體積（洗脫體積（mL）ABCCBA未未 知知洗洗脫脫體體積積與與Mr的的關(guān)關(guān)系系測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量一般用交聯(lián)葡聚測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量一般用交聯(lián)葡聚糖，糖，Sephadex。如如Sephadex G-75(300080 000), G-100(4000150 000)l電泳時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒在各種介質(zhì)中的遷移率決電泳時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒在各種介質(zhì)中的遷移率決定于它所帶的定于它所帶的凈電荷凈電

36、荷以及以及分子大小分子大小和和形狀形狀等因等因素素lSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳1967年年Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉（SDS）和少量巰基乙醇）和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的，則蛋白質(zhì)分子的電電泳遷移率泳遷移率（e1ectrophoretic mobility）主要取）主要取決于它的決于它的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量，而與原來(lái)所帶的電荷，而與原來(lái)所帶的電荷和分子形狀無(wú)關(guān)和分子形狀無(wú)關(guān)l在一定條件下，在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比

37、為1.4克克SDSl克蛋白質(zhì)，相當(dāng)于每克蛋白質(zhì)，相當(dāng)于每?jī)蓚€(gè)氨基酸兩個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子。分子。 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合：與蛋白質(zhì)的結(jié)合：l第一第一，由于，由于SDS是陰離子，使多肽鏈覆蓋上是陰離子，使多肽鏈覆蓋上相同密度的相同密度的負(fù)電荷負(fù)電荷，該電荷量遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因，該電荷量遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，結(jié)果所有的而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，結(jié)果所有的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體，電泳時(shí)都以同樣的電荷蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)合體，電泳時(shí)都以同樣的電荷蛋白質(zhì)比向正極移動(dòng)。比向正極移動(dòng)。l第二第二，改變了蛋白質(zhì)單體分子的，改變了

38、蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象構(gòu)象，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)蛋白質(zhì)復(fù)合體在水溶液中的形狀被認(rèn)為是近似合體在水溶液中的形狀被認(rèn)為是近似雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒棒，不同蛋白質(zhì)的，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合體的短軸長(zhǎng)度（直徑）都是復(fù)合體的短軸長(zhǎng)度（直徑）都是一樣的約為一樣的約為1.8nm，而長(zhǎng)軸長(zhǎng)度則隨蛋白質(zhì)的相對(duì)分子，而長(zhǎng)軸長(zhǎng)度則隨蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量成正比例變化質(zhì)量成正比例變化la和和b 、 K1 和和 K2都是常數(shù)都是常數(shù)l以幾種相對(duì)分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的以幾種相對(duì)分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Mr的的對(duì)數(shù)值對(duì)對(duì)數(shù)值對(duì)R作圖，根據(jù)待測(cè)樣品的作圖，根據(jù)待測(cè)樣品的R ，從，從其標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出分子量其標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出

39、分子量logMr =a - bR 或或logMr =K1 K2R R= 樣品遷移距離樣品遷移距離前沿（染料）遷移距離前沿（染料）遷移距離l對(duì)某一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，在某一對(duì)某一種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，在某一pH，它所帶的正電荷，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一與負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pH稱為稱為蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)等電點(diǎn) l沒(méi)有其他鹽類干擾時(shí)，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來(lái)的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的pH稱為等離子點(diǎn)（isoionic point），等離子點(diǎn)是蛋白質(zhì)的一個(gè)特征常數(shù)蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)偏酸溶液中帶正電荷，在偏蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液

40、中帶負(fù)電荷，在等電點(diǎn)堿溶液中帶負(fù)電荷，在等電點(diǎn)pH時(shí)為兩性離子。時(shí)為兩性離子。電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。分子大電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶電荷的正負(fù)性和多少不小不同的蛋白質(zhì)所帶電荷的正負(fù)性和多少不同，遷移率即異，在電泳時(shí)可以分開(kāi)。同，遷移率即異，在電泳時(shí)可以分開(kāi)。 自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。泳。1. 區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。 （1）紙上電泳：用濾紙作支持物。）紙上電泳：用濾

41、紙作支持物。-+（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤電泳：在玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。）圓盤電泳：在玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。+ 2）平板電泳：在鋪有凝膠的玻板上進(jìn)）平板電泳：在鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳。行的電泳。等電聚焦電泳等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。荷為零，在電場(chǎng)中不再移動(dòng)。+5.06.07.0穩(wěn)定穩(wěn)定pH梯度梯度5.06.07.0穩(wěn)定穩(wěn)定pH梯度梯度通電通電+三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成由

42、于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1-1-100nm100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征?？扇苄缘念w粒，因而具有膠體溶液的特征?？扇苄缘鞍踪|(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對(duì)水蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對(duì)水有很高的親和性，通過(guò)水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面有很高的親和性，通過(guò)水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層形成一層水化層水化層，同時(shí)這些顆粒帶有，同時(shí)這些顆粒帶有電荷電荷，因而蛋，因而蛋白質(zhì)溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的親水膠體。白質(zhì)溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的親水膠體。+ 蛋白質(zhì)透析法蛋白質(zhì)透析法: :利用蛋白質(zhì)不能透過(guò)半透膜的的性質(zhì)利用蛋白質(zhì)不能透過(guò)半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋

43、再置于流，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析滲出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中水中，小分子雜質(zhì)被透析滲出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達(dá)到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析（，以達(dá)到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析（dialysisdialysis）。）。布郎運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過(guò)半透膜，布郎運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過(guò)半透膜，具有吸附能力具有吸附能力蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化）；）表面形成水膜（水化）； 2）帶相同電荷。）帶相同電荷。四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等

44、電點(diǎn)如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層（狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水消除相同電荷，除去水膜膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。沉淀。 加高濃度鹽類（鹽析、鹽溶）加高濃度鹽類（鹽析、鹽溶） 1. 加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出鹽析加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出鹽析 分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。血清球蛋白液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。 加有機(jī)溶劑加有機(jī)溶劑 加重金屬鹽加重金

45、屬鹽 加某些酸類和生物堿試劑加某些酸類和生物堿試劑 單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。 5. 加熱變性沉淀加熱變性沉淀制備有活性的蛋白質(zhì)應(yīng)注意的問(wèn)題制備有活性的蛋白質(zhì)應(yīng)注意的問(wèn)題 五、蛋白質(zhì)變性與復(fù)性五、蛋白質(zhì)變性與復(fù)性 蛋白質(zhì)各自所特有的高級(jí)結(jié)構(gòu)，是表現(xiàn)其物蛋白質(zhì)各自所特有的高級(jí)結(jié)構(gòu)，是表現(xiàn)其物理性質(zhì)和化學(xué)特性以及生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。理性質(zhì)和化學(xué)特性以及生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。 當(dāng)天然蛋白質(zhì)受到某些物理因素和化學(xué)因素當(dāng)天然蛋白質(zhì)受到某些物理因素和化學(xué)因素的影響，其分子內(nèi)部原有的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生變化，的影響，其分

46、子內(nèi)部原有的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生變化，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能都隨之改變或喪蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能都隨之改變或喪失，但并未導(dǎo)致其一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這種現(xiàn)象稱失，但并未導(dǎo)致其一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這種現(xiàn)象稱為為變性變性（denaturationdenaturation）。）。 l天然蛋白質(zhì)分子因環(huán)境的種種關(guān)系，天然蛋白質(zhì)分子因環(huán)境的種種關(guān)系，從有序從有序而緊密的結(jié)構(gòu)，變?yōu)闊o(wú)序而松散的結(jié)構(gòu)而緊密的結(jié)構(gòu)，變?yōu)闊o(wú)序而松散的結(jié)構(gòu)，這，這就是就是變性變性。l他認(rèn)為他認(rèn)為天然蛋白質(zhì)的緊密結(jié)構(gòu)以及晶體結(jié)構(gòu)天然蛋白質(zhì)的緊密結(jié)構(gòu)以及晶體結(jié)構(gòu)是由分子中的次級(jí)鍵維系的，所以容易被物是由分子中的次級(jí)鍵維系的，所以容易被物理的

47、和化學(xué)的因素所破壞。理的和化學(xué)的因素所破壞。l這種觀點(diǎn)基本上反映了這種觀點(diǎn)基本上反映了蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)。蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)。1、生物活性喪失（、生物活性喪失（Inactivation）2、一些側(cè)鏈基團(tuán)暴露、一些側(cè)鏈基團(tuán)暴露3、蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)改變、蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)改變 易沉淀（熱變性、酸變性等）易沉淀（熱變性、酸變性等） 堿、脲、鹽酸胍變性（溶解性很好）堿、脲、鹽酸胍變性（溶解性很好） 粘度增加、擴(kuò)散系數(shù)降低粘度增加、擴(kuò)散系數(shù)降低 CD、紫外、熒光發(fā)射光譜等發(fā)生明顯變化、紫外、熒光發(fā)射光譜等發(fā)生明顯變化4、生物化學(xué)性質(zhì)改變、生物化學(xué)性質(zhì)改變 易被蛋白質(zhì)水解易被蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)變性過(guò)程將導(dǎo)

48、致蛋白質(zhì)變性過(guò)程將導(dǎo)致變性蛋白質(zhì)分子互相凝集為固體的現(xiàn)象稱變性蛋白質(zhì)分子互相凝集為固體的現(xiàn)象稱凝固凝固。應(yīng)用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰應(yīng)用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老老 蛋白質(zhì)的變性作用如果不過(guò)于劇烈，則是一蛋白質(zhì)的變性作用如果不過(guò)于劇烈，則是一種可逆過(guò)程。種可逆過(guò)程。 變性蛋白質(zhì)在除去變性因素后，可緩慢地重變性蛋白質(zhì)在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來(lái)的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)新自發(fā)折疊成原來(lái)的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的和生物活性，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性復(fù)性（renaturationrenaturation）。）。1.（寧波大學(xué)（寧波大

49、學(xué)2005年）什么是蛋白質(zhì)變性作用？年）什么是蛋白質(zhì)變性作用？引起蛋白質(zhì)變性的因素有哪些？引起蛋白質(zhì)變性的因素有哪些？解析：主要明確蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)：空間結(jié)構(gòu)解析：主要明確蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)：空間結(jié)構(gòu)的破壞而引起的生物學(xué)活性、物理化學(xué)性質(zhì)的的破壞而引起的生物學(xué)活性、物理化學(xué)性質(zhì)的改變。改變。反應(yīng)名稱反應(yīng)名稱試試 劑劑顏色顏色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)有此反應(yīng)的有此反應(yīng)的蛋白質(zhì)或氨蛋白質(zhì)或氨基酸基酸雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫色或粉紅紫色或粉紅色色二個(gè)以上肽鍵二個(gè)以上肽鍵所有蛋白質(zhì)所有蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)米倫反應(yīng)H g ( N O 2 ) 2 、H g ( N O3)2及及HNO2混合物混合

50、物紅色紅色 Tyr黃色反應(yīng)黃色反應(yīng)濃濃HNO3及及NH3黃色、橘色黃色、橘色 Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)乙醛酸反應(yīng)(Hopking-Cole反反應(yīng)應(yīng))乙醛酸試劑及濃乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色紫色 Trp坂口反應(yīng)坂口反應(yīng)(Sakaguchi反應(yīng)反應(yīng))-萘酚、萘酚、NaClO紅色紅色胍基胍基Arg酚試劑反應(yīng)酚試劑反應(yīng)(Folin-Cioculteu反反應(yīng)應(yīng))堿性堿性CuSO4及磷及磷鎢酸鎢酸-鉬酸鉬酸藍(lán)色藍(lán)色酚基、吲哚基酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)茚三酮茚三酮藍(lán)色藍(lán)色自由氨基及羧基自由氨基及羧基-氨基酸氨基酸 六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)OHN七、蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜七、蛋白

51、質(zhì)的紫外吸收光譜 蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（區(qū)（200-230nm200-230nm）有較）有較大的吸收，在大的吸收，在280nm280nm有有一特征吸收峰，可利一特征吸收峰，可利用這一特性對(duì)蛋白質(zhì)用這一特性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。進(jìn)行定性定量分析。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm - 0.76A1cm280 260測(cè)定范圍：測(cè)定范圍：0.10.5mg/mll蛋白質(zhì)純化的總目標(biāo)是增加制品的純度（purity）或比活（specific activity），以增加單位蛋白質(zhì)重量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性（比活常以活力單位數(shù)/克蛋白質(zhì)表示）。設(shè)法除去變性的

52、和不要的蛋白質(zhì)，并且希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。1.前處理 要選擇合適的材料;合適的破碎方法;合適的提取液。2.粗分級(jí)分離 要方法簡(jiǎn)便，處理量大。常用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法，有時(shí)可用超過(guò)濾或凝膠過(guò)濾等方法。3.細(xì)分級(jí)分離 主要使用各種層析、電泳，方法要精心選擇，巧妙配合。后期可用結(jié)晶法。l根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的下列性質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)的方法：分子大小溶解度電荷吸附性質(zhì)對(duì)配體分子的生物學(xué)親和力等（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1.透析和超濾(1)透析 透析是把待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸餾水或緩沖液）中進(jìn)行的，透析液可以更換，直至透析袋內(nèi)無(wú)機(jī)鹽等小分子

53、物質(zhì)降到最小值為止。 原理：利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽、單糖等分開(kāi)。 磁力攪拌器磁棒透析液蛋白質(zhì)溶液半透膜袋2.超濾： 利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的。 超濾是一種膜分離技術(shù)，它的特點(diǎn)是使用不對(duì)稱多孔膜根據(jù)分子的大小來(lái)分離溶液中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)。超濾尤其適用于大分子溶液的濃縮、不同種類分子的純化以及溶劑交換等。超濾法是一種溫和、非變性的物理方法，比其它分離方法有效率更高、更靈活的優(yōu)點(diǎn)。原理： 在外力作用下，超濾膜對(duì)大分子物質(zhì)的截留主要是篩分作用，決定截留效果的主要是膜的表面活性

54、層上孔的大小與形狀。除了篩分作用外，膜表面、微孔內(nèi)的吸附和粒子在膜孔中的滯留也使大分子被截留。 現(xiàn)在已有各種市售的超濾膜裝置可供選用，有加壓、抽濾和離心等多種形式。濾膜也有多種規(guī)格，他們截留相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)。使用中最需注意的問(wèn)題是濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，使超濾速度減慢，能被截留物質(zhì)的Mr變小。圖 7-6 利用壓力和離心力的超過(guò)濾濾膜抽氣離心離心超濾的主要應(yīng)用： 濃縮：使用超濾來(lái)增加所需大分子溶質(zhì)的濃度，即大分子被超濾膜截留而小分子和溶劑可自由通過(guò)，從而達(dá)到濃縮的目的。 梯度分離：按分子大小梯度分離樣品中的溶質(zhì)分子時(shí)，超濾是一種經(jīng)濟(jì)有效的方法，適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量相差10倍以上

55、的分子組分。在超濾過(guò)程中，雖然截留的大分子被濃縮，但濾過(guò)的溶質(zhì)分子仍保持初始的濃度。 脫鹽純化：脫鹽即從大分子溶液中去除鹽、非水性溶劑和小分子物質(zhì)的過(guò)程。通過(guò)溶劑交換，可最有效地去除溶液中的小分子物質(zhì)，并逐漸分離純化出大分子物質(zhì)。具體方法為：在溶液進(jìn)行超濾的同時(shí)，不斷向溶液中補(bǔ)充溶劑，補(bǔ)充溶劑的速度與溶液濾過(guò)速度相同，使體系始終保持恒定，這種方法又稱透析超濾法。l介質(zhì)：蔗糖、氯化銫、聚蔗糖（Ficoll)、葡聚糖等滴加樣品4%8%12%16%20%是根據(jù)分子大小分離混合物最有效的方法之一。（1）凝膠過(guò)濾的介質(zhì) 凝膠的交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。Q定了凝膠的分級(jí)分離范圍（fractionation

56、range） 排阻極限（exc1usion limit）來(lái)表示分級(jí)分離范圍的上限，它被定義為不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠珠微孔的最小分子的Mr，例如sephdex G-50的排阻極限是30 000。 凝膠的粒度與洗脫流速和分辨率有關(guān)。顆粒通常用篩眼數(shù)或目數(shù)（mesh size）或珠直徑（um）表示。凝膠過(guò)濾層析的基本原理水化的凝膠顆粒凝膠過(guò)濾 當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過(guò)凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，向下移動(dòng)的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對(duì)分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。

57、 樣品中各組分的流出順序，可用分配系數(shù)Ka來(lái)量度： Ka=(Ve-Vo)/ViKa=(Ve-Vo)/Vi 式中Ve：為洗脫體積(elution volume)，表示某一組分從層析柱洗出到最高峰出現(xiàn)時(shí)，所需的洗脫液體積；Vo：外體積(outer volume)，為層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積。 Vi：內(nèi)體積(inner volume)，為層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部微孔的體積。 當(dāng)某組分的Ka=0時(shí)(即Ve=Vo)，說(shuō)明該組分完全不進(jìn)入凝膠顆粒微孔，洗脫時(shí)最先流出。 若某組分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)時(shí)，說(shuō)明該組分可自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的微孔中，洗脫時(shí)，最后流出。 Ka在0-1之間的組分，

58、洗脫時(shí)Ka值小的先流出 ，Ka值大的后流出。 (二) 利用溶解度差別的純化方法1.等電點(diǎn)沉淀和pH控制 利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以及不同的蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)一這特性，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。 在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零，消除了分子間的靜電斥力，但由于水膜的存在，蛋白質(zhì)仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等電沉淀法經(jīng)常與鹽析法或有機(jī)溶劑沉淀法聯(lián)合使用。 單獨(dú)使用等電點(diǎn)法主要是用于去除等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。在加酸或加堿調(diào)節(jié)pH的過(guò)程中，要一邊攪拌一邊慢慢加入，以防止局部過(guò)酸或過(guò)堿 。pH溶解度（蛋白mg/ml）NaCI該圖說(shuō)明：該圖說(shuō)明：（1）b b- -乳球蛋

59、乳球蛋白的溶解度在白的溶解度在其等電點(diǎn)其等電點(diǎn) (pH5.25.3)時(shí)時(shí)達(dá)到最低值，達(dá)到最低值，在等電點(diǎn)兩側(cè)在等電點(diǎn)兩側(cè)的的pH下，其溶下，其溶解度迅速提高；解度迅速提高；（2）NaCl濃濃度對(duì)度對(duì)pH與溶解與溶解度的關(guān)系無(wú)多度的關(guān)系無(wú)多大影響大影響2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析 定義：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶； 原因：主要由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白分子彼此排斥，而蛋白分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng) 當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。在同一濃度的鹽溶液中，

60、不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達(dá)到彼此分離的目的。 原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚積并從溶液中析出。離子強(qiáng)度（I）Log（溶解度）在等電時(shí)，中性鹽（K2SO4)對(duì)一氧化碳血紅蛋白的溶解度的影響 鹽能夠改變蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強(qiáng)度有密切關(guān)系。兩者的關(guān)系可用下式表示： lglg（S/SoS/So）= -KsI= -KsI S為蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為I時(shí)的溶解度(g/L)；So為蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為0時(shí)的溶解度；Ks為鹽析常數(shù)；I為離子強(qiáng)度。 在溫度一定的條件下，某一蛋白質(zhì)在某一pH值的水溶液中的溶解度為一常數(shù)So。故上式可改寫