蛋白質(zhì)的化學二ppt課件

1、第三章第三章 蛋白質(zhì)的化學蛋白質(zhì)的化學( (二二) )海洋學院制藥工程系齊興柱蛋白質(zhì)的構(gòu)造蛋白質(zhì)的構(gòu)造 蛋白質(zhì)構(gòu)造是經(jīng)過四種程度描畫的：一級構(gòu)造、二級構(gòu)造、三級構(gòu)造和四級構(gòu)造。 一級構(gòu)造-Ala-Glu-Val-Thr-Asp-Pro-Gly- 二級構(gòu)造 四級構(gòu)造 三級構(gòu)造三級構(gòu)造蛋白質(zhì)構(gòu)造的主要層次一級構(gòu)造二級構(gòu)造三級構(gòu)造四級構(gòu)造超二級構(gòu)造構(gòu)造域 一級構(gòu)造一級構(gòu)造(primary structure)二級構(gòu)造二級構(gòu)造(secondary structure)超二級構(gòu)造和構(gòu)造域超二級構(gòu)造和構(gòu)造域三級構(gòu)造三級構(gòu)造(tertiary structure)四級構(gòu)造四級構(gòu)造(quaternary st

2、ructure)高級高級構(gòu)造構(gòu)造闡明：1.實踐上在二級構(gòu)造和三級構(gòu)造之間還有超二級構(gòu)造和構(gòu)造域2個構(gòu)造層次。2.不是一切蛋白質(zhì)都有四級構(gòu)造3. 二、三、四級構(gòu)造都是空間立體構(gòu)造4.蛋白質(zhì)越復雜，其空間立體構(gòu)造也越復雜第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)的一級構(gòu)造蛋白質(zhì)的一級構(gòu)造Primary structurePrimary structure( (一一).).定義：蛋白質(zhì)的一級構(gòu)造指多肽鏈中氨基酸的陳定義：蛋白質(zhì)的一級構(gòu)造指多肽鏈中氨基酸的陳列順序列順序, ,又稱為共價構(gòu)造或根本化學構(gòu)造。又稱為共價構(gòu)造或根本化學構(gòu)造。維持蛋白質(zhì)一級構(gòu)造的作用力，即主要的化學鍵有：維持蛋白質(zhì)一級構(gòu)造的作用力，即主要的化學鍵有

3、：肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。 二硫鍵：由多肽鏈二硫鍵：由多肽鏈2個半胱氨酸殘基的側(cè)鏈的個半胱氨酸殘基的側(cè)鏈的-SH基之間構(gòu)成基之間構(gòu)成CH CCH2NOHSSCH CCH2NOHCH CCH2NOHSHSHCH CCH2NOH二肽鍵與肽鏈二肽鍵與肽鏈1.肽鍵酰胺鍵：一個氨基酸的肽鍵酰胺鍵：一個氨基酸的-COOH 和相鄰的另一個和相鄰的另一個氨基酸的氨基酸的-NH2脫水構(gòu)成共價鍵。如以下圖：脫水構(gòu)成共價鍵。如以下圖：CH COOH +R1H2NCH COOHR2H2NCH CR1H2NOCH COOHR2NHH2OH2O肽鍵和肽的構(gòu)造肽鍵和肽的構(gòu)造2. 氨基酸借

4、肽鍵銜接起來叫肽，肽是一大類物質(zhì)氨基酸借肽鍵銜接起來叫肽，肽是一大類物質(zhì).1肽的命名：某氨基酰某氨基酰肽的命名：某氨基酰某氨基酰某氨基酸某氨基酸2二肽；寡肽；多肽二肽；寡肽；多肽3氨基酸借肽鍵連生長鏈，稱為肽鏈，肽鏈兩端有自在氨基酸借肽鍵連生長鏈，稱為肽鏈，肽鏈兩端有自在-NH2和和-COOH，自在，自在-NH2端稱為端稱為N-末端氨基末端自末端氨基末端自在在-COOH端稱為端稱為C-末端羧基末端；末端羧基末端； 4構(gòu)成肽鏈的氨基酸已殘缺不全，稱為氨基酸殘基；構(gòu)成肽鏈的氨基酸已殘缺不全，稱為氨基酸殘基； 5肽鏈中的氨基酸的陳列順序，普通肽鏈中的氨基酸的陳列順序，普通-NH2端開場，由端開場，由

5、N指向指向C，即多肽鏈有方向性，即多肽鏈有方向性，N端為頭，端為頭，C端為尾。普通端為尾。普通習慣把氨基寫在左端，羧基寫在右端習慣把氨基寫在左端，羧基寫在右端;留意氨基酸殘基順留意氨基酸殘基順序的差別：如：甘序的差別：如：甘-丙；丙丙；丙-甘。甘。CH CR1H2NOCH COOHR2NHC肽鍵的酰胺氮和羰基氧之間發(fā)生共振相互肽鍵的酰胺氮和羰基氧之間發(fā)生共振相互作用產(chǎn)生幾個重要結(jié)果作用產(chǎn)生幾個重要結(jié)果: :1.1.肽鍵的本質(zhì)是介于圖肽鍵的本質(zhì)是介于圖A A、B B兩種極端方式兩種極端方式的平均中間態(tài)，即圖的平均中間態(tài)，即圖C C，所以肽鍵具有部，所以肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)。分雙鍵的性質(zhì)。2.2

6、.限制繞肽鍵的自在旋轉(zhuǎn)限制繞肽鍵的自在旋轉(zhuǎn)3.3.組成肽基的組成肽基的4 4個原子和個原子和2 2個相鄰的個相鄰的CC原原子傾向于共平面子傾向于共平面, ,稱酰胺平面或肽平面稱酰胺平面或肽平面. .第二第二 節(jié)節(jié) 天然活性肽天然活性肽自然界中有自在存在的活性肽，主要有：自然界中有自在存在的活性肽，主要有：1. 谷胱甘肽谷胱甘肽GSH：三肽：三肽Glu-Cys-Gly，廣泛存在于，廣泛存在于生物細胞中，含有自在的巰基，具有很強的復原性，可作生物細胞中，含有自在的巰基，具有很強的復原性，可作為體內(nèi)重要的復原劑，維護某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基為體內(nèi)重要的復原劑，維護某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化

7、，使它們處于活性形狀。免遭氧化，使它們處于活性形狀。 CHCH2CH2COOHCOH2NCHCH2SHCOHNCH2 COOHHN -谷氨酰谷氨酰半胱氨酰半胱氨酰甘氨酸甘氨酸谷胱甘肽谷胱甘肽復原性復原性谷胱甘肽的生理功能非常廣泛，其主要功能有：谷胱甘肽的生理功能非常廣泛，其主要功能有：(1)(1)去除自在基、過氧化物、重金屬及黃曲霉去除自在基、過氧化物、重金屬及黃曲霉 毒素等毒物；毒素等毒物；(2)(2)參與氨基酸參與氨基酸( (谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中性氨基酸谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中性氨基酸) )的轉(zhuǎn)運；的轉(zhuǎn)運；(3)(3)利于鐵的利于鐵的 吸收、硒的吸收、鈣的吸收，谷胱甘肽還可以使飼料

8、中的過氧吸收、硒的吸收、鈣的吸收，谷胱甘肽還可以使飼料中的過氧化脂肪酸在吸收時或吸收后恢復化脂肪酸在吸收時或吸收后恢復 為正常的脂肪；為正常的脂肪；(4)(4)維護胃腸道黏膜上皮，維護胃腸道黏膜上皮，防止因炎癥、部分缺血、氧化物質(zhì)等對腸黏膜的損防止因炎癥、部分缺血、氧化物質(zhì)等對腸黏膜的損 傷；傷；(5)(5)儲存并提供其組成氨基酸儲存并提供其組成氨基酸(1(1尤其是半胱氧酸尤其是半胱氧酸) )；(6)(6)參與蛋白質(zhì)和參與蛋白質(zhì)和DNADNA的合成的合成; ;(7)(7)作為作為 復原物質(zhì)，利于維生素復原物質(zhì)，利于維生素E E、維生素、維生素c c的復原，維持巰基酶活性，并可的復原，維持巰基酶

9、活性，并可作為甘油醛磷酸脫氫酶的輔作為甘油醛磷酸脫氫酶的輔 基，也是乙二醛酶、磷酸丙糖脫氫酶的輔酶；基，也是乙二醛酶、磷酸丙糖脫氫酶的輔酶；(8)(8)谷胱甘肽在免疫系統(tǒng)抗感染和炎癥反響中發(fā)谷胱甘肽在免疫系統(tǒng)抗感染和炎癥反響中發(fā) 揮著重要作用，它對于淋巴揮著重要作用，它對于淋巴細胞增殖及正常功能的發(fā)揚起著重要的作用；細胞增殖及正常功能的發(fā)揚起著重要的作用；(9)(9)參與胰島素的代參與胰島素的代 謝，一降低雌激素、前列腺素、白細胞三烯的活性；謝，一降低雌激素、前列腺素、白細胞三烯的活性；(10)(10)作為抗癌、抗腫瘤及治療艾滋病的輔助藥物。作為抗癌、抗腫瘤及治療艾滋病的輔助藥物。 2.2.促

10、甲狀腺素釋放激素：三肽焦谷氨酰組氨酰脯氨促甲狀腺素釋放激素：三肽焦谷氨酰組氨酰脯氨酸，可促進甲狀腺素的釋放。酸，可促進甲狀腺素的釋放。 3.3.短桿菌素短桿菌素S S：環(huán)十肽，含有：環(huán)十肽，含有D-D-苯丙氨酸、鳥氨酸，對革苯丙氨酸、鳥氨酸，對革蘭氏陰性細菌有破壞作用，主要作用于細胞膜。蘭氏陰性細菌有破壞作用，主要作用于細胞膜。 4.4.青霉素：含有青霉素：含有DD半胱氨酸和半胱氨酸和DD纈氨酸的二肽衍生物纈氨酸的二肽衍生物 。主要破壞細菌的細胞壁粘肽的合成引起溶菌。主要破壞細菌的細胞壁粘肽的合成引起溶菌。 5.5.牛催產(chǎn)素與加壓素：均為九肽，分子中含有一對二硫鍵，牛催產(chǎn)素與加壓素：均為九肽，

11、分子中含有一對二硫鍵，兩者構(gòu)造類似。前者第九位為兩者構(gòu)造類似。前者第九位為GlyGly或或LysLys或或PhePhe，后者為，后者為ArgArg。前者可刺激子宮的收縮，促進分娩。后者可促進小動脈收縮，前者可刺激子宮的收縮，促進分娩。后者可促進小動脈收縮，使血壓升高，也有抗利尿作用，參與水、鹽代謝的調(diào)理。使血壓升高，也有抗利尿作用，參與水、鹽代謝的調(diào)理。 牛催產(chǎn)素牛催產(chǎn)素 : S S CysTyrIleGlnAsnCysProLeuGly-NH2牛加壓素牛加壓素 :7.7.腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用。腦啡肽：為五肽，具有鎮(zhèn)痛作用。 S S CysTyrPheGlnAsnCysProAryGl

12、y-NH26.舒緩激肽：促進血管舒張，促進水、鈉離子的排出。舒緩激肽：促進血管舒張，促進水、鈉離子的排出。據(jù)路透社安康新聞2019年3月24日紐約訊研討人員在本周一召開的美國化學協(xié)會年會上報告說，由葡萄糖、麥芽糖或者麥芽三糖這樣的糖類與神經(jīng)肽結(jié)合構(gòu)成糖基化腦啡肽在藥效方面是嗎啡的兩到三倍，而不具備其它一些呵斥運用者成癮的特性 來自Arizona大學的Robin Polt引見了如何將這種簡單的糖分子與神經(jīng)肽相結(jié)合，這類糖基化腦啡肽與嗎啡一樣可以穿透血腦屏障。Polt通知路透社記者說，糖基化腦啡肽的效果非常特異，不僅在作用方面非常特異，就是在不作用方面也非常特異。他引見說，動物實驗的結(jié)果顯示，這類

13、化合物并不會呵斥嗎啡運用后的欣快感，但是它的鎮(zhèn)痛效果卻是嗎啡的兩到三倍。來自Arizona大學的Robin Polt引見了如何將這種簡單的糖分子與神經(jīng)肽相結(jié)合，這類糖基化腦啡肽與嗎啡一樣可以穿透血腦屏障。第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)的一級構(gòu)造研討蛋白質(zhì)的一級構(gòu)造研討 蛋白質(zhì)與多肽并無嚴厲的界限，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。 Sanger Sanger簡介簡介 Sanger Sanger 英國劍橋大學英國劍橋大學 2 2次獲諾貝爾獎次獲諾貝爾獎19581958， 198019801. 確定胰島素分子的一級構(gòu)造確定胰島素分子的一級構(gòu)造 2. 雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法DNA序列分

14、序列分析析F.Frederick Sanger (1918)國生物化學家。1918年 8月13日生于格洛斯特郡倫德庫姆。曾在劍橋大學學習化學，1943年以研討賴氨酸的課題獲博士學位。曾任英國醫(yī)學委員會分子生物學研討所蛋白質(zhì)化學實驗室主任。1954年中選為英國皇家學會會員?，F(xiàn)任劍橋大學教授。桑格在50年代以前，主要研討蛋白質(zhì)的構(gòu)造。經(jīng)過多年的研討，找到一種試劑，名為2，4二硝基氟化苯桑格試劑，用以測定胰島素的分子構(gòu)造，獲得勝利。后經(jīng)10年的努力，運用逐段分解和逐漸遞增的方法，測定出胰島素兩條肽鏈分別含21個和30個氨基酸的陳列順序和位置，于1955年測定了胰島素的一級構(gòu)造，因此獲1958年諾貝爾

15、化學獎。60年代后，桑格的任務轉(zhuǎn)向核酸方面，努力于對核糖核酸和脫氧核糖核酸構(gòu)造的分析研討。他利用酶的生物活性，用生物學的處置方法，正確地確定了核糖核酸中每種堿基的陳列順序和脫氧核糖核酸中核苷酸的陳列順序。他還開展了脫氧核糖核酸的準確快速分析法。他用此法于1977年勝利地測定了細菌病毒-174脫氧核糖核酸分子的全部共5386個核苷酸的陳列順序。桑格因設計出一種測定 DNA內(nèi)核苷酸陳列順序的方法而與W.吉爾伯特、P.伯格共獲1980年諾貝爾化學獎。 N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶蛋白質(zhì)一級構(gòu)造的存在有三種方式蛋白質(zhì)一級構(gòu)造的存在有三種方式:1.無分支的開鏈多肽無分支的開鏈多肽;2.有

16、分支的開鏈多肽有分支的開鏈多肽;3.環(huán)狀多肽環(huán)狀多肽蛋白質(zhì)一級構(gòu)造的測定1. 1.測定蛋白質(zhì)一級構(gòu)造的要求：測定蛋白質(zhì)一級構(gòu)造的要求：a a、樣品必需是均一的，純度應在、樣品必需是均一的，純度應在97%97%以以上；上；b b、知道蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，其誤差允許、知道蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，其誤差允許在在10%10%左右；左右； 2. 測定一級構(gòu)造的根本原理和方法根本戰(zhàn)略： 氨基酸順序直測法片段重疊法 根本步驟：(1)測定末端氨基酸數(shù)目，確定蛋白質(zhì)分子是由幾條肽鏈構(gòu)成的；(2)拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈，斷開多肽鏈內(nèi)二硫鍵并分別出每條肽鏈。(3)將肽鏈完全水解，測定每條多肽鏈的氨基酸組成(4)鑒定多肽鏈N

17、末端、C末端氨基酸殘基 (5)至少用兩種方法將多肽鏈水解成較小的片段； (6)分別并測定各肽段的氨基酸序列；(7)片段重疊法重建完好多肽鏈一級構(gòu)造； (8)確定半胱氨酸殘基間構(gòu)成二硫鍵交聯(lián)橋的位置。將肽段順序進展疊聯(lián)以確定完好的順序?qū)㈦亩雾樞蜻M展疊聯(lián)以確定完好的順序 將肽段分別并測出順序?qū)㈦亩畏謩e并測出順序?qū)Ｗ⑿粤呀鈱Ｗ⑿粤呀饽┒税被釡y定末端氨基酸測定二硫鍵拆開二硫鍵拆開純蛋白質(zhì)純蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)順序測定根本方法道路1、測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 經(jīng)過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與 之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。2、拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈，斷開多肽鏈內(nèi)二硫鍵胰島素胰島素 -巰基乙?guī)€基乙醇醇碘乙

18、酸碘乙酸二硫鍵的斷裂 幾條多肽鏈經(jīng)過二硫鍵交聯(lián)在一同。可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇(復原法)處置，使二硫鍵復原為巰基，然后用烷基化試劑ICH2COOH維護生成的巰基，以防止它重新被氧化。3、分析每一條多肽鏈的氨基酸組成 經(jīng)分別、純化的多肽鏈一部分樣品進展完全水解，測定它的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比或各種殘基的數(shù)目。4、鑒定多肽鏈N末端、C末端氨基酸殘基 Sanger法二硝基氟苯反響 DNS法丹磺酰氯反響 Edman法異硫氰酸苯脂反響 氨肽酶法 肼解法 羧肽酶法 LiBH4復原法N端C端(1) Sanger法法 DNFB 二硝基氟苯反響二硝基氟苯

19、反響黃色:根據(jù)它在薄層層析或紙電泳中的遷移特性進展鑒定DNFB+NCCR3ONCCR1ONCCR2OHHHHHH2NCCR5ONCCR4OHHHHO2NO2NFO2NO2NFNCCR3ONCCR1ONCCR2OHHHHHHNCCR5ONCCR4OHHHHHClO2NO2NNCR1HHCOOH+other amino acidsDNP-amino acid在弱堿中發(fā)生親核芳環(huán)取代反響在弱堿中發(fā)生親核芳環(huán)取代反響l中中多肽多肽(2) DNS法丹磺酰氯法丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯)反響反響-HCl+氨基酸混合物水解水解多肽多肽多肽多肽DNS-DNS-氨基酸氨基酸具有熒光(3)Edma

20、n法異硫氰酸苯脂反響PITC無無N-N-端氨基的剩余部分端氨基的剩余部分用層析法分別(4) 氨肽酶法從多肽鏈的N末端依次向內(nèi)切 NH2 -aa-aa-aa-aa. 據(jù)一定時間內(nèi)釋放出的AA的數(shù)量和種類來推測. C-未端的測定方法1.肼解法 是目前最好的方法 用色譜法鑒定 多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其他的氨基酸那么變成肼化物。肼化物可以與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分別。 注:末端假設為半胱氨酸、天冬酰胺、精氨酸在肼解過程中易被破壞。CH CR1H2NOCH CRn-1OH2NCH COOHRnNHNH2H2N+NHNH2CH CR1H2NONHCH

21、 CRn-1ONHCONHCH COOHRnNH2NH2無水無水100 n-1個氨基酸酰肼個氨基酸酰肼C-末端氨基酸末端氨基酸氨基酸酰肼可與苯甲醛反響生成沉淀，與氨基酸酰肼可與苯甲醛反響生成沉淀，與C-末端氨基末端氨基酸分別酸分別3.LiBH4復原法 多肽+ LiBH4 水解 -氨基醇+ n氨基酸含C端氨基酸,用層析法鑒定2. 羧肽酶的方法 是目前最有效也是最常用的方法。 羧肽酶是一類肽鏈外切酶，它專注地從肽鏈的C端依次切下一個氨基酸殘基，釋放出游離的氨基酸。據(jù)一定時間內(nèi)切下的數(shù)量來測氨基酸的數(shù)量。酶解法：如胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶化學法：如溴化氰法 羥胺法5、裂解多肽鏈成較小的片段胰蛋白酶胰蛋

22、白酶NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1 R1=LysR1=Lys和和ArgArg側(cè)鏈側(cè)鏈( (即即LysLys和和ArgArg的羧基的羧基參與構(gòu)成的參與構(gòu)成的肽鍵肽鍵) )專注專注性較強，水性較強，水解速度快。解速度快。 R2=ProR2=Pro時抑時抑制水解制水解NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1糜蛋白酶糜蛋白酶 或稱胰凝乳蛋白酶：或稱胰凝乳蛋白酶： R1=Phe,Trp,TyrR1=Phe,Trp,Tyr時時水解快水解快; ; R1= LeuR1= Leu，MetMet和和HisHis水解稍慢。水解稍慢。 R2=ProR2=Pro

23、時抑制水解時抑制水解NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1胃蛋白酶胃蛋白酶 R1R1和和R2R2Phe, Trp, Phe, Trp, Tyr; LeuTyr; Leu以及其它以及其它疏水性氨基酸水解疏水性氨基酸水解速度較快。速度較快。 R1=Pro R1=Pro 水解受抑水解受抑 最適最適PH=2PH=2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1嗜熱菌蛋白酶嗜熱菌蛋白酶 R2=Phe, Trp, Tyr; LeuR2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, MetIle, Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速以及其它疏水性強的氨基酸水解

24、速度較快。度較快。 R2=ProR2=Pro或或Gly Gly 水解受抑。水解受抑。 R1R1或或R3=Pro R3=Pro 水解受抑。水解受抑?；瘜W法：可獲得較大的肽段溴化氰水解法：它能選擇性地切割由甲硫氨酸Met的羧基所構(gòu)成的肽鍵。羥胺NH2OH：專注性斷裂-Asn-Gly-之間的肽鍵。也能部分裂解-Asn-Leu-之間的肽鍵以及-Asn-Ala-之間的肽鍵。6、測定各肽段的氨基酸序列根本方法： Sanger法 Edman降解法 DNS-Edman測序法蛋白質(zhì)順序儀測序Edman化學降解法化學降解法N= C=S +CH CR1H2NOCH CR2HNOHN肽肽PH=9NHCCH CR1HN

25、OCH CR2HNOHN肽肽S第一步第一步 偶聯(lián)反響：偶聯(lián)反響：PTC-肽苯氨基硫甲酰肽肽苯氨基硫甲酰肽第二步第二步 環(huán)化斷裂反響：環(huán)化斷裂反響：CF3COOH強酸性強酸性無水無水NHCCHR1HNC=OS+CHR2H3NOHN肽肽C+ATZ噻唑啉酮苯胺噻唑啉酮苯胺減少一個殘基的肽減少一個殘基的肽N CCH CR1HNOCH CR2HNOHN肽肽SPTC-肽肽H第三步第三步 環(huán)化反響：環(huán)化反響：NHCCHR1HNC=OS+ATZH2O1mol/L HClNHCCH CR1HNOOHSPTC-氨基酸氨基酸NC=CHR1NHO = CSPTH-氨基酸苯乙內(nèi)酰硫脲氨基酸氨基酸苯乙內(nèi)酰硫脲氨基酸注：注

26、：1. PTH-氨基酸可用各種層析技術(shù)分別氨基酸可用各種層析技術(shù)分別. 2. 反響的多肽的羧基與不溶性樹脂偶聯(lián)，這樣多肽掛在反響的多肽的羧基與不溶性樹脂偶聯(lián)，這樣多肽掛在樹脂上，便于前一輪反響后剩下多肽的回收。樹脂上，便于前一輪反響后剩下多肽的回收。7、片段重疊法重建完好多肽鏈一級構(gòu)造 所得資料： 氨基末端殘基 H 羧基末端殘基 S 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO末端殘基 H S末端肽段 HOWT APS第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推斷全順序

27、 HOWTOUSEO VERLAPS借助重疊法確定肽段次序：8、確定半胱氨酸殘基間構(gòu)成二硫鍵的位置 蛋白質(zhì)一級構(gòu)造的順序測定完成后，將未拆開二硫鍵的同一種蛋白質(zhì)再一次進展專注性的酶解，由此就可以確定完好的蛋白質(zhì)中二硫鍵的位置。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。1 1、采用胃蛋白酶水解：切點多，生成、采用胃蛋白酶水解：切點多，生成的肽段包括含二硫鍵的肽段都比較?。坏碾亩伟ê蜴I的肽段都比較?。凰嵝原h(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換，二硫酸性環(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換，二硫鍵穩(wěn)定。鍵穩(wěn)定。2 2、將所得的肽段利用對角線電泳技術(shù)、將所得的肽段利用對角線電泳技術(shù)進展分別。進展分別。3 3

28、、然后同其它方法分析的肽段進展比、然后同其它方法分析的肽段進展比較，確定二硫鍵的位置。較，確定二硫鍵的位置。對角線電泳： 把水解的混合肽段點到濾紙中央，在pH6.5的條件下，進展第一向電泳，肽段將按其大小及電荷的不同別分開來。然后把濾紙暴露在過甲酸蒸氣中，使-S-S-斷裂。這時每個含二硫鍵的肽段被氧化成一對含半胱氨磺酸的肽。濾紙旋轉(zhuǎn)90度角在與第一向完全一樣的條件下進展第二向電泳。在這里，大多數(shù)肽段的遷移率未變，并將位于濾紙的一條對角線上，而含半胱氨磺酸的肽段比原來含二硫鍵的肽小而負電荷添加，結(jié)果它們都偏離了對角線。肽斑可用茚三酮顯色確定。+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay對角線電泳圖解對角線電泳圖解pH6.5pH6.5圖中圖中a a、b b兩個斑點是兩個斑點是由一個