染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)終

1、姓名學(xué)號(hào)201322401001320132250100142013224010040染色質(zhì)免疫沉淀法 功能基因組學(xué)（Functional genomics）研究?jī)?nèi)容是人類基因組DNA序列變異性研究、基因組表達(dá)調(diào)控的研究、陌生生物體的研究和生物信息學(xué)的研究等。目前功能基因組學(xué)的研究策略包括以下4個(gè)方面：1）建立表達(dá)圖譜 2） 隨機(jī)突變篩選 3） 定向誘變 4）生物信息學(xué)研究.經(jīng)典的技術(shù)在大量未知基因的研究中具有局限性，目前，一些新技術(shù)包括生物芯片、基因敲除(knock out)、 轉(zhuǎn)基因（knock in）、RNA干擾（RNAi）以及蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的各種技術(shù)，在功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮越來越重

2、要的作用。本文就近幾年來功能基因組學(xué)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）方法的一些進(jìn)展作簡(jiǎn)單介紹?！靖拍睢?染色質(zhì)免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）是研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的重要工具1。它可以靈敏地檢測(cè)目標(biāo)蛋白與特異DNA片段的結(jié)合情況，還可以用來研究組蛋白與基因表達(dá)的關(guān)系。核小體組蛋白可以發(fā)生多種翻譯后的共價(jià)修飾，如乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化等，這些共價(jià)修飾與真核基因的表達(dá)密切相關(guān)。根據(jù)“組蛋白密碼”假說，組蛋白的各種共價(jià)修飾的組合會(huì)以協(xié)同或拮抗的方式誘導(dǎo)特異的下游生物學(xué)功能，因此，ChIP也為研究組蛋白修飾在基因表達(dá)中的作用，全面闡明真核

3、基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了強(qiáng)有力的研究工具?！颈尘啊?真核生物細(xì)胞狀態(tài)是由內(nèi)源和外源因素共同影響的，所有信號(hào)傳遞途徑的終點(diǎn)都是DNA。DNA通過核蛋白復(fù)合物組成染色質(zhì)，染色質(zhì)是基因調(diào)控的一個(gè)重要作用位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄激活因子和輔助抑制因子的研究顯示存在一種新的調(diào)節(jié)機(jī)制-“組蛋白密碼”，其信息存在于組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾等過程中。該類修飾包括組蛋白磷酸化、乙?；?、甲基化、ADP-核糖基化等過程。隨著越來越多組蛋白核心結(jié)構(gòu)區(qū)域和羧端修飾的確定，組蛋白密碼在控制和調(diào)節(jié)基因功能過程中的作用越來越明確。參與修飾的酶根據(jù)其作用的不同而分類：如組氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）可以將乙酰基團(tuán)轉(zhuǎn)到組蛋白上；組蛋白去乙酰酶（HDA

4、Cs）可以去除氨基酸上的乙?；鶊F(tuán)；組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMTs）可以將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到組蛋白上等不同組氨酸修飾標(biāo)記對(duì)應(yīng)于不同的生物學(xué)過程，它可以作為調(diào)節(jié)因子的作用位點(diǎn)，也可以用來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)2。【原理】 染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChiP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息12?！緝?yōu)點(diǎn)】染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChIP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序

5、列上的調(diào)控蛋白，是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的一種很好的方法。ChIP技術(shù)和芯片技術(shù)的結(jié)合有利于確定全基因組范圍內(nèi)染色體蛋白的分布模式以及組蛋白修飾情況2。ChIP基本試劑盒和特定蛋白質(zhì)抗體結(jié)合完成一個(gè)染色質(zhì)免疫沉淀分析。CHIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且，CHIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)；RNA-CHIP用于研

6、究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見，隨著CHIP的進(jìn)一步完善，它必將會(huì)在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用3?！静蛔恪緾hIP 技術(shù)也有一定的局限性：第一，該技術(shù)需要抗目的蛋白或者特殊修飾標(biāo)簽的高度特異性抗體。第二，假陰性信號(hào)可能源于無效的抗體結(jié)合或者在交聯(lián)過程中抗原受到干擾，例如, ChIP實(shí)驗(yàn)抗體品質(zhì)較差往往容易造成非特異性DNA沉淀, 產(chǎn)生高背景和假陽(yáng)性。第三，甲醛固定可能是暫時(shí)的，甚至是非特異的，可能導(dǎo)致相鄰的蛋白形成假陽(yáng)性信號(hào)。第四，難以同時(shí)得到多個(gè)蛋白質(zhì)對(duì)同一序列結(jié)合的信息等4。ChIP實(shí)驗(yàn)只能鑒定出轉(zhuǎn)錄因子在很短時(shí)間處于結(jié)合態(tài)的DNA序列。由于受眾多因素的干擾, 使得部

7、分蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA難以被ChIP捕獲。第五, 結(jié)合位點(diǎn)與功能的不對(duì)等性、結(jié)合位點(diǎn)與靶基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系不確定性以及二代測(cè)序技術(shù)普遍的讀段較短等問題都對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的深入挖掘造成一定影響5。 【應(yīng)用】該技術(shù)主要應(yīng)用于5：1.組蛋白修飾酶的抗體作為“生物標(biāo)記” 2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析 3.藥物開發(fā)研究 4.有絲分裂研究 5.DNA損失與凋亡分析【研究進(jìn)展】 ChIP 方法能研究DNA 甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同結(jié)合5，或者從預(yù)測(cè)的靶基因中確定直接的靶位點(diǎn)6。ChIP 技術(shù)和其它分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合（例如普通PCR6-11，實(shí)時(shí)定量PCR12，基因克隆，DNA 微陣列或者更直接的高通量

8、測(cè)序技術(shù)），已經(jīng)被用于確定轉(zhuǎn)錄因子和DNA 的相互作用13 或轉(zhuǎn)錄因子新的基因組靶位點(diǎn)。最初，ChIP 應(yīng)用于哺乳動(dòng)物14、酵母15、果蠅16染色質(zhì)的研究上；近年來，應(yīng)用在相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和修飾后組蛋白位置等方面的研究方面16。ChIP 技術(shù)還能用于研究蛋白和蛋白之間的相互作用，如通過酵母雙雜交和ChIP 證實(shí)了DELLA 蛋白與PIF3 蛋白之間的相互作用17?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Yu Y, Chen Y, Kim B, Wang H, Zhao C, He X, et al. Olig2 targets chromatin remodelers to enhancers to initiate o

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