微生物遺傳與分子生物學

1、微生物遺傳與分子生物學（5*15+1*25=100分）本課程主要涉及到微生物中主要的模式菌株:原核微生物: 放線菌(鏈霉菌),大腸桿菌,芽孢桿菌,乳酸菌，古菌等。真核微生物：漢遜酵母，釀酒酵母，白念珠菌等。第1章 概論基因的符號：每個基因：如色氨酸基因trp；同一表型的不同基因：如trpA或trpB等。當染色體上發(fā)生缺失時可用表示（如trpA或trpA）；基因突變：如亮氨酸缺陷型leu-；抗藥性基因：r表示抗性，加s表示敏感如鏈霉素抗性基因表示為strr，敏感基因表示為strs。1、 微生物基因突變一般分幾種類型,突變有什么生物學意義?（譚老師）基因突變可從突變發(fā)生方式和突變引起的表型改變和遺

2、傳物質改變等方面進行分類。按突變體表型特征的不同，可把突變分為以下4個類型:1). 形態(tài)突變型2). 生化突變型3). 致死突變型:按突變所引起的遺傳信息的改變，又可把突變分為：1). 錯義突變 2). 同義突變3). 無義突變 根據(jù)遺傳物質的結構改變，可分為堿基置換、移碼、DNA片段插入和缺失。根據(jù)突變發(fā)生的方式，可分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。突變的生物學意義：基因突變導致了基因表達出來的性狀發(fā)生了改變，對突變個體本身來講，絕大多數(shù)是有害的，因為現(xiàn)有的生物基本上都適應了現(xiàn)在的環(huán)境。但是環(huán)境是可變的，如果生物不變，那就很可能被淘汰。所以，對整個生物群體來說，突變使群體不會滅亡。環(huán)境不斷改變，生物通

3、過不斷突變而適應, 也就使其被保存下來。最終，物種的面貌特征與祖先不同，所以說，突變是生物進化的內因，是進化的主要動力。 無數(shù)事實說明了一個真理，即宇宙間的所有物種變是絕對的，不變則是相對的。2、 應用于鏈霉菌基因組編輯與大片段DNA克隆的技術都有哪些？能否用在你們今后的實驗中？（劉鋼老師） 基因組編輯是指在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術。原理是構建一個人工內切酶，在預定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內的DNA修復系統(tǒng)修復過程中會產(chǎn)生突變，從而達到改造基因組的目的。鏈霉菌基因組編輯有：l I-SecI endonuclease介導的同源重組系統(tǒng)：敲除質粒上含有一串

4、聯(lián)的與靶片段左右臂同源的兩個DNA片段以及I-SecI識別的18個堿基的位點（sceS）。將該質粒導入鏈霉菌細胞，并通過抗性篩選質粒插入到基因組上的克隆。如果發(fā)生同源單交換，該質粒將被完整導入基因組靶位點。通過誘導表達SecI，SecI在18個堿基的位點（sceS）切斷基因組DNA，菌體不能夠存活。如果發(fā)生同源雙交換， sceS被刪除，即使誘導表達SecI也不會造成基因組DNA的斷裂，菌體仍然存活，并表現(xiàn)出抗性敏感。l CRISPR-Cas9介導的同源重組系統(tǒng)：首先優(yōu)化cas9的密碼子，將其放置在強啟動子之后并克隆到敲除質粒上，敲除質粒上含有sgRNA并置于組成型啟動子之后， sgRNA中的引

5、導序列為靶位點的同源序列，敲除質粒必須包括靶基因兩側的同源臂。將該質粒導入鏈霉菌，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將靶位點切斷，同時質粒上的同源臂與基因組上的同源臂發(fā)生雙交換，將斷裂的靶基因區(qū)刪除，基因組重新連接。（CRISPR/Cas9系統(tǒng)先切斷靶序列后直接發(fā)生雙交換，最后斷裂的靶基因直接被敲除）l 位點特異性整合酶介導的基因組編輯：（cre/lox系統(tǒng)）利用兩次同源單交換分別將兩個loxP位點整合到目的基因片段的上下游，再將Cre蛋白表達質粒導入鏈霉菌，在Cre蛋白的作用下，兩個loxP位點發(fā)生位點特異性重組，完成目的基因片段的敲除。而環(huán)化的DNA由于不能在鏈霉菌中復制，隨著傳代而丟失。大片段D

6、NA克隆的技術：l 依賴于酵母菌的轉化介導的大片段DNA重組克隆（TAR）l 基于FBT1 attp-attB-int整合系統(tǒng)的鏈霉菌基因組DNA大片段克隆技術：通過結合轉移將質粒pSV:attB6Up導入鏈霉菌，卡那霉素篩選獲得pSV:attB6Up同源整合到目的位置的菌株S-attB6。再將pKC1139:attP6Dn導入S-attB6，在40度培養(yǎng)， pKC1139:attP6Dn通過同源單交換整合到目的位置獲得S-attB6P6。通過結合轉移將含有FBT1整合酶的pIJ10500導入S-attB6P6中，利用整合酶將目的基因簇環(huán)出，并克隆到載體pKC1139上。在今后的實驗中可能會用

7、到： 我們實驗室是分子生物學實驗室，這些技術方法對于我今后的研究室有助益的。我們平時多采用基本的遺傳操作，構建敲除質粒載體，然后導入受體菌株進行同源重組進行單交換，利用抗生素進行篩選，隨后還需要進行雙交換。我們可以考慮使用基因編輯技術來進行遺傳操做。比如應用CRISPR-Cas9介導的同源重組基因編輯技術來使之直接發(fā)生雙交換而直接敲除靶標基因，這樣操作起來并不繁瑣，也省去了些過程，并且對是否發(fā)生雙交換也比較好判斷。3、 作為絲狀細菌的鏈霉菌經(jīng)歷一個怎樣的分化過程？對其自身有何意義？（劉鋼老師）作為絲狀細菌鏈霉菌的分化過程為：1，孢子萌發(fā)形成基質菌絲；2，基質菌絲延伸、分枝；（光禿表型）3，向空

8、氣中生長形成氣生菌絲；4，氣生菌絲產(chǎn)生螺旋和分隔；（白表型）5，分隔加深形成孢子鏈；6，孢子鏈變灰，成熟；（灰表型）7，釋放游離孢子。 鏈霉菌的發(fā)育分化過程中有部分的基質菌絲和未分化成為孢子的氣生菌絲存在有死亡現(xiàn)象，這些菌絲的死亡發(fā)生在鏈霉菌分化過程中的特定時間和區(qū)域。，首先是死亡的菌絲體并未顯示出PCD所特有的表觀特征，其次是死亡的菌絲體并未完全消失，保留的殘體既可以作為機械支撐用于氣生菌絲分化從而脫離培養(yǎng)基表面，同時也可作為水分和營養(yǎng)物質的運輸通道。 對其自身的意義：營養(yǎng)生長階段，基質菌絲經(jīng)過頂端生長和分支，在感受到環(huán)境中的營養(yǎng)限制或者其他壓力后，以應對環(huán)境脅迫，鏈霉菌通過bld基因級聯(lián)信

9、號通路產(chǎn)生疏水分子SapB，從而賦予菌絲表面疏水特性而使其突破培養(yǎng)基表面的氣-水張力進入繁殖性的氣生菌絲階段，然后又通過whi基因等的級聯(lián)信號通路控制下產(chǎn)生孢子，孢子成熟后飄落到適宜的環(huán)境中在進行上述過程生活。這種分化過程可以賦予鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫的能力。進行生殖生長產(chǎn)生氣生菌絲和孢子，成熟孢子隨風或其他生物帶到更加適宜其生活的環(huán)境中，對于鏈霉菌自身是十分重要的生活方式，使之區(qū)別物其他的原核生物，所以這種發(fā)育分化過程對于鏈霉菌自身意義重大。鏈霉菌發(fā)育分化中的細胞死亡過程其生理學意義可能在于：當鏈霉菌在生長過程中感受到環(huán)境中的營養(yǎng)限制或者其它壓力時，通過細胞死亡可為其孢子形成提供營養(yǎng)物質，伴隨著

10、基質菌絲向氣生菌絲的轉變，鏈霉菌通常會在這一時期產(chǎn)生抗生素，這對于鏈霉菌專一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物可能具有重要的意義。鏈霉菌發(fā)育分化和次級代謝產(chǎn)物的合成一般都是起始于對環(huán)境中營養(yǎng)匱乏的感應。4、 鏈霉菌為什么會產(chǎn)生如此多樣性的次級代謝產(chǎn)物？他們對鏈霉菌本身有何意義？（劉鋼老師） 次級代謝產(chǎn)物通常是指不是生物體生長發(fā)育所必需的分子量小于3KDa的小分子物質。越來越多的證據(jù)表明，次級代謝實際上參與了生物體對環(huán)境因子應答等多種生理作用。廣泛意義上的抗生素囊括了幾乎所有的微生物次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物在極低的濃度在生化水平調控微生物的生長過程。 抗生素是逐步合成的代謝產(chǎn)物, 每一步都需要約10

11、 一30 個基因來決定其結構和起自我保護作用抗性基因, 以及控制結構基因活性的調控基因, 并使它們隨特性生存需要給予表達; 這常常與活性營養(yǎng)生長和抱子形成之間的轉變相一致。鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對其本身的意義：當鏈霉菌在生長過程中感受到環(huán)境中的營養(yǎng)限制或者其它壓力時，伴隨著由基質菌絲形成氣生菌絲，菌體周圍的營養(yǎng)物質逐漸被消耗，鏈霉菌開始降解自身的基質菌絲為形成繁殖型的氣生菌絲提供營養(yǎng)，同時各種次級代謝產(chǎn)物（抗生素）開始產(chǎn)生，而次級代謝產(chǎn)物可以幫助鏈霉菌抵御環(huán)境脅迫，從而創(chuàng)造利于自身生活的環(huán)境。這對于鏈霉菌專一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物可能具有重要的意義。這些次級代謝產(chǎn)物在極低的濃度下，可以在生

12、化水平調控微生物的生長過程對菌體的生長也具有重要的生物學意義?？股剡€具有抑制它種微生物生長活動、甚至殺滅它種微生物的能力，這就為鏈霉菌的生活創(chuàng)造了相對較好的條件。5、 調控基因在抗生素生物合成中有何主要功能？ 抗生素生物合成基因簇一般由調控基因、結構基因和相關抗性基因組成，而且這些基因總是成簇排列。在抗生素生物合成中調控基因起到了一個開關的作用, 它可決定一種抗生素能否被合成、什么時候合成和什么時候被終止的精細調控作用。1. 抗生素生物合成的途徑特異性調控：鏈霉菌的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇通常成簇排列，包括一個或多個調控基因，一般只負責調控所在基因簇基因表達的調控稱之為途徑特異性調控。途徑

13、特異性調控蛋白如SARP蛋白，SARP蛋白都含有OmpR類的DNA結合結構域和轉錄激活結構域，通過招募RNA聚合酶到靶基因的啟動子上游激活基因的轉錄。大多數(shù)SARP蛋白都是途徑特異性調控子，一般只調控與其相鄰的基因。2. 全局性調控：相對于鏈霉菌次級代謝中的其他調控模式而言，全局調控是一種更為多樣、普遍、復雜的調控模式。全局調控基因可以調控多條次級代謝途徑。全局性調控蛋白對抗生素生物合成的調控通常是通過直接或間接地調控途徑特異性調控蛋白實施的。而除了調控次級代謝產(chǎn)物的生物合成外，很多全局調控蛋白還控制著鏈霉菌的形態(tài)分化，還有一些能夠調控初級代謝，并成為初級代謝向次級代謝轉換的媒介。Eg. 雙組

14、份信號轉導系統(tǒng)、AdpA3. 抗生素生物合成的自調控-反饋調控和前饋調饋：（抗生素介導的自調控）反饋調控: 指一種微生物代謝反應的終產(chǎn)物在代謝合成過程中對合成基因簇中調控基因或生化反應關鍵酶基因的調控 (如抗生素)。前饋調控：指一種微生物代謝反應的底物或中間物在代謝合成過程中對合成基因簇中調控基因或生化反應關鍵酶基因的調控。l 抗生素作為終產(chǎn)物介導的自調控系統(tǒng)可取代雙組分系統(tǒng)中通過磷酸化作用的應答調控機制，并證明這種新調控機制在微生物次級代謝生物合成中是廣泛存在的。6、 鏈霉菌信號分子有哪幾種類型, GBL類型的信號分子在抗生素生物合成中如何發(fā)揮其功能? 菌群群體反應感應信號分子-當信號分子達

15、到閾值-啟動特定基因表達-改變和協(xié)調細胞間行為使群體呈現(xiàn)某種生理特征。鏈霉菌信號分子的類型：高絲氨酸內酯(HSL)、自誘導肽(AIP)、AI-2、-丁酸內酯(GBL)、DSF、PQS、法尼醇等。目前研究得最多的群體感應系統(tǒng)有以下四種：革蘭氏陰性菌中的?；呓z氨酸內酯(AHL)介導的群體感應系統(tǒng)、革蘭氏陽性菌中的自誘導肽(AIP)介導的群體感應系統(tǒng)、呋喃硼酸二酯結構的AI-2介導的種間群體感應系統(tǒng)和-丁酸內酯(GBL)介導的群體感應系統(tǒng)。GBL類型的信號分子在抗生素生物合成中發(fā)揮功能：鏈霉菌廣泛使用-丁酸內酯（GBL）類化合物作為自調控因子。GBL在胞內合成并分泌到胞外，當達到一定閾值濃度時，能

16、夠被胞內的受體蛋白所感知，從而引起群體反應(抗生素合成或產(chǎn)孢)。信號分子（A因子GBL）的受體蛋白ArpA與多效調空基因adpA的啟動子區(qū)結合, 阻遏了adpA的轉錄。當A因子（GBL）積累到閾值時，它與ArpA結合，使ArpA從adpA上解離，導致adpA有效地進行轉錄。翻譯后的AdpA控制鏈霉素生物合成基因簇中調控基因strR的轉錄, StrR激活strB1開始的這個轉錄單元的基因轉錄, 從而調控鏈霉素的生物合成。7、 有哪些方法或策略可以得到新型抗生素?1. 更多鏈霉菌基因組的測序及挖掘：隨著更多鏈霉菌基因組的不斷完成和信息積累, 為抗生素生物合成基因簇的研究，發(fā)現(xiàn)新型抗生素提供了重要的

17、條件。大量的鏈霉菌尚未測序，這極大地影響了新型抗生素的發(fā)現(xiàn)。每個基因組平均含有20-30個左右次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，大多數(shù)是未知的，這將是發(fā)現(xiàn)新型抗生素的龐大資源。2. 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：微生物只能在適合的條件下生長和繁殖。不同的營養(yǎng)（如不同的碳源和氮源等）條件導致不同的生理代謝。次級代謝產(chǎn)物的生物合成是與前體的提供和相關因子的誘導密切相關的。同時，相關菌株的共同培養(yǎng)可以提供互補的重要物質和信息交流，這為隱性次級代謝基因簇的激活提供了可能的條件。3. 調控子的遺傳操作：隱性次級代謝基因簇在受阻遏和缺乏激活因子的情況下不能得到表達，去除負調控基因的阻遏和構建正調控基因的有效表達是激活隱性次級

18、代謝基因簇表達的策略之一。此外，對轉錄單元中啟動子的替換和定向改造也是隱性次級代謝基因簇激活的有效方法。4. 基因簇的異源表達：為了消除菌株本身的一些限制因素，進行隱性次級代謝基因簇的異源表達也是值得嘗試的方法。5. 信號分子介導的激活：-丁酸內酯（GBL）作為放線菌的信號分子，通過與相應的受體蛋白相互作用，進而激活多種次級代謝產(chǎn)物的生物合成。除GBL外, 在抗生素生物合成中信號分子具有多樣性和多效性, 如抗生素本身可作為信號分子, ATP和肌醇等可作為信號分子參與抗生素的生物合成和形態(tài)分化的分子調控。發(fā)現(xiàn)新信號分子，研究其在抗生素產(chǎn)生和種間交流中的作用機制；同時可用于激活隱性基因簇；探索抗生

19、素作為信號分子在自然生境中的生物學功能。6. 核糖體工程：在鏈霉菌中，核糖體蛋白S12的突變同樣可以影響抗生素的產(chǎn)量。7. 其他新方法和策略未來可能的突破：以鏈霉菌為模式，進一步闡明抗生素生物合成與調控機制，為提高重要抗生素的產(chǎn)量乃至激活隱基因簇，挖掘新型活性次級代謝產(chǎn)物方面做出創(chuàng)新性的研究成果 ；深入開展抗生素的組合生物合成和合成生物學的研究，突破天然產(chǎn)物合成過程中的瓶頸，獲得在結構和功能上具有突出特點的新型活性化合物。第四章 大腸桿菌 芽孢桿菌 棒桿菌 乳酸菌8、 結合大腸桿菌（致病和非致?。┑募毎Y構特征及其生物大分子的生物合成規(guī)律，簡述若干種藥物研發(fā)的策略。1、藥物研發(fā)策略：生產(chǎn)某種物

20、質，綜合策略： 拓展底物利用能力和范圍（“進”） 加快產(chǎn)物轉到胞外（“出”） 加強目標合成酶活性（“加”） 減少分支合成途徑（“減”） 引入新的合成途徑，或延伸已有途徑（“增”） 改善細胞的耐受性定向遺傳修飾利用大腸桿菌合成相關藥物：A、 大腸桿菌產(chǎn)生蛋白類藥物 ：優(yōu)先選用的蛋白藥物表達宿主，即利用上述的策略來進行定向遺傳改造而合成蛋白類藥物。首先，利用大腸桿菌細胞內的內源質粒，構建包含有目標蛋白質的基因的質粒載體，也可以將其導入到大腸桿菌中通過同源重組過程整合到其染色體上進行穩(wěn)定表達。我們可以改進大腸桿菌的分泌系統(tǒng)，從而加速其產(chǎn)生的生物大分子蛋白質排除體外的效率。從而合成生物大分子蛋白質類藥

21、物。B、 大腸桿菌細胞高產(chǎn)抗癌藥物前體-紫杉醇(taxol)前體taxadiene。Taxol是萜類化合物（三環(huán)二萜），含異戊二烯類單元。天然的大腸桿菌的MEP途徑可合成其中2個前體異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。因此，上游模塊：增加整個MEP途徑的拷貝數(shù)；在染色體中引入T7 RNA 聚合酶，并在限速酶前引入T7啟動子；通過不同質粒的引入和改變啟動子強度來協(xié)調不同基因的拷貝數(shù)以及表達量；將合成酶基因整合到染色體上，減小代謝負擔。下游模塊：改變GGPS和TS兩個合成基因的順序；通過啟動子更換以及改造，協(xié)調基因的表達量；去除代謝抑制子indole。多位點協(xié)調上下游兩個模塊

22、，使前體生物大分子taxadiene的產(chǎn)量提高了約15000倍，達到1.0 g/L 。C、輔因子工程：降低細胞內的能量水平能顯著提高酵解速度。ATP, NADH/NAD+, NADPH/NADP+等輔因子參與很多重要胞內代謝過程，其水平及比例可導致微生物代謝及生理發(fā)生全局變化。與生物大分子的合成相關， NADPH/NADP+增加有利于生物大分子的合成。厭氧高產(chǎn)正丁醇 還原力驅動：產(chǎn)生1*丁醇需要4*還原力改造方法：敲除3個消耗NADH的途徑，使NADH的含量為4； 敲除產(chǎn)生乙酸的途徑，節(jié)約了1分子前體乙酰輔酶A。綜合改造后生物大分子的產(chǎn)量提高了100多倍。作用于致病大腸桿菌的藥物的研發(fā)：D、外

23、排泵的抑制子作為潛在的藥物靶標：TetR類抑制子控制本底水平的外排泵AcrA和AcrB的表達； AraC類的激活子能解除TetR的抑制，使外排泵大量表達； MarR類的抑制子能夠抑制AraC的轉錄，間接影響外排泵表達。抗生素或小分子與抑制子結合，減弱其與靶標DNA的結合，從而解除其對激活子抑制作用，進而促進下游外排泵的高表達。從以上的外排泵的調控方式可以知道，抑制子能夠減弱外排泵的表達，從而降低菌株對藥物的耐受性，使其容易被殺死。例如，篩選能夠結合抑制子RamR的小分子（藥物），使其對激活子RamA的抑制作用加強，從而降低外排泵的表達而降低細菌的抗性。由RamR和小分子復合物結構發(fā)現(xiàn)關鍵殘基P

24、he155，從而有助于篩選與其結合的潛在藥物。D、轉肽酶：這些酶大多是藥物的潛在作用靶點，對其結構-功能的研究是熱點。例如，青霉素可以競爭結合轉肽酶，導致肽橋不能形成而抑制 細胞生長。從而可以篩選其他可以與轉肽酶結合的藥物來開發(fā)新藥物。E、抗生素作用的靶標或抗性菌株突變的位點：例如，萬古霉素作用位點為雙丙氨酰，抑制細胞壁的合成 而其對應的耐藥菌株末尾的丙氨酸突變?yōu)槿樗帷?2、細胞結構特征：細胞內沒有成形的細胞核；含有質粒；基因組或質粒上含有“致病島” 它是一段特殊的DNA片段，包含毒素分泌系統(tǒng)，粘附素等，能夠在菌株和相近種之間轉移。大腸桿菌大部分是無害的，與宿主互利共生。部分通過獲得毒素因子適

25、應新環(huán)境或導致疾病。含有由肽聚糖組成的細胞壁；只含有核糖體簡單的細胞器；革蘭氏陰性(G-)短桿菌, 兩端鈍圓；大小1.0 1.5 m × 2.0 6.0 m；周身鞭毛，能運動，有菌毛。毒性因子：菌毛：大多由質粒編碼，成束狀，起粘附宿主作用。腸毒素：外毒素，分為耐熱和不耐熱。 耐熱型：免疫原性弱，100, 20 min不破壞； 不耐熱型：免疫原性強， 65, 30 min破壞； 類脂A：內毒素，熱穩(wěn)定（ 100, 1 h不破壞）。莢膜多糖：抗吞噬作用3、大腸桿菌生物大分子的生物合成規(guī)律：l 生物大分子主要是指蛋白質、核酸以及高相對分子量的碳氫化合物。與低相對分子量的生物有機化合物相比，

26、生物大分子具有更高級的物質群。它們是由低相對分子量的有機化合物經(jīng)過聚合而成的多分子體系。從化學結構而言，蛋白質是由-L-氨基酸脫水縮合而成的；核酸是由嘌呤和嘧啶堿基與糖D-核糖或2-脫氧-D-核糖、磷酸脫水縮合而成；多糖是由單糖脫水縮合而成。由此可知,由低相對分子量的生物有機化合物變?yōu)樯锎蠓肿拥幕瘜W反應都是脫水縮合反應。l 生物大分子合成前相應基本結構單元需要活化，活化后的分子具有高能量，便于后續(xù)合成反應。Eg. 以葡萄糖為原料合成糖原時需要經(jīng)UTP活化為UDPG，以乙酰-CoA為原料合成脂肪酸需要ACP活化為丙二酰-CoA，以氨基酸為原料合成蛋白質時需tRNA活化為氨酰-tRNA，以核苷酸

27、或脫氧核糖核氨酸（NMP,dNMP）為原料合成核酸時活化為核苷三磷酸(NTP,dNTP)。l 生物大分子的合成都需要酶，都需要溫和的反應條件。9、 Bacillus cereus group的概念，包括哪些種？簡述種內間的聯(lián)系與區(qū)別。Bacillus cereus group均為能夠形成孢子的菌株，基因及基因組序列數(shù)據(jù)顯示其種間密切相關，即染色體具有很高的的相似性和共線性，甚至被認為屬于相同的種，其包含6個不同的種：1) B. cereus sensu stricto: 狹義的蠟狀芽孢桿菌，廣泛存在于土壤中，能引起食品污染，導致人類嘔吐和腹瀉，并且有些菌株能引起軟組織感染的機會致病菌。2) B

28、. anthracis: 可引起炭疽熱，被用于生物武器； 3) B. thuringiensis: 能產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白，被用作重要的微生物殺蟲劑； 4) B. mycoides: 腐生細菌，能夠形成根狀菌落； 5) B. pseudomycoides與B. weihenstephanensis: 放射狀的菌落形態(tài)，脂肪酸的組成與群中其他菌不同； 6) B. cytotoxicus: 最新從蠟狀芽孢桿菌中分離出來，主要與食物中毒有關，在系統(tǒng)發(fā)育關系上與蠟狀芽孢桿菌群里其他成員較遠。Bacillus cereus group種間聯(lián)系與區(qū)分： 雖然Bacillus cereus group種間染色體

29、具有很高的相似性和共線性，但是其包含幾百個菌株，也顯示了很高的基因異質性及菌株特異的基因組適應性，比如有些蠟狀芽胞桿菌具有跟炭疽芽胞桿菌類似的特征，包括其致病性，但是并不含有與后者完全一樣的質粒。 蠟狀芽孢桿菌群種間的區(qū)分依據(jù)： 一般蠟狀芽胞桿菌群不同種之間的主要區(qū)分標志是其表型，特別是對于B. cereus sensu stricto，B. anthracis，B. thuringiensis，這些表型的差異往往由位于質粒上的遺傳物質所決定： a. 炭疽芽孢桿菌引起炭疽熱的毒力因子基因主要位于兩個大質粒上，pXO1和pXO2，這兩個質粒對于炭疽芽胞桿菌的致病至關重要,也是其區(qū)別于其他成員的主

30、要特征。a. 蘇云金芽胞桿菌主要特征是在芽胞形成的同時產(chǎn)生伴胞晶體即-內毒素,而編碼這些晶體蛋白的基因主要位于質粒上。b. 蠟狀芽胞桿菌合成嘔吐毒素的基因位于一個大質粒上。 c. B. cereus group中的質粒：1) 是非常重要的形態(tài)因子，如B. thuringiensis的晶體毒蛋白基因與B. anthracis的炭疽毒素基因均位于質粒元件上。2) B. cereus group中，質粒普遍存在，單個菌種可能含有6個不同的質粒。3) 質粒大小變化也很大，從2kb到大于600kb，且不同菌株的質粒譜型并不總與其系統(tǒng)發(fā)育相匹配。4) 在B. cereus群的進化過程中，質粒是染色體的延伸

31、，質粒和染色體之間基因交換頻繁，有利于菌株得以生存于不同的多變的環(huán)境之中。10、 在芽孢桿菌生物膜形成過程中，最主要的抑制子是什么？簡述其是如何被解除并促進生物膜的形成的。形成生物膜是芽孢桿菌在自然環(huán)境中形成有利條件維持生存的一種群體性行。生物膜形成過程中的最主要抑制子：SinR，它是一個轉錄調控子，可以抑制基質形成基因的表達，也可以促進細胞運動相關基因的表達，因此形成生物膜需抑制SinR蛋白的表達。破解并促進生物膜形成的過程：抗阻遏蛋白SinI可拮抗SinR活性。通過對環(huán)境的感知，芽孢桿菌種控制孢子形成的雙組份信號轉導途徑中磷酸化的應答調控蛋白（RR）轉錄調控子Spo0A可以激活SinI基因

32、表達，從而產(chǎn)生抗阻遏蛋白SinI，通過與SinR的結合來降低SinR濃度，從而使細胞喪失運動性而形成細胞鏈并產(chǎn)生基質，刺激感受態(tài)形成，最終促進生物膜的形成。11、 簡述芽孢桿菌感受態(tài)形成過程中關鍵調控子ComK的作用（降解及釋放的過程）。 感受態(tài)的形成主要包括三個過程：群感效應系統(tǒng)，主要調控子ComK的激活，ComK激活下游感受態(tài)相關基因。在B. subtilis感受態(tài)形成過程中DNA結合、攝取及重組相關基因的轉錄都是受到感受態(tài)調控子ComK的調控，ComK直接或間接調控的基因多達100個。1 ComK的自激活循環(huán)ComK的自激活循環(huán)是形成感受態(tài)的關鍵步驟，ComK以二聚體組成的四聚物形式結合

33、于各啟動子上，激活下游基因轉錄，包括自身基因。2 ComK的抑制： ComK在自激活循環(huán)后，轉錄被激活并翻譯ComK，但是合成的ComK與MecA結合， MecA募集ComK結合到蛋白酶ClpCP，使ComK被降解，從而無法調控感受態(tài)的形成。3 ComK的釋放： 群感效應信號分子ComX及CSF可以促使ComAP的水平升高， ComAP能夠促進表面活性素surfactin基因簇的轉錄，而位于此基因簇上的comS同時被轉錄。ComS是46個氨基酸的小肽，可以與MecA結合使ComK從ComK / MecA /ClpC復合物上釋放，而ComS及MecA被ClpCP降解。 4 ComK激活下游基因：

34、當ComK濃度足夠高，ComK可激活DNA攝取基因（comC,-E,-G,-F)、DNA整合基因（recA，addAB）及自身基因comk的表達。綜上所述，ComK在感受態(tài)的形成過程中起到了承上啟下的作用。12、 簡述納豆激酶產(chǎn)品開發(fā)的實驗設計思路。納豆激酶(NK)是芽孢桿菌分泌酶: 可溶解血纖維蛋白，有顯著的溶栓的作用，具有廣闊的開發(fā)前景。通過枯草芽孢桿菌培養(yǎng)，利用(NH4)2SO4沉淀、Sephadex G100柱層析對該酶發(fā)酵液進行分離純化，已經(jīng)分離純化出了枯草芽孢桿菌溶栓酶。 納豆激酶產(chǎn)品開發(fā)實驗設計思路：納豆激酶的產(chǎn)品開發(fā)是以納豆為原料，接種納豆芽孢桿菌，對其進行發(fā)酵，分離純化而得到

35、的。納豆激酶的分離純化粗提方法即是將發(fā)酵液或納豆浸提液離心取上清，用硫酸銨或乙醇沉淀，再經(jīng)離心除去上清液中的粘性物質，離心后取沉淀，溶于緩沖液中即為粗酶液。隨后將粗酶液進行精提，將粗酶液進行脫鹽，離子交換，柱層析，透析，最后冷凍干燥制得酶干粉?？梢岳梅肿由飳W技術在L.lactis中表達納豆激酶：這種方式大大加快了納豆激酶的生產(chǎn)效率。在乳酸菌中表達 nisK/R（納豆激酶基因）, 目的基因用nisA 啟動子控制，在nisin作為誘導物誘導時目的基因表達。這個誘導表達系統(tǒng)稱為NICE系統(tǒng)。此系統(tǒng)可嚴謹控制、高效表達，是很成熟的乳酸菌外源基因表達系統(tǒng)。Nisin是食品級的安全誘導物，可直接應用的

36、食品中；少量nisin即可誘導外源基因的表達。 首先，構建含有納豆激酶基因的質粒載體，將質粒載體導入到L.lactis中，在培養(yǎng)液中加入淡豆豉，誘導納豆激酶的表達。最后優(yōu)化培養(yǎng)條件，最終得到商品化的納豆激酶產(chǎn)品。最終，納豆激酶的分離純化過程比較繁瑣，但目前并沒有特別簡易的方法，有研究者研究過以下方法：鹽析法分離提純納豆激酶，超濾法分離提純納豆激酶等，但我覺得這些方法就目前的研究水平還不適合大規(guī)模生產(chǎn)的應用。13、 B. subtilis分泌蛋白有哪4種不同途徑，簡述每種途徑分泌蛋白過程及所分泌蛋白特點。B. subtilis分泌蛋白有四種不同途徑蛋白特點及分泌過程： l Sec-SRP coo

37、peration pathway: 絕大多數(shù)蛋白通過Sec-SRP 途徑運輸；轉運未折疊的蛋白質。 B. subtilis中最主要的蛋白質分泌途徑，可以分為3個功能階段：蛋白定位：分泌蛋白首先由核糖體合成前體，前體蛋白在N-端含有信號肽；細胞質分子伴侶可以幫助前體蛋白保持能夠被遷移的狀態(tài)； SRP與信號肽相互識別，將前體定位于膜上的Sec易位酶復合物。蛋白易位：信號肽帶正電荷的N-domain與膜上負電荷的磷脂相互作用，導致H-domain彎曲地插入膜上，當H-domain變直之后，前體蛋白的第一部分被拉至胞外。蛋白的折疊及釋放：在易位過程中或易位之后的瞬間，信號肽被type I Spases

38、切除，使成熟肽從Sec易位酶復合物上釋放；最后，胞外分子伴侶參與分泌蛋白的折疊及質量控制。l twin-arginine translocation (Tat)pathway: 相較于Sec-SRP 途徑，Tat 途徑可以從B.subtilis的細胞質轉運緊密折疊的蛋白甚至多聚酶復合物到培養(yǎng)基中。分泌蛋白至培養(yǎng)基、細胞壁及插入蛋白至細胞質膜。Tat 途徑的信號肽：轉運已折疊好的蛋白。Tat 途徑的蛋白分泌過程：Ø具有RR/KR類型信號肽的前體蛋白在易位之前可以在輔因子的幫助下在細胞質中折疊； Ø前體蛋白可以通過Tat蛋白復合物(Tat易位酶)組成的通道而穿過細胞質膜； &#

39、216;在轉運的過程中，經(jīng)過信號肽酶和細胞壁通道的加工，折疊的成熟蛋白分泌至培養(yǎng)基中。l ATP-binding cassette (ABC) transporters: 在真核、原核生物中發(fā)現(xiàn)，既可輸出也可輸入各種分子，如離子、氨基酸、肽、抗生素、多糖及蛋白質等。1) 與核糖體合成的羊毛硫細菌素(lantibiotics)和信息素(pheromone)合成有關2) lantibiotics or pheromones的信號肽叫做前導肽，lantibiotics的前導肽大概有23-30個氨基酸殘基，與lantibiotics的翻譯后修飾有關。l pseudopilin export pathw

40、ay: 感受態(tài)形成相關。假菌毛蛋白通過Com系統(tǒng)運輸。14、 Bt菌株在孢子形成期及營養(yǎng)生長期分別形成哪些不同的殺蟲毒素，簡述Cry蛋白殺蟲機制。Bt 在生長代謝過程中可產(chǎn)生多種對昆蟲有致病性的殺蟲毒素： l 在孢子形成開始和穩(wěn)定生長期：Bt菌株合成 Cry和 Cyt 毒素，即-內毒素或伴孢晶體毒素； l 在營養(yǎng)生長期：Bt 菌株也可以合成其他的殺蟲蛋白，這些蛋白會被分泌至培養(yǎng)基中，并被定義為Vip和Sip。Vip與Sip毒素都顯示了對一些鞘翅目昆蟲的殺蟲活性。Cry（伴孢晶體）蛋白殺蟲機制：孔洞形成模型Step1：在堿性的昆蟲幼蟲中腸，可溶的非活性復合物Cry1A被蛋白酶消化，形成活性的蛋白

41、酶抗性的三域結構的單體； Step2: Cry1A低親和力、大量地結合被GPI錨定受體錨定在膜脂上的APN和ALP受體，這種結合方式促進了活性toxins定位與富集；Step3-4：與鈣粘素受體的結合促進了N-末端helix 1的蛋白切除； Step5：N-末端的切除誘導了前孔洞寡聚物的形成并且增強了寡聚物與GPI錨定在膜脂上的APN和ALP受體的親和力； Step6：寡聚物插入細胞膜，導致孔洞形成與細胞裂解。最終使害蟲無法存活，達到殺蟲的目的。15、 結合谷氨酸棒桿菌中谷氨酸生物合成途徑、代謝調控、基因組轉錄組信息及其對環(huán)境的響應機制，闡述提高谷氨酸產(chǎn)量的可能途徑或方法。谷氨酸生物合成途徑以

42、及代謝途徑：谷氨酸生物合成：三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生-酮戊二酸，當-KGA（ -酮戊二酸）脫氫酶酶活性微弱或喪失時， -酮戊二酸會在NADPH和NH4+ 在谷氨酸脫氫酶作用下，合成谷氨酸，而不會生成琥珀酸，脫離三羧酸循環(huán)而生成谷氨酸，最后透過細胞膜分泌到胞外。內在因素谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征 l 具有CO2 固定反應的酶系：菌種能利用CO2產(chǎn)生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸大量積累。 l -KGA（ -酮戊二酸）脫氫酶酶活性微弱或喪失：這是菌體生成并積累-KGA的關鍵。-KGA是菌體進行TCA循環(huán)的中間性產(chǎn)物，很快在-KGA脫氫酶的作用下氧化脫羧生成琥珀酸輔酶A，在正常的微生物體內濃度很低，只有當體內-K

43、GA脫氫酶活性很低時，TCA循環(huán)才能夠減弱，-KGA才得以積累，為谷氨酸的生成奠定物質基礎。 l 谷氨酸產(chǎn)生菌體內的NADPH氧化能力欠缺或喪失：NADPH是-KGA還原氨基化生成谷氨酸的必須物質，該還原氨基化所需要的NADPH與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián)。 由于NADPH的氧化能力欠缺或喪失，使得體內的NADPH有一定積累，NADPH對于抑制-KGA的脫羧氧化有一定的意義。 l 菌體有強烈的L-谷氨酸脫氫酶活性： L-谷氨酸脫氫酶，谷氨酸產(chǎn)生菌體內該酶的酶活性都很強， - 酮戊二酸易生成谷氨酸。 該反應的關鍵是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián)l 產(chǎn)生菌體內乙醛酸循環(huán)（DCA）的關鍵酶異檸檬酸裂解酶：該酶是

44、一種調節(jié)酶，或稱為別構酶，其活性可以通過某種方式進行調節(jié)，通過該酶酶活性的調節(jié)來實現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉，DCA 循環(huán)的封閉是實現(xiàn)谷氨酸發(fā)酵的首要條件。糖的代謝才能沿著- 酮戊二酸的方向進行, 從而有利于谷氨酸的積累。 外在因素l 供氧濃度過量：NADPH的再氧化能力會加強，使-KGA的還原氨基化受到影響，不利于谷氨酸的生成。供氧不足：積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于谷氨酸的產(chǎn)生，同時，一部分葡萄糖轉成了乳酸，影響了糖酸轉化率，降低了產(chǎn)物的提出率。因此當供氧量合適的時候，才有助于谷氨酸的合成，過多或多少都不利于谷氨酸的合成。l NH4+濃度： 影響到發(fā)酵液的pH值 與產(chǎn)物的形成有關：N

45、H4+過量，菌體增殖階段會抑制菌體生長，產(chǎn)酸階段 Glu會受谷氨酰胺合成酶作用轉化為谷氨酰胺（ Gln） NH4+不足，不利于 -KGA的還原氨基化， -酮戊二酸積累，引起反饋調 節(jié)。 l 磷酸鹽過量： 促進EMP途徑，打破EMP與TCA之間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等； 產(chǎn)生并積累纈氨酸（ Val） 因此，在發(fā)酵過程中,要嚴格控制NH4+ 和磷酸鹽的含量 。l 發(fā)酵液的碳氮比 ：發(fā)酵液中糖含量與谷氨酸的發(fā)酵有密切的關系。在一定范圍內, 谷氨酸的產(chǎn)量隨糖含量的增加而增加, 但糖含量過高, 滲透壓過大, 對菌體生長不利, 谷氨酸對糖的轉化率低。l 生物素：當生物素過量時,菌體生長繁殖快,谷氨酸

46、合成途徑受阻,發(fā)酵液中由菌種細胞排出的谷氨酸僅能占氨基酸總量的12%；生物素適量時,菌體代謝失調,細胞膜通透性增強,細胞內的谷氨酸能及時排出,有利于谷氨酸的積累。 因此,要根據(jù)發(fā)酵時期來控制生物素的含量。l 發(fā)酵溫度 ：谷氨酸發(fā)酵前期應采取菌體生長最適溫度,即3032 。 溫度過低, 菌體生長繁殖慢;若溫度過高,菌體易衰老, 生產(chǎn)中表現(xiàn)為O D值增長慢, 耗糖慢, pH值高, 最終發(fā)酵周期長,產(chǎn)酸少。 發(fā)酵中、后期菌體生長基本停止, 為積累大量谷氨酸, 應適當提高發(fā)酵溫度,但溫度過高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。 l pH值 ：pH值影響谷氨酸產(chǎn)生菌的生長 pH：前期pH（7.5-8.0），中后

47、期pH7.0-7.6。通過采用流加尿素，氨水或液氨等辦法調節(jié)pH，補充氮源。 l 泡沫 ：谷氨酸發(fā)酵是好氣性發(fā)酵, 因通風和攪拌產(chǎn)生泡沫是正常的, 但泡沫過多會帶來一系列問題: (1) 泡沫形成泡蓋時, 代謝產(chǎn)生的氣體不能及時排出,妨礙菌體呼吸作用,影響菌體的正常代謝; (2) 泡沫過多, 發(fā)酵液會外溢,造成浪費和污染; (3) 泡沫過多,易沖上罐頂,造成染菌。因此,在谷氨酸的發(fā)酵過程中控制好過多的泡沫是發(fā)酵成敗的關鍵。 （也就是說谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征 ：-酮戊二酸氧化能力微弱:；-酮戊二酸脫氫酶喪失或活性低；谷氨酸脫氫酶活性強；還原性輔酶(NADPH+H+)進入呼吸鏈能力缺陷或微弱；異檸檬

48、酸裂解酶活力微弱；不利用谷氨酸；耐高糖耐高谷氨酸 ；CO2固定能力強； 解除谷氨酸反饋抑制；具有向胞外分泌谷氨酸的能力.） 基因組信息：谷氨酸棒桿菌的碳代謝及氨基酸合成系統(tǒng)構建 ：l 糖吸收 ：PTS系統(tǒng)：葡萄糖、果糖、甘露糖以及蔗糖 果糖攝取的PTS系統(tǒng)相關基因： ptsI-cg2118-pfkB-ptsF-ptsH 葡萄糖、甘露糖、蔗糖相關基因：ptsG、ptsM、ptsSl 碳源的中心代謝系統(tǒng) ：l 基因成簇：如：gap-pgk-tpippc, aceA-aceB 或 sdhC-sdhA-sdhB l 含多種同工酶 l 含有功能未知酶：如：cg0441和cg0790（假設的硫鋅酰胺脫氫酶

49、，cg0949和cg0798（檸檬酸鹽合成酶） 生物合成及轉運代謝系統(tǒng)的重建 對于利用天冬氨酸鹽或丙酮酸鹽過量生產(chǎn)L-氨基酸和維生素具有重要作用 。 （進行基因組操作來提高谷氨酸的產(chǎn)量：a. 單基因敲除 ：失去ODHC（酮戊二酸脫氫酶復合體）活性； 無需誘導劑便可產(chǎn)生L-谷氨酸 ；存在誘導劑時產(chǎn)量可增加10% ；通過改變代謝流來增加L-谷氨酸產(chǎn)量 。b. 雙基因敲除 ：dtsR1 和 pyc的敲除抑制菌體生長，但可使菌體在無誘導劑的條件下產(chǎn)L-谷氨酸 ；加入生物素，雙突變菌株L-谷氨酸產(chǎn)量較野生型提高13.1% ；加入吐溫40，雙突變菌株L-谷氨酸產(chǎn)量較野生型提高9.8% -吐溫40可通過抑制

50、DstR活性使脂肪酸合成降低，進而提高谷氨酸產(chǎn)量。dtsR1 或 pyc 敲除后PEPC活性提高 通過PEPC活性的提高來彌補dtsR1 或 pyc敲除對TCA的損傷。c. 引入外源基因 ：C. glutamicum ATCC14067 (pJCtacvgb)具有較高的氧吸收率，VHb蛋白提高了重組菌的呼吸效率。 發(fā)酵罐發(fā)酵： 產(chǎn)量提高22%；搖瓶培養(yǎng)： L-谷氨酸的產(chǎn)量提高23%，菌體量提高30% 。）轉錄組信息：l 調控蛋白（ regulators）：C. glutamicum：158個調控蛋白（ 128個DNA結合轉錄調控因子, 13個TCS應答蛋白，10個其它調控蛋白以及7個因子），占

51、蛋白編碼基因的5.3% 。 DNA結合轉錄調控因子 ：大部分與DNA結合的轉錄調控因子是HTH模體，依 據(jù)氨基酸序列相似性可分為29個蛋白家族，大部分都參與負調控，抑制可能 是C. glutamicum 主要調控方式。 雙組份調控中的應答調控蛋白 ：這些雙組份系統(tǒng)在感受傳遞外界信號、調控 細胞生理活動過程中具重要作用 其它調控基因 ：主要包括：DnaA, CspA, IHF , PhoU, WhiA, LytR以及PyrR 家族，這些蛋白高度保守，如 PyrR在多種細菌中通過與靶基因mRNA上特異 性序列的結合調控嘧啶核苷酸合成基因的表達。 因子 ：主要包括：其中SigH在熱和氧的壓力調控中具

52、有重要作用，它調 控SigB、WhcE、HspR、ClgR 等基因的表達以及伴侶蛋白的水解 l 轉錄調控實例：全局轉錄調節(jié)子GlxR GlxR: cAMP-感應蛋白 ；Crp-Fnr 超家族 ；雙調節(jié)子 ；調控150個基因 ；所有棒桿菌中保守 。參與調控： 芳香化合物的降解 ；有氧及無氧呼吸 ；糖的吸收、酵解及再生 ；谷氨酸鹽的吸收及氮的同化 ；醋酸鹽、乳酸鹽、葡萄糖酸鹽、乙醇代謝 ；脂肪酸和脫氧核糖核酸的合成 ；細胞的壓力應答及復蘇 。因此會影響谷氨酸的生物合成，可以改變適當?shù)臈l件來提高谷氨酸的產(chǎn)量。谷氨酸棒桿菌對環(huán)境響應 ：l 谷氨酸棒桿菌的熱激調控網(wǎng)絡極為復雜，它不僅上調dnaK、grp

53、E、dnaJ、groES、groEL等分子伴侶編碼基因和hsp的表達，還上調或下調300個基因的表達。 l 谷氨酸棒桿菌中還存在對滲透壓的信號感知系統(tǒng) MtrAB系統(tǒng)，來感應滲透壓并傳遞信號，調控胞內基因的表達。MtrAB系統(tǒng)作用：調控細胞壁的合成以及維持高滲環(huán)境下細胞內外滲透壓的平衡。谷氨酸棒桿菌耐受高滲透壓機制：當外界的滲透壓較高時，胞內大量的水分流出，使胞內溶質的濃度升高，這種升高的信號會被MtrB識別，并活化MtrA，啟動betP的表達， BetP則會啟動細胞相容性物質甜菜堿的轉運。 l ROS(reactive oxygen species)是微生物在有氧代謝中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，過量的R

54、OS會導致氧脅迫和細胞損傷。為了保護微生物免受ROS的損害，微生物在進化過程中形成了一系列的抗氧化系統(tǒng)。l 谷氨酸棒桿菌對冷的應答 l 谷氨酸棒桿菌對酸的應答 ：在中性或低pH時，谷氨酸棒桿菌會因氧化脅迫而受損，氧化脅迫的存在會干擾鐵離子的活性，調控谷氨酸棒桿菌的代謝。 在酸性條件下半胱氨酸的積累會抑制谷氨酸棒桿菌的生長 。谷氨酸棒桿菌對pH的應答是個復雜的過程，它與氧化脅迫、鐵離子平衡以及新陳代謝相聯(lián)系。 16、 什么是多位點序列分型技術，簡述其在乳酸菌中的應用。多位點序列分型技術（MLST）： 是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，通過PCR擴增610個管家基因內部400600bp核苷酸序

55、列，測定其序列，分析菌株的變異，從而進行分型。與傳統(tǒng)分子生物學分型方法相比，MLST操作簡單，具有更高的分辨力，能將同種細菌分為更多的亞型，并確定不同序列型之間的系統(tǒng)發(fā)育關系以及與疾病的聯(lián)系。隨著測序速度的加快和成本的降低，以及分析軟件的發(fā)展，MLST逐漸成為細菌的常規(guī)分型方法。多位點序列分型技術在乳酸菌中的應用：通過比較ST可以發(fā)現(xiàn)菌株的相關性，即密切相關菌株具有相同的ST或僅有極個別基因位點不同的ST，而不相關菌株的ST至少有3個或3個以上基因位點不同。對于已有的成熟MLST方案的細菌，可直接從MLST數(shù)據(jù)庫中獲取分型方案。乳酸菌種間同源性較高，部分種或亞種的分類學地位模糊不清，常規(guī)分類技

56、術常常很難區(qū)分其近緣種或亞種，多位點序列分型技術在細菌分類鑒定中存在明顯優(yōu)勢，近些年開始應用于乳酸菌分類鑒定中。17、 簡述乳酸菌基因組的特點.乳酸菌基因組的特點 ：l 基因數(shù)目差異大：不同乳酸菌種之間基因數(shù)目從1600到3000個不等，基因數(shù)差異大，表明乳酸菌處于一個動態(tài)的進化過程之中，大量的基因發(fā)生丟失、重復或者獲得新的基因。原因可能是乳酸菌通常生活在豐富的營養(yǎng)環(huán)境中,能夠直接攝取生長所需要的營養(yǎng)物質，進而促使基因組簡化和退化，尤其是糖代謝、攝取和發(fā)酵相關的基因的衰退。l 基因組中都含有假基因 ：所有的乳酸菌都含有假基因且數(shù)目變化很大，如在腸膜明串珠菌中20個，嗜熱鏈球菌含有200個假基因

57、。假基因數(shù)目的差異表明乳酸菌基因組處于一個活躍的退化過程。 l 基因組中有很多插入序列 ：乳酸菌基因組中中含有轉座因子插入序列(IS)，大小一般在750-2500bp，數(shù)量由格氏乳桿菌基因組的0.2%到乳酸乳球菌乳脂亞種的5%，說明這些菌有較高的遺傳可塑性。 18、 簡述羊毛硫細菌素的生物合成基因簇的組成及生物合成過程。羊毛硫細菌素的生物合成基因簇的組成：參與羊毛硫細菌素合成的基因一般位于一個基因簇中，簇中基因一般包括羊毛硫細菌素結構基因，修飾基因，轉運加工蛋白基因、免疫蛋白基因及調控蛋白基因。 羊毛硫細菌素的生物合成過程：結構基因(LanA)首先通過核糖體合成前體分子（包括N端的前導序列和C端的原肽區(qū)）；再經(jīng)過修飾基因產(chǎn)物(LanBC/LanM）翻譯后修飾；在前導肽以及加工轉運蛋白（LanP/T）的作用下轉運到細胞膜以及對前導肽進行切除；將最終形